崔樹茂，趙建新，陳衛(wèi)，張灝

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

乳酸菌代謝保護劑中糖產(chǎn)酸對冷凍保護的影響

崔樹茂，趙建新，陳衛(wèi)，張灝*

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

真空冷凍干燥是乳酸菌菌粉制備的關(guān)鍵技術(shù)手段，在凍干前須將菌泥與保護劑混勻并進行預(yù)凍。文中系統(tǒng)研究了菌泥與保護劑混勻過程中的代謝產(chǎn)酸情況，及產(chǎn)酸引起的pH值降低對預(yù)凍的影響。測定了不同菌泥添加保護劑后在室溫和冷藏溫度下的產(chǎn)酸速率，以及不同pH值下冷凍后菌株的存活率，分析了不同pH值條件下冷凍對菌株ATP酶、β-半乳糖苷酶、乳酸脫氫酶及細(xì)胞膜完整性和流動性的影響。結(jié)果表明，菌泥與保護劑混合后，室溫環(huán)境下的產(chǎn)酸速率很快，可在短時間內(nèi)將菌懸液的pH值降至4.0。而pH值降低確實會對冷凍菌株的存活產(chǎn)生影響，pH值在降至4.0時，菌株冷凍存活率顯著降低。低pH值條件下的冷凍，會損傷ATP酶、β-半乳糖苷酶及降低細(xì)胞膜的流動性，是導(dǎo)致冷凍存活率降低的原因。因此，為提高真空冷凍干燥的菌株存活率，首先須控制菌泥與保護劑混合時的溫度和時間，確保預(yù)凍階段乳酸菌無損失。

乳酸菌；產(chǎn)酸速率；存活率；酶

乳酸菌能夠發(fā)酵糖類產(chǎn)酸，具有優(yōu)良的發(fā)酵性能，賦予發(fā)酵食品特有的風(fēng)味和品質(zhì)，被廣泛地應(yīng)用到發(fā)酵乳制品[1]，發(fā)酵果蔬[2]，發(fā)酵香腸[3]等。同時乳酸菌也是一種益生菌，具有改善腸胃，治療便秘，拮抗腸炎，提高免疫等功能性[4-6]。發(fā)酵食品的乳酸菌發(fā)酵劑、益生菌片劑、動物飼料乳酸菌添加劑、乳酸菌活性飲料等乳酸菌制品深受廣大消費者的喜愛。

為了便于運輸和保藏，以及后期產(chǎn)品的加工利用，乳酸菌的生產(chǎn)通常以菌粉的形式呈現(xiàn)。而目前最有效地獲得乳酸菌菌粉的技術(shù)是真空冷凍干燥，將菌體預(yù)凍成固體，水分在低溫和低分壓條件下?lián)]發(fā)。但是，直接凍干乳酸菌會對菌體造成嚴(yán)重的機械損傷，并對細(xì)胞膜、酶等造成破壞，殺死細(xì)胞[7]。因此，凍干保護劑的使用是提高乳酸菌凍干存活率的主要手段。蛋白質(zhì)和糖類是主要的保護劑，因其能夠在冷凍過程形成無定形結(jié)構(gòu)，減少細(xì)胞損傷，是提高凍干存活率的先決條件；且糖類能夠通過氫鍵替代穩(wěn)定脂質(zhì)膜和蛋白[8]。脫脂乳、海藻糖、蔗糖是應(yīng)用最廣泛的凍干保護劑。

但是，脫脂乳中的乳糖、海藻糖和蔗糖均能被乳酸菌利用產(chǎn)生有機酸。酸能夠以未解離的分子形式與細(xì)胞膜的磷脂高度互溶，從而通過被動擴散進入細(xì)胞內(nèi)部[9-11]，造成膜電位的耗散，細(xì)胞質(zhì)酸化及細(xì)胞內(nèi)酸根離子積累，對胞內(nèi)關(guān)鍵酶和細(xì)胞膜造成損傷，從而對菌體產(chǎn)生毒害作用[12]。因此在凍干前，保護劑中的糖有可能被乳酸菌代謝產(chǎn)酸，引起菌懸液pH值的降低，從而造成菌體在預(yù)凍時即產(chǎn)生損傷。

本研究的目的是探討凍干前不同乳酸菌在含糖類保護劑中的產(chǎn)酸規(guī)律，探討酸對菌株冷凍存活的影響，為提高乳酸菌的凍干存活率，以及凍干前的準(zhǔn)備工作時提出指導(dǎo)方案。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM 8661，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)CCFM 30，鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)CCFM1107，江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心保藏。

1.1.2 試劑

脫脂乳，上海光明乳業(yè)股份有限公司；海藻糖(純度≥98%)，日本林原；蔗糖，上海國藥集團；MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

GRP-9160型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實驗儀器有限公司；RCBIOS10型冷凍離心機，賽默飛世爾科技公司；FE-20型pH計，梅特勒-托利多集團；SCIENTZ-48型高通量均質(zhì)機，浙江寧波新芝科技有限公司；F-7000型熒光分光光度計，日本日立公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 乳酸菌的活化與培養(yǎng)

從甘油保菌管內(nèi)吸取 200μL乳酸菌菌液，接種到5mLMRS液體培養(yǎng)基中，在各自的最適溫度(植物乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的最適溫度是37 ℃，干酪乳桿菌的最適溫度是42 ℃)條件下活化培養(yǎng)18～24h，重復(fù)上述操作1次得到活化菌液。然后以體積分?jǐn)?shù)5%接種到MRS液體培養(yǎng)基中，置于最適溫度培養(yǎng)。

1.3.2 乳酸菌菌泥的收集

乳酸菌生長至穩(wěn)定期后，在4℃條件下以6 000～8 000g的離心力離心10min。棄上清液，菌泥分別用10g/L的無菌蛋白胨水溶液(pH7.0)，9g/L的無菌生理鹽水(pH7.0)和0.01mol/L的無菌磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline，PBS，pH7.0)洗滌2次。不同溶液洗滌得到菌泥添加與菌泥等質(zhì)量的無菌生理鹽水，振蕩，充分混勻菌體，形成的菌懸液用于后續(xù)實驗，以未洗滌的菌泥作為對照。

1.3.3 保護劑的配制

稱取一定質(zhì)量的脫脂乳，完全溶解于純化水中，配制一定濃度的脫脂乳溶液，105 ℃滅菌10min；然后稱取一定質(zhì)量的蔗糖和海藻糖，分別配制成適宜濃度的蔗糖和海藻糖溶液，115 ℃高溫滅菌20min。滅菌后將脫脂乳溶液和糖溶液按一定比例混合，使其與菌泥混合后，各保護劑成分滿足以下濃度：脫脂乳 120g/L，海藻糖 20g/L，蔗糖 20g/L。所有保護劑溶液均在無菌環(huán)境下調(diào)整pH值至pH7.0。

1.3.4 保護劑溶液中pH值與含酸量的對應(yīng)曲線

取10mL上述已配制好的保護劑溶液添加不同量的乳酸，測定其pH值，以乳酸濃度為橫坐標(biāo)，pH值為縱坐標(biāo)，繪制曲線。

1.3.5 乳酸菌在不同溫度下的產(chǎn)酸速率

不同保護劑溶液中分別添加不同量的菌泥，除了滿足上述各保護劑成分的濃度，使植物乳桿菌、干酪乳桿菌和鼠李糖乳桿菌的菌泥終濃度分別為1、2、4g/10mL。將菌懸液立即放入冰水(0℃)和室溫[(23±2)℃]環(huán)境下，每10min取樣，測定菌懸液的pH值和總酸濃度。以時間為橫坐標(biāo)，不同質(zhì)量菌泥在不同時間的產(chǎn)酸量為縱坐標(biāo)，線性擬合得斜率為不同質(zhì)量菌泥單位時間的產(chǎn)酸量；再以菌泥質(zhì)量為橫坐標(biāo)，不同質(zhì)量菌泥單位時間的產(chǎn)酸量為縱坐標(biāo)，線性擬合得斜率為乳酸菌單位質(zhì)量單位時間的產(chǎn)酸量，即為單位質(zhì)量的產(chǎn)酸速率。

pH值的測定：FE-20型型酸度計直接測定。

可滴定總酸度(乳酸)：直接酸堿滴定法，以乳酸計。

1.3.6 乳酸菌在不同pH值的冷凍存活

按1.3.5的菌泥終濃度將乳酸菌菌泥與保護劑溶液混勻后，調(diào)節(jié)pH值為pH7.0，然后在室溫環(huán)境下靜置，在pH值分別降至pH7.0、6.0、5.0、4.0時取樣測定菌株的存活率，其余樣品立即放入液氮中冷凍。冷凍4h后解凍，測定不同pH條件下冷凍后菌懸液的活菌濃度。計數(shù)采用平板菌落計數(shù)法。

式中：NA，不同pH值條件下冷凍前后的活菌濃度，CFU/mL；NB，冷凍前pH值為7.0時的活菌濃度，CFU/mL。

1.3.7 無細(xì)胞提取物的制備

冷凍后的樣品在室溫條件下解凍后離心，上清液用于胞外β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶的測定。菌泥用無菌蒸餾水洗滌2次，然后用無菌蒸餾水重懸至冷凍前體積。以體積比1∶1.5添加玻璃珠(直徑0.1 mm)，在高通量均質(zhì)機中研磨1 min，冰浴5 min，循環(huán)10次后離心，上清液用于測定總蛋白(蛋白測定采用上海碧云天P0011型BCA試劑盒測定)、ATP酶、胞內(nèi)β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶。

1.3.8 ATP酶的測定

ATP酶采用南京建成的A016-1型的ATP酶試劑盒按照說明書測定。酶活定義：每分鐘每克蛋白質(zhì)分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機磷的量為1個ATP酶活力單位。即1 U= 1μmolPi/(g·min)。

1.3.9 β-半乳糖苷酶的測定

β-半乳糖苷酶能夠催化分解鄰硝基苯-β-D-半乳糖苷(o-nitrophenyl-β-d-galactoside，oNPG)生成鄰硝基苯(o-nitrophenyl，oNP)和半乳糖，該酶的測定采用BHOWMIK描述的方法[13]。酶活定義：每分鐘每克蛋白質(zhì)分解oNPG生成1 μmoloNP的量為1個β-半乳糖苷酶活力單位。即1 U= 1μmoloNP/(g·min)。

1.3.10 乳酸脫氫酶的測定

乳酸脫氫酶能夠?qū)⒈徇€原成乳酸，在此過程中降低還原型輔酶(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH)在340 nm處的吸收。該酶的測定按照BERGMEYER和BERNT在1974年提出的經(jīng)典方法進行[14]。酶活定義：每分鐘每克蛋白質(zhì)降低1個吸收值，為1個乳酸脫氫酶活力單位。即1 U= 1 μE/(g·min)。

1.3.11 細(xì)胞膜流動性的測定

熒光各異性被用來描述細(xì)胞膜的流動性，其測定按照LOUESDON描述的方法進行[15]。熒光偏振(P)、各向異性(r)和微黏度(η)用來評價膜流動性的高低，他們根據(jù)LI的方法進行估算[16]。P，r，η越高表示膜的流動性越低。

1.3.12 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗中不同組(>3)之間的顯著性差異通過SPSS 16.0軟件進行ANOVA判斷(Tukey’s檢驗)，P<0.05則認(rèn)為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溶液洗滌對產(chǎn)酸速率的影響

乳酸菌在培養(yǎng)至穩(wěn)定期時，胞內(nèi)會積累大量的有機酸，如果不洗滌菌泥，添加保護劑后菌泥中的酸會使菌懸液的pH值降低。經(jīng)測定，植物乳桿菌CCFM8610、干酪乳桿菌CCFM30及鼠李糖乳桿菌CCFM1107的濕菌泥含酸量分別為：0.217 mmol/g，0.159 mmol/g和0.152 mmol/g。圖1顯示，10 mL保護劑溶液中添加2 g以上的濕菌泥即會使菌懸液的pH值降至pH 5.5以下。因此，離心收集后的濕菌泥需要中性溶液進行洗滌，去除胞內(nèi)殘留的乳酸。

圖1 保護劑溶液中pH值與乳酸含量的對應(yīng)曲線Fig.1 The corresponding curves of pH and lactic acid content in the solution of protective agent

中性的生理鹽水、PBS(pH 7.0，0.01 mol/L)水及10 g/L的蛋白胨水溶液被廣泛地用于菌泥的洗滌，均能達(dá)到去除菌泥中酸殘留的效果。表1展示了不同溶液洗滌后菌泥的產(chǎn)酸速率，以未洗滌的菌泥為對照。結(jié)果表明，不同溶液洗滌的菌泥產(chǎn)酸速率與未洗滌的菌泥產(chǎn)酸速率無顯著差異，洗滌以及洗滌溶液并不會對菌泥產(chǎn)酸速率產(chǎn)生影響。生理鹽水成本低，配制簡單，因此后續(xù)試驗均采用中性的生理鹽水作為菌泥的洗滌劑。

表1 菌泥經(jīng)不同溶液洗滌后在不同溫度下的產(chǎn)酸速率 單位：mmol/(g·min)

2.2 不同溫度對產(chǎn)酸速率的影響

乳酸菌代謝保護劑中糖產(chǎn)酸是一系列的酶促反應(yīng)過程，酶的作用受到溫度的影響。從表1可以看出，在室溫環(huán)境下乳酸菌的產(chǎn)酸速率明顯高于冷藏溫度。且在室溫環(huán)境時，不同的乳酸菌產(chǎn)酸速率不同，植物乳桿菌產(chǎn)酸最快，其次是干酪乳桿菌，鼠李糖乳桿菌產(chǎn)酸速率低于其他2株菌。在冷藏溫度時，酶系反應(yīng)基本被抑制，3株乳酸菌的產(chǎn)酸速率均很低，且無明顯差異。

在乳酸菌的凍干菌粉生產(chǎn)過程中，菌泥洗滌后通常在室溫環(huán)境下添加保護劑，振蕩或攪拌混勻后，將菌體與保護劑充分混勻后移至凍干機進行預(yù)凍。從添加保護劑至溫度降至樣品凍結(jié)，這一過程通常需要1～2 h，甚至更長。結(jié)合表1和圖1可知，10 mL保護劑溶液中添加2 g濕菌泥，30 min即可將菌懸液的pH值降至pH 4.0左右。

2.3 產(chǎn)酸引起的pH值降低對冷凍存活率的影響

室溫條件下，菌泥會快速代謝保護劑中的糖類產(chǎn)酸，使菌懸液的pH值降低。雖然菌懸液中菌的存活率并沒有伴隨著pH值的降低而降低(數(shù)據(jù)未列出)，但是pH值的降低卻對冷凍后的存活率產(chǎn)生影響。圖2顯示，3株乳酸菌在pH值降到pH4.0時，冷凍后的存活率顯著地降低。pH值高于pH5.0時，冷凍后的存活率沒有顯著變化。因此，為了確保后續(xù)凍干的存活率，菌泥與保護劑混合過程中，要避免pH值的過度降低?？刂凭嗯c保護劑的混合溫度是必要的，使其盡可能地保持低溫，且混勻時間盡可能短，確保菌株不因產(chǎn)酸而在預(yù)凍過程中即產(chǎn)生損傷。

圖2 pH值對冷凍存活率的影響Fig.2 Effect of pH on survival rate of Lactobacillus during freezing注：標(biāo)有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05

2.4 產(chǎn)酸引起的pH值降低對冷凍細(xì)胞ATP酶的影響

ATP酶是乳酸菌細(xì)胞膜上維持細(xì)胞正常生理功能的重要酶系。Na+K+-ATP酶鑲嵌在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中，能夠催化ATP水解供能，驅(qū)動Na+和 K+于細(xì)胞膜兩側(cè)的對向運輸，維持著細(xì)胞膜兩側(cè)的膜電位、調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，為營養(yǎng)物質(zhì)的吸收提供動力等方面起著重要作用[17]。Ca2+Mg2+-ATP酶是乳酸菌調(diào)節(jié)細(xì)胞Ca2+和Mg2+的濃度的另一種重要的膜酶。從圖3和圖4可以看出，pH值對冷凍后ATP酶活的影響與存活率一致，在pH值降至5.0以后，Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶均出現(xiàn)顯著的降低。說明pH值的降低，加重冷凍對乳酸菌ATP酶的損傷，ATP酶的破壞是導(dǎo)致存活率降低的原因之一。

圖3 冷凍過程中pH值對乳酸菌Na+K+-ATP酶的影響Fig.3 Effect of pH on Na+K+-ATP of Lactobacillus during freezing注：標(biāo)有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05。

圖4 冷凍過程中pH值對乳酸菌Ca2+Mg2+-ATP酶的影響Fig.4 Effect of pH on Ca2+Mg2+-ATP of Lactobacillus during freezing注：標(biāo)有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05

2.5 產(chǎn)酸引起的pH值降低對冷凍細(xì)胞β-半乳糖苷酶的影響

β-半乳糖苷酶是乳酸菌分解乳糖的重要酶，該酶的活性直接影響乳酸菌的代謝能力。圖5顯示，干酪乳桿菌CCFM 30和鼠李糖乳桿菌CCFM 1107在pH值降至pH4.0時，冷凍后β-半乳糖苷酶的活性顯著降低。而植物乳桿菌CCFM 8610在pH值降至pH6.0時，冷凍后β-半乳糖苷酶的活性即顯著降低，但此時存活率并未受影響；在pH值降至pH4.0時，β-半乳糖苷酶的活性出現(xiàn)更顯著的降低。說明pH值的降低，會加重冷凍對乳酸菌β-半乳糖苷酶的損傷，該酶活性降低至一定程度后，會影響菌株的存活。

圖5 冷凍過程中pH值對乳酸菌β-半乳糖苷酶的影響Fig.5 Effect of pH on β-galactosidase of Lactobacillus during freezing注：標(biāo)有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05

2.6 產(chǎn)酸引起的pH值降低對冷凍細(xì)胞乳酸脫氫酶的影響

乳酸脫氫酶是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶，在該途徑的最后一步將丙酮酸還原成乳酸，該酶活力大小直接影響菌株的代謝能力，更會影響菌株的存活。圖6顯示，伴隨著pH值的降低，乳酸脫氫酶在冷凍后酶活升高，且在pH值降至pH 5.0以下時，乳酸脫氫酶酶活顯著上升。此現(xiàn)象歸因于乳酸菌遇到酸脅迫時的自我保護機制[18-19]。此結(jié)果表明pH值的降低不會導(dǎo)致冷凍對乳酸菌乳酸脫氫酶的破壞，在低pH值時冷凍存活率的降低與乳酸脫氫酶沒有關(guān)系。

圖6 冷凍過程中pH值對乳酸菌乳酸脫氫酶的影響Fig.6 Effect of pH on LDH of Lactobacillus during freezing(注：標(biāo)有不同字母表示酶活在不同pH具有顯著性差異，P<0.05)

2.7 產(chǎn)酸引起的pH值降低對冷凍細(xì)胞膜完整性和流動性的影響

β-半乳糖苷酶和乳酸脫氫酶均是胞內(nèi)酶，只有膜的完整性遭到破壞時兩種酶才會泄漏到胞外。在該實驗中，任何條件下的胞外液體均未檢測到兩種酶的存在。說明膜的完整性良好，即使pH值降低，冷凍亦未對乳酸菌的細(xì)胞膜產(chǎn)生破壞。

但是膜的流動性卻因pH值的降低而產(chǎn)生影響，表2中可以看出，3株乳酸菌在pH值降至pH 4.0時，冷凍后細(xì)胞膜的熒光偏振(P)、各向異性(r)和微黏度(η)均顯著升高，表明膜的流動性降低。細(xì)胞膜流動性的降低是乳酸菌在凍干過程存活率降低的主要因素之一[16]。結(jié)果表明，pH值的降低導(dǎo)致冷凍對細(xì)胞膜的流動性產(chǎn)生破壞，從而影響了菌株的冷凍存活率。

表2 pH值對細(xì)胞膜熒光偏振、各向異性及微黏度的影響

注：a,b表示數(shù)值間具有顯著性差異，p<0.05。

3 結(jié)論

(1)乳酸菌添加凍干保護劑后，室溫環(huán)境下可代謝保護劑中糖類產(chǎn)酸，2 g/10 mL的菌泥濃度，可使菌懸液的pH值在30 min內(nèi)降至pH 4.0左右。

(2)中性的生理鹽水、PBS(pH 7.0，0.01mol/L)水及10 g/L的蛋白胨水溶液洗滌菌泥后，菌的產(chǎn)酸速率沒有區(qū)別。

(3)pH值降至pH 4.0時，冷凍后乳酸菌的存活率顯著降低。

(4)低pH值條件下乳酸菌冷凍存活率的降低歸因于Na+K+-ATP酶，Ca2+Mg2+-ATP酶，β-半乳糖苷酶的損傷以及細(xì)胞膜流動性的降低，與乳酸脫氫酶和細(xì)胞膜的完整性無關(guān)。

(5)為了提高乳酸菌的凍干存活率，須確保預(yù)凍階段菌的存活，因此須控制菌泥與保護劑混合時的溫度及時間，避免乳酸菌代謝保護劑中糖大量產(chǎn)酸。

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Effect of acids produced by metabolizing carbohydrate of protectants on viability ofLactobacillusduring freezing

CUI Shu-mao, ZHAO Jian-xin, CHEN Wei, ZHANG Hao*

(School of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

Vacuum freeze-drying is the key technology for preparingLactobacilluspowder. It is significant for cell pastes to be mixed with protectants before freeze drying. In this paper, the acid production rate in the mixing processing of cell pastes and protectants, and the effect of pH decrease caused by acid production on viability ofLactobacillusduring freezing, were studied. The rate of acid production at room temperature and cold storage temperature, as well as the survival rate ofLactobacillusat different pH value after freezing, were determined. In addition, ATPase, β-galactosidase, lactate dehydrogenase (LDH), and cell membrane integrity and fluidity ofLactobacillusafter freezing at different pH were measured. The results showed that the rate of acid production at room temperature was very fast, which could reduce the pH of the bacterial suspension to 4.0 in a short time after mixed with protectants. The low pH indeed decreased the survival rate of frozen strains, which was significantly reduced at pH 4.0. The damage of ATP enzyme and β-galactosidase, and the reduction of the fluidity of cell membrane caused by freezing under low pH could result in the low survival rate. Therefore, the temperature and time for mixing cell pastes with protectants must be controlled to avoid loss of lactic acid bacteria in pre-freezing stage in order to improve the survival rate during vacuum freeze drying.

Lactobacillus; acid production rate; survival rate; enzyme

博士研究生(張灝教授為通訊作者,E-mail:zhanghao@jiangnan.edu.cn)。

十二五國家科技支撐項目：發(fā)酵乳制品乳酸菌菌種與發(fā)酵劑的研究與開發(fā)

2016-06-08，改回日期：2016-08-04

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201703004