谷青芳 張輝 李艷花 劉春云 王慧卿 肖保國 尉杰忠 馬存根

法舒地爾對EAE小鼠血-腦屏障功能的保護作用及機制研究

谷青芳 張輝 李艷花 劉春云 王慧卿 肖保國 尉杰忠 馬存根

目的 探討法舒地爾(Fasudil)對實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)的血-腦屏障(BBB)保護機制。方法 采用MOG35-55肽段誘導(dǎo)C57BL/6小鼠建立EAE模型，于免疫后第3天起Fasudil組腹腔注射Fasudil〔40 mg/(kg·d)〕干預(yù)，EAE組注射等量生理鹽水，持續(xù)至免疫后第20天。于免疫后第7 d、14 d、21 d采集小鼠腦和脊髓標本，行HE染色、脫髓鞘染色和免疫熒光染色；測定腦和脊髓伊文思藍(EB)的滲透量；采用Western blot法檢測腦內(nèi)細胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達情況。結(jié)果 與EAE組相比，F(xiàn)asudil組小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)炎性細胞計數(shù)和髓鞘脫失面積均明顯減少〔分別98.00±33.15vs. 417.70±78.89，t=3.736，P<0.05；(11.38±1.09)%vs.(38.21±7.94)%，t=3.473，P<0.05〕。在免疫后14 d、21d，F(xiàn)asudil組腦和脊髓內(nèi)EB滲透量均低于EAE組(腦：9.04±0.15vs.9.93±0.25，t=5.776，P<0.05；9.09±0.089vs. 9.83±0.22，t=3.116，P<0.05；脊髓：17.28±0.38vs. 21.33±2.21，t=7.782，P<0.05；16.48±0.71vs. 21.77±0.17，t=7.256，P<0.01)。與EAE組相比，F(xiàn)asudil組小鼠腦內(nèi)細胞緊密連接蛋白Occludin表達上調(diào)(7 d：0.068±0.045vs. 0.127±0.022，t=6.026，P<0.05)，14 d：0.185±0.011vs.0.233±0.014，t=2.609，P<0.05，21 d：0.248±0.021vs.0.364±0.121，t=2.834，P<0.01)和ZO-1(7 d：2.013±0.073vs. 2.404±0.256，t=1.467，P>0.05；14 d：1.783±0.129vs.2.003±0.184,t=2.409，P<0.05；21 d：1.332±0.052vs. 1.674±0.023，t=6.026，P<0.01)。結(jié)論 Fasudil可能通過抑制小鼠腦內(nèi)細胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的下調(diào)而保護BBB的完整性。

法舒地爾；實驗性自身免疫性腦脊髓炎；緊密連接；血-腦屏障

血-腦屏障(blood-brain barrier，BBB)是存在于腦和脊髓內(nèi)的毛細血管與神經(jīng)組織之間的一個調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)內(nèi)環(huán)境的細胞屏障，BBB完整性的破壞導(dǎo)致其通透性改變是多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)發(fā)病的主要機制之一。最近的研究發(fā)現(xiàn)，多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理過程中均Rho/Rho激酶(ROCK)信號通路的激活，引起T淋巴細胞的活化，并使其向中樞神經(jīng)系統(tǒng)遷移，其中BBB功能障礙是MS和EAE發(fā)病過程中的瓶頸事件，因為只有活化的T淋巴細胞通過BBB遷移進入CNS才能導(dǎo)致后續(xù)的免疫攻擊和神經(jīng)損傷的發(fā)生[1]。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)是MS的理想動物模型，現(xiàn)在普遍認為MS和EAE的免疫病理過程相似[2]。鹽酸法舒地爾(Fasudil)是目前臨床上惟一使用的Rho激酶抑制劑，本文試圖通過觀察Fasudil防治EAE的實驗效果，并探討其對小鼠腦內(nèi)緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達的影響及其在保護BBB中的可能機制，為臨床診治MS積累資料。

1 材料和方法

1.1 材料 雌性C57BL/6小鼠(18～22 g、8～10周鼠齡，購自北京維通利華公司)共48只。

小鼠髓鞘堿性蛋白(myelin oligodendrocyte glycoprotein peptides 35-55, MOG35-55)由西安聯(lián)美生物科技有限公司合成；百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)購自ALEXIS公司；完全福氏佐劑 (complete Freund’s adjuvant, CFA) 購自美國Sigma公司；結(jié)核分枝桿菌(tuberculosis bacili，TB)購自美國Becton Dickinson(BD)公司。Bio-RAD凝膠成像分析儀購自美國Bio-RAD公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司；Fasudil(批號為1210221)購自天津紅日藥業(yè)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EAE模型的制備將MOG35-55肽段12 mg溶于2.4 mL生理鹽水中，TB 14.4 mg 懸于2.4 mL CFA中，將兩者等體積充分混合，用注射器反復(fù)推成油包水樣乳白色混懸劑。乙醚麻醉小鼠后，對2組小鼠分別于背部脊柱中線兩側(cè)，皮下四個點注射抗原乳劑0.1 mL/只。記錄免疫當日為免疫后(p.i.) 0 d。于免疫當天和免疫后48 h分別腹腔注射PTX 0.5 mg/只。造模成功的標準為：有EAE臨床癥狀且脊髓病理切片有大量炎性細胞浸潤及髓鞘脫失。免疫后第10天EAE小鼠開始陸續(xù)發(fā)病，第14天進入高峰期，發(fā)病率達100%?；诖藯l件下的EAE模型，造模成功率100%，死亡率0%。

1.2.2 動物分組及免疫： 然后按體重18、19、20、21、22分層隨機分層為EAE對照組(EAE組)和Fasudil干預(yù)組(Fasudil組)，每組各24只。Fasudil組動物免疫后第3 d開始腹腔注射Fasudil(每只每次400 μg /200 μL，2次/d)，EAE組同法給予等量NS作為對照，持續(xù)給藥至免疫后20 d。

1.2.3 動物臨床癥狀評分：采用國際通用的5分制評分法，于免疫后0 d起由2名觀察者以盲法對實驗小鼠隔天定時進行癥狀觀察及評估，其標準如下[3]：無癥狀為0分；尾部肌張力低，輕度步態(tài)笨拙為1分；尾麻痹+一側(cè)后肢肌力中度低，被動翻身可恢復(fù)為2分；尾麻痹+雙后肢癱瘓，被動翻身不能恢復(fù)，為3分；尾+四肢癱瘓為4分；瀕死狀態(tài)為5分。評分介于兩者之間以±0.5 計算。

1.2.4 標本采集：于免疫后第7 d、14 d、21 d三個不同時間點對EAE組和Fasudil組分別隨機選取8只小鼠，以0.3%(質(zhì)量濃度)戊巴比妥鈉(0.2 mL/只)腹腔注射麻醉小鼠。將每組三個不同時間點所取的8只小鼠再隨機分為三個檢測組。

(1)每組選3只小鼠，經(jīng)尾靜脈注射2%(質(zhì)量濃度)伊文思藍(Evans blue，EB)，2 h后處死，完整剝離腦和脊髓，稱重，加甲酰胺溶液后打成勻漿，檢測腦和脊髓中EB滲透量(mg/g)；

(2)每組選2只小鼠于麻醉后用4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛灌注，分離小鼠腦和脊髓并制備10um冰凍切片。①小鼠脊髓炎性細胞浸潤及髓鞘脫失情況檢測：將脊髓冰凍切片水中浸泡2 min，蘇木素染色3 min，水洗1 min，5%(體積分數(shù))鹽酸酒精分化15 s，伊紅染色30 s，梯度酒精脫水各15 s，二甲苯浸潤各15 s，甘油封片后顯微鏡下觀察炎性細胞浸潤情況。取冰凍切片于95%(體積分數(shù))酒精中浸泡3 min，浸于固藍液中，57 ℃孵育24 h，去離子水中浸洗3 min，95%(體積分數(shù))酒精浸洗3 min，切片于0.05%(質(zhì)量濃度)碳酸鋰溶液快速浸洗15 s，70%(體積分數(shù))酒精分化直至白質(zhì)與灰質(zhì)清晰分辨，去離子水沖洗3 min，梯度酒精脫水各2 min，二甲苯透明各2 min。顯微鏡下觀察HE染色炎性細胞核為藍色，脊髓白質(zhì)區(qū)髓鞘脫失部分顏色發(fā)白，用Image-Pro Plus軟件計算小鼠整個脊髓白質(zhì)區(qū)表達的炎性細胞數(shù)目并求其均數(shù)，計算小鼠髓鞘脫失面積與白質(zhì)面積比值并求取平均值。②免疫熒光染色檢測巨噬細胞浸潤及緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達：冰凍切片在室溫下干燥，經(jīng)PBS 洗滌5 min×3次，加入抗大鼠一抗CD68抗體(1∶1000)，兔抗一抗Occludin抗體(1∶1000)和ZO-1抗體(1∶1000)，置4 ℃冰箱過夜。次日PBS洗去一抗，滴加相應(yīng)DyLight555、488熒光標記的抗大鼠的二抗(1∶1000)，室溫孵育2 h，PBS洗滌3次，甘油封片，熒光顯微鏡下觀察Occludin、ZO-1蛋白熒光表達增強，呈綠色特異性；陽性巨噬細胞熒光染色為紅色特異性，用Image-Pro Plus軟件對在整個脊髓中表達的巨噬細胞進行計數(shù)并求取其均數(shù)。

(3)Western blot法檢測緊密連接蛋白表達：各組取剩余3只小鼠，快速冰上取提取腦組織蛋白,Western blot檢測小鼠腦中緊密連接蛋白Occludin、ZO-1蛋白表達量：用組織裂解液在4oC條件下抽提小鼠腦組織蛋白,制備蛋白上樣緩沖液樣品，用10% (質(zhì)量濃度)SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白。加入兔抗一抗Occludin抗體(1∶1000)和ZO-1抗體(1∶1000)、兔抗小鼠磷酸甘油脫氫酶(GAPHD)抗體(1∶1000)，HRP耦聯(lián)的二抗(1∶1000)。使用Bio-RAD凝膠成像分析儀檢測染色條帶顯影強度，如出現(xiàn)條帶即為所用抗體檢測到的相應(yīng)蛋白，用Image Lab3.0軟件檢測蛋白條帶光密度與內(nèi)參GAPDH 的光密度比值表示。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用Graph-Pad Prism 5軟件包進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，小鼠體重及臨床癥狀評分比較采用Two-wayANOVA檢驗，兩組間其他指標的均數(shù)比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床癥狀比較 EAE組小鼠于免疫后9 d相繼開始發(fā)病，小鼠外觀皮毛缺乏光澤，進食少，精神萎靡，體重下降，在免疫后14 d開始出現(xiàn)明顯癥狀，表現(xiàn)有尾麻痹、后肢無力、體重下降, 在免疫后20 d發(fā)展為發(fā)病高峰期,高峰期平均臨床評分為(2.33±0.85)分；呈現(xiàn)不同程度的尾麻痹，后肢無力、繼而向前爬行時劍突以下部分著地，雙后肢拖地；直至發(fā)生肢體癱瘓。Fasudil組未見發(fā)病，臨床癥狀評分為0分，平均體重上升，與EAE組相比較均增高〔14 d：(19.55±0.57)gvs.(17.46±0.18)g，P<0.01，20 d：(21.23±0.38)gvs. (17.30±0.87)g，P<0.01〕。

2.2 兩組小鼠不同時間點腦組織和脊髓中EB滲透量比較 免疫后14 d、21 d Fasudil組小鼠腦內(nèi)、脊髓內(nèi)EB含量均低于EAE組(P<0.05或P<0.001；表1)。

2.3 兩組小鼠脊髓炎性細胞浸潤和髓鞘脫失情況比較 HE染色顯示EAE組小鼠脊髓腰膨大白質(zhì)區(qū)出現(xiàn)大量炎性細胞浸潤，平均計數(shù)為(417.33±78.89)個，高于Fasudil組炎性細胞計數(shù)〔(98.00±

表1 不同時間點兩組小鼠腦組織和脊髓中EB滲透量比較 (mg/g，±s，n=3)

33.15)個，P<0.05〕；髓鞘染色顯示EAE組小鼠出現(xiàn)明顯髓鞘脫失，脫失面積比值為(38.21±7.94)%，F(xiàn)asudil組髓鞘脫失脫失面積比值〔(11.38±1.09)%〕低于EAE組(P<0.05)。CD68免疫熒光染色顯示EAE組小鼠脊髓有大量CD68陽性巨噬細胞浸潤，陽性巨噬細胞計數(shù)為(111.7±27.16)個， Fasudil組炎性反應(yīng)輕，陽性巨噬細胞計數(shù)〔(27.67±7.86)個〕少于EAE組(P<0.05)。具體結(jié)果見表2、圖1。

2.5 兩組緊密連接蛋白表達比較 與EAE組比較，F(xiàn)asudil組小鼠腦內(nèi)細胞緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的表達增加(P<0.05或P<0.01，表3)；免疫熒光染色可見Fasudil組腦內(nèi)緊密連接蛋白Occludin和ZO-1表達的熒光強度均高于EAE組(圖2、3)。進一步采用Western blot檢測蛋白表達，結(jié)果顯示與EAE組相比，F(xiàn)asudi組Occludin和ZO-1蛋白的表達量上調(diào)(均P<0.01)。具體結(jié)果見圖4、5，表3。

表2 兩組小鼠脊髓炎性細胞浸潤和 髓鞘脫失、巨噬細胞浸潤比較

圖1 兩組小鼠脊髓炎性細胞浸潤(HE染色)、髓鞘脫失(脫髓鞘染色)及巨噬細胞浸潤(CD68免疫熒光染色)比較(×200)

圖2 兩組小鼠腦內(nèi)Occludin蛋白表達比較(免疫熒光染色)

圖3 兩組小鼠腦內(nèi)ZO-1蛋白表達比較(免疫熒光染色×200)

圖4 兩組小鼠腦內(nèi)Occludin蛋白表達比較(Western blot)

圖5 兩組小鼠腦內(nèi)ZO-1蛋白表達比較(Western blot)

組別Occludin7d14d21dZO-17d14d21dFasudil組0.127±0.0220.233±0.0140.364±0.1212.404±0.2562.003±0.1841.674±0.023EAE組0.068±0.0450.185±0.0110.248±0.0212.013±0.0731.783±0.1291.332±0.052t值6.0262.6092.8341.4672.4096.026P值0.0270.02980.0060.0950.0160.002

3 討論

保持BBB結(jié)構(gòu)的完整性是神經(jīng)組織要發(fā)揮正常功能的重要前提之一。目前已證實由于外周炎性細胞浸潤CNS導(dǎo)致的一系列免疫反應(yīng)并最終造成中樞脫髓鞘的病理過程中，BBB的破壞導(dǎo)致通透性增高是介導(dǎo)該過程的重要環(huán)節(jié)，有研究報道MS及EAE的發(fā)病最早階段即有BBB的通透性增加。劉瑞春等[4]給EAE大鼠靜脈注射2% EB后，觀察發(fā)現(xiàn)EAE大鼠未出現(xiàn)臨床癥狀之前BBB的完整性即遭到破壞，BBB的通透性增加，大鼠軟腦膜下層EB廣泛滲出。Fabis等[5]用氟化鈉(NaF)示蹤劑觀察BBB動態(tài)演變過程，結(jié)果顯示EAE動物出現(xiàn)的病理癥狀嚴重性和BBB通透性增加程度間存在明顯線性相關(guān)關(guān)系，由此提示BBB完整性的破壞在MS和EAE發(fā)病過程中起著關(guān)鍵作用。

本研究通過腹腔注射Fasudil觀察其對EAE的治療效果，通過病理學檢查發(fā)現(xiàn)Fasudil干預(yù)可降低EAE小鼠CNS的炎性反應(yīng)，減少髓鞘脫失及巨噬細胞的浸潤。巨噬細胞與EAE的發(fā)展有密切關(guān)系，它有抗原提呈的能力，分泌炎性細胞因子，參與髓鞘脫失和軸突的損傷。Takeda等[6]發(fā)現(xiàn)，Rho激酶抑制劑可減少炎性細胞跨內(nèi)皮細胞的遷徙、聚集，進而對BBB起到保護作用。本研究通過尾靜脈注射并檢測EB含量動態(tài)觀察EAE小鼠BBB的功能，通過對各組小鼠腦組織中、脊髓中EB滲透量來衡量BBB通透性的變化。EB是一種熒光染料，進入血液循環(huán)中大多數(shù)與白蛋白結(jié)合形成EB-復(fù)合物(ESA)，正常情況下ESA很難通過BBB，當BBB的完整性遭到破壞通透性增加時，EB通過BBB的通透率會顯著增加，腦組織、脊髓藍染加重[7]。本研究結(jié)果顯示，免疫后14 d、21 d Fasudil組腦和脊髓內(nèi)EB滲透量較EAE組小鼠明顯降低，而免疫后14 d、21d正是EAE小鼠發(fā)病的嚴重時期，表明Fasudil能有效降低EAE小鼠BBB的通透性，減少EB通過BBB進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的量，表明Fasudil在EAE發(fā)病期間對BBB具有保護作用。

既往研究證實當EAE發(fā)生時，Rho/ROCK激活，促進內(nèi)皮細胞胞質(zhì)的細胞骨架蛋白-微絲肌動蛋白(F-actin)收縮，同時使內(nèi)皮細胞間的緊密連接蛋白-Occludin破壞，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細胞間緊密連接(tight junction ,TJ)的破壞，結(jié)果使BBB的通透性增加[8-10]。在BBB的組織結(jié)構(gòu)中緊密連接蛋白在維持BBB完整性中起著重要的作用，緊密連接蛋白的降解標志著BBB通透性增加。緊密連接蛋白主要包括跨膜蛋白Occludin、Claudins和胞質(zhì)蛋白ZO-1。Occludin在腦組織血管內(nèi)皮的表達明顯高于非神經(jīng)組織的血管內(nèi)皮，Occludin可將跨膜蛋白和細胞骨架連接在一起，改變肌動蛋白的收縮性，影響細胞間緊密連接裝配與功能，這是BBB通透性明顯低于其他組織屏障的重要原因[11]。黃海波[12-13]等認為，Occludin表達水平能夠代表BBB的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，其下降程度可以作為BBB損傷程度的標志。ZO-1是胞質(zhì)附著蛋白之一，是緊密連接復(fù)合體中一個非常重要的結(jié)構(gòu)蛋白, 它一方面連接著跨膜蛋白, 另一方面又與胞內(nèi)側(cè)的細胞骨架蛋白相連接, 起到一個重要的連接樞紐作用。研究證實BBB通透性的變化也與ZO-1的表達緊密相關(guān)[14]，ZO-1表達水平的下降也可以作為BBB功能破壞的標志[15]。本實驗對Occludin和ZO-1這兩個緊密連接蛋白進行了觀察，結(jié)果顯示Fasudil組EAE小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性反應(yīng)減輕，小鼠腦組織內(nèi)Occludin和ZO-1的下調(diào)被抑制，也提示Fasudil能有效地維持BBB的完整性，從而保護BBB的正常功能。

綜上所述，F(xiàn)asudil可能通過抑制腦組織內(nèi)緊密連接蛋白Occludin和ZO-1的下調(diào)，從而保護BBB功能的完整性有關(guān)，但其對EAE具體的調(diào)節(jié)方式和病理條件下的分子機制還需進一步探討。

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(本文編輯：鄒晨雙)

Objective To explore the protective mechanisms of Fasudil on blood-brain-barrier (BBB) in the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE). Methods Chronic EAE model was induced by MOG35-55in female C57BL/6 mice. Fasudil was injectedintraperitoneally in the intervention group at 40 mg/(kg·d) and normal saline was injected in the EAE group from day 3 to day 20 post-immunization (p.i.), The specimens were collected on day 7, 14, and 21 p.i. The brain and spinal cord were frozen for HE staining and myelin staining, immunofluorescence staining. The contents of Evans blue (EB) in the brain and spinal cord were detected after intravenous injection. The protein extracted from the brains was collected for the measuremens of Occludin and ZO-1 by Western blot. Results Fasudil significantly decreased inflammatory cell infiltration and demyelination in the CNS(number of inflammatory cell: 98.00±33.15vs. 417.7±78.89,t=3.736，P<0.05；demyelination area :(11.38±1.09)%vs.(38.21±7.94)%，t=3.473，P<0.05). Comparing with the EAE group,at day 14 d.and 21 d , the EB levels in brain and spinal cord of Fasudil-treated mice were significantly lower(brain:9.04±0.15vs9.93±0.25，t=5.776，P<0.05；9.09±0.089vs9.83±0.22，t=3.116，P<0.05; spinal cord:17.28±0.38vs21.33±2.21，t=7.782，P<0.05;16.48±0.71vs21.77±0.17，t=7.256，P<0.01),Fasudil also induced an up-regulation of Occludin (7 d：0.068±0.045vs0.127±0.022，t=6.026，P<0.05;14 d：0.185±0.011vs0.233±0.014，t=2.609，P<0.05;21 d：0.248±0.021vs0.364±0.121，t=2.834，P<0.01)and ZO-1 (7 d：2.013±0.073vs2.404±0.256，t=1.467,P>0.05;14 d：1.783±0.129vs2.003±0.184,t=2.409,P<0.05;21 d：1.332±0.052vs1.674±0.023,t=6.026,P<0.01) in the brain .Conclusions Fasudil may be related to inhibition of the down-regulation of Occludin and ZO-1 in the brain, revealing that Fasudil can maintain the integrity of BBB.

Fasudil; Experimental autoimmune encephalomyelitis;tight junction; Blood brain barrier

YU Jiezhong , Email:sxdtyjz@qq.com; MA Cungen, Email:macungen2001@163.com

2016-10-17)

10.3969/j.issn.1006-2963.2017.02.007

國家自然科學基金2012面上項目(81272163)；山西中醫(yī)學院“2011”培育計劃(2011PY-1)；山西省國際科技合作項目(2013081058)；山西省回國留學人員重點科研資助項目(2014-重點7)；大同大學校科研項目(2016K10)

037009山西大同大學腦科學研究所(谷青芳、張輝、李艷華、劉春云、尉杰忠、肖保國、馬存根)，037009大同市第五人民醫(yī)院(王慧卿)；030024山西中醫(yī)學院“2011”協(xié)同創(chuàng)新中心/神經(jīng)生物學研究中心 山西中醫(yī)學院(馬存根)；200025復(fù)旦大學華山醫(yī)院神經(jīng)病學研究所(肖保國))

尉杰忠，Email：sxdtyjz@qq.com；馬存根，Email：macungen2001@163.com

R744.5+1

A

1006-2963(2017)02-0099-06

Research about protective effects of fasudil on BBB function in EAE mice and study of the mechanismsGUQingfang,ZHANGHui,LIYanhua,LIUChunyun,WANGHuiqing,XIAOBaoguo,YUJiezhong*,MACungen*.*InstituteofBrainScience,ShanxiDatongUniversity,DatongShanxi037009China; “2011”CollaborativeInnovationCenter/ResearchCenterofNeurobiology,ShanxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,TaiyuanShanxi030024,China