孫大慶+孫慧葉+魏玉龍

摘 要：蠟樣芽孢桿菌是乳制品中容易污染的一種致病菌。為了鑒定市售牛奶中是否含有蠟樣芽孢桿菌，該研究通過生化和分子生物學(xué)鑒定方法對牛奶中蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行了分離和鑒定。結(jié)果表明，市售牛乳中分離、鑒定了一株蠟樣芽胞桿菌，這表明蠟樣芽胞桿菌對牛奶產(chǎn)品具有較大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：牛奶；蠟樣芽孢桿菌；安全風(fēng)險(xiǎn)

中圖分類號(hào) TS252.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）07-0039-02

Abstract：Bacillus cereus is a pathogen that is easily contaminated in dairy products.In order to identify whether the commercially available milk contains Bacillus cereus，this study isolated and identified Bacillus cereus in milk by biochemical and molecular biology identification methods. The results show that a strain of Bacillus cereus was isolated and identified in the separation of the commercially available milk，indicating that Bacillus cereus has a greater safety risk for milk products.

Key words：Milk；Bacillus cereus；Safety risk

蠟樣芽孢桿菌是一種好氧、產(chǎn)芽孢的革蘭氏陽性桿菌，可產(chǎn)生致吐和致腹瀉腸毒素，前者耐熱，是引起食物中毒的主要成分[1]。芽孢是蠟樣芽孢桿菌主要的繁殖方式，有些菌種能粘附在人的上皮細(xì)胞上，它們的致病機(jī)制有所不同[2]。目前我國還沒有對由蠟狀芽孢桿菌引起的食物中毒進(jìn)行比較系統(tǒng)的調(diào)查、分析和統(tǒng)計(jì)，但是從我國的飲食結(jié)構(gòu)、食品加工、保藏和運(yùn)輸條件等方面推測，蠟狀芽孢桿菌的食品污染情況可能比較嚴(yán)重，尤其是營養(yǎng)豐富的乳制品[3-4]。因此，從食品安全的角度來看，很有必要對我國乳制品中蠟狀芽孢桿菌的檢出率、分布情況和毒素產(chǎn)生的情況進(jìn)行調(diào)查，以查明污染途徑、污染源，制訂相應(yīng)的檢測標(biāo)準(zhǔn)和衛(wèi)生安全標(biāo)準(zhǔn)，提供消毒和殺菌的指導(dǎo)，并為應(yīng)對可能出現(xiàn)的突發(fā)食物中毒事件提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 10個(gè)不同品牌的純牛奶，購自超市。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 檸檬酸鹽、甘露醇等發(fā)酵生化管，LB肉湯、營養(yǎng)瓊脂和甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂培養(yǎng)基均購自青島海博生物有限公司；PCR Taq酶、瓊脂糖購自上海生工生物工程有限公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.3 引物 檢測菌株16S rDNA擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引

物27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：TACGGCTACCTTGTTACG，由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 蠟樣芽胞桿菌分離和純化 取樣品牛奶25mL于無菌燒杯中，用接菌環(huán)取樣劃線分離于選擇性培養(yǎng)基上，置于37℃培養(yǎng)12～20h，挑取可疑的菌株接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)18～24h。從單菌落分布均勻的平板中挑取單菌落再進(jìn)行平板劃線，進(jìn)行菌種純化。

1.5 鏡檢 取營養(yǎng)瓊脂上純培養(yǎng)物少許，進(jìn)行革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，之后鏡檢觀察結(jié)果。

1.6 分離菌株生化鑒定

1.6.1 淀粉水解試驗(yàn) 將分離株接種于3%可溶性淀粉試管中，在37℃培養(yǎng)24h。取出試管，在菌落處滴加碘液少許，觀察。培養(yǎng)基呈深藍(lán)色，說明淀粉未被水解，即淀粉酶陰性。能水解淀粉的細(xì)菌其菌落周圍有透明的環(huán)。

1.6.2 明膠液化試驗(yàn) 用接種環(huán)挑取分離株于明膠鑒定管中，37℃培養(yǎng)48～72h，將其倒置，觀察有無液體流動(dòng)，有流動(dòng)為陽性，無流動(dòng)為陰性，夏天應(yīng)置4℃，10min后觀察結(jié)果。

1.6.3 V-P試驗(yàn) 將分離株接種于V-P鑒定管中，37℃培養(yǎng)24～48h，變?yōu)榧t色則為陽性，陰性不變色。

1.6.4 檸檬酸鹽分解試驗(yàn) 將分離株劃線接種于西蒙氏檸檬酸鹽斜面培養(yǎng)基上，37℃，培養(yǎng)48～72h，每天觀察結(jié)果，陽性者斜面上有菌落生長，培養(yǎng)基由綠色轉(zhuǎn)為藍(lán)色，反之為陰性。

1.6.5 卵黃反應(yīng) 將分離株接種于卵黃試管中，置37℃培養(yǎng)18～24h，陽性反應(yīng)卵黃顏色變淺，陰性無明顯變化。

1.6.6 甘露醇發(fā)酵試驗(yàn) 將分離株接種至甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)18～24h，陽性反應(yīng)能發(fā)酵產(chǎn)酸，培養(yǎng)基變?yōu)辄S色，陰性不變色。

1.6.7 過氧化氫酶試驗(yàn) 將分離株接種于過氧化氫溶生化管中，觀察結(jié)果，若30s內(nèi)產(chǎn)生氣泡者則為陽性，不產(chǎn)生氣泡者為陰性。

1.6.8 動(dòng)力試驗(yàn) 將分離株穿刺接種于動(dòng)力培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，若擴(kuò)散生長則為陽性反應(yīng)。

1.6.9 葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn) 將分離株接種于葡萄糖生化管中，37℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基變?yōu)辄S色為陽性反應(yīng)。

1.6.10 溶血試驗(yàn) 取分離株接種于血瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h，陽性菌落周圍呈現(xiàn)溶血環(huán)。

1.7 分離菌株16S rDNA鑒定 挑取檢測菌單菌落于500μL的雙蒸餾水中制成菌懸液，100℃水浴10min，立即冰浴20min，12 000r/min離心10min，取上清液作PCR擴(kuò)增模板，-20℃保存?zhèn)溆肹5]。PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3min；95℃變性45s；55℃退火45s；72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7min，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，利用Blast、DNA star軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌體形態(tài) 在顯微鏡下菌體細(xì)胞為桿狀，成短鏈狀排列，菌體兩端鈍圓，生成的芽孢小于菌體橫徑，位于中心或稍偏于一端（圖1）。

2.2 生化鑒定結(jié)果 根據(jù)生化鑒定結(jié)果（表1）可知，分離株生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蠟樣芽孢桿菌預(yù)期完全一致，因此該分離株初步鑒定為蠟樣芽孢桿菌，命名為DQ14-ZC。

2.3 16S rDNA鑒定結(jié)果 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴(kuò)增獲得一條約1.4kb大小的條帶（圖2），與預(yù)期大小相符。經(jīng)BLAST比對分析，該基因序列與GenBank中多個(gè)蠟樣芽孢桿菌16S rDNA基因具有99%以上的一致性，因此該分離株進(jìn)一步鑒定為蠟樣芽孢桿菌。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)從10個(gè)不同品牌的純牛奶中，通過蠟樣芽胞桿菌選擇培養(yǎng)基的分離、純化，鏡檢，以及生理生化和16S rDNA鑒定，這表明可以從市售的純牛奶產(chǎn)品中分離到蠟樣芽胞桿菌，10個(gè)產(chǎn)品中蠟樣芽胞桿菌污染率為10%。由此可見，雖然污染率較低，但仍存在較大的食品安全風(fēng)險(xiǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]Griffiths M W.Toxin production by psychrotrophic Bacillus spp.present in milk[J].Journal of Food Protection，1990，53（9）：790-792.

[2]Andersson A，Granum P E，R?nner U.The adhesion of Bacillus cereus spores to epithelial cells might be an additional virulence mechanism[J].International journal of food microbiology，1998，39（1）：93-99.

[3]殷全喜，張秀紅，杜欣，等.一起蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒的調(diào)查報(bào)告[J].中國預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2006，7（2）：115-117.

[4]蔣建明.一起蠟樣芽孢桿菌污染飲水引起食物中毒調(diào)查[J].浙江預(yù)防醫(yī)學(xué)，2009，21（2）：38-39.

[5]王國利.芽孢桿菌溶血素BL的檢測及B905hblA基因的克隆[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

（責(zé)編：張宏民）