文萍 劉雯張娣 康明 陳樂

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046）

蜂膠中短葉松素的提取分離與含量測(cè)定*

文萍 劉雯張娣 康明 陳樂#

（江西省中醫(yī)藥研究院 南昌 330046）

目的：研究蜂膠中短葉松素的制備工藝及含量測(cè)定方法，并測(cè)定和比較12個(gè)產(chǎn)地蜂膠中短葉松素的含量。方法：采用溶劑提取、大孔樹脂吸附及葡聚糖凝膠色譜和重結(jié)晶等方法進(jìn)行分離純化，根據(jù)理化性質(zhì)和核磁數(shù)據(jù)對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定為短葉松素；用HPLC法測(cè)定蜂膠中短葉松素含量，YMC C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速為1.0 m l·m in-1，甲醇-0.1%磷酸溶液（60∶40），檢測(cè)波長(zhǎng)：292 nm。結(jié)果：所得短葉松素的純度在98.5%以上，短葉松素在8.512～425.6 μg線性關(guān)系良好，平均回收率（n=6）為98.60%，RSD為0.97%，12個(gè)產(chǎn)地的蜂膠中短葉松素以新疆、云南、陜西三地含量較高。結(jié)論：提取分離的短葉松素含量高，可作為含量測(cè)定用對(duì)照品，含量測(cè)定方法穩(wěn)定、可靠，可作為蜂膠中短葉松素含量測(cè)定方法。

蜂膠；短葉松素；提取分離；含量測(cè)定

蜂膠具有抗過敏、抗炎、抗氧化、強(qiáng)化血管、抑制病毒、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等保護(hù)身體健康、抵御疾病入侵的作用[1～2]。蜂膠中含有豐富的黃酮類[3]等生物活性成分，具有極為豐富的藥理活性。短葉松素及其衍生物具有強(qiáng)化血管、抗菌、抗炎、抗氧化作用[4～5]，還具防止肝功能損傷、保肝護(hù)肝的作用[6]，也是發(fā)揮蜂膠功效的物質(zhì)基礎(chǔ)之一。蜂膠的分布非常廣泛，不同產(chǎn)地的蜂膠中各成分含量參差不齊[7]。本文采用簡(jiǎn)單有效的方法提取分離出蜂膠中的短葉松素，并采用高效液相色譜法對(duì)12個(gè)產(chǎn)地的54批蜂膠中短葉松素含量進(jìn)行了測(cè)定和比較，為蜂膠質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（Eyela公司），低溫循環(huán)水式真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司），Waters 1525-2487-2707型高效液相色譜儀，TU-1810型紫外可見分光光度儀（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），中壓液相色譜儀（Brucker公司），400 MHz和600 MHz核磁共振儀（Varian公司），M icromass Auto specultima ETOF型質(zhì)譜儀，CQ-250超聲波清洗器（上海船舶電子設(shè)備研究所），MettllerTkledoAG135雙量程電子天平（十萬分之一），SimplicityTM超純水系統(tǒng)（M illipore公司）。

1.2 藥品與試劑蜂膠為課題組收集云南（樣品編號(hào)16、17）、四川（編號(hào)35、37、38）、江西（編號(hào)90、99、103、104、106）、湖南（編號(hào)110、111、117、118、119）、山東（編號(hào)128、129、142、151）、河南（編號(hào)27、28、30、43、45、46、47）、山西（編號(hào)49、50、52、57）、內(nèi)蒙（編號(hào)130、134、136）、遼寧（編號(hào)53、138）、陜西（編號(hào)1、2、4、6、9）、甘肅（編號(hào)10、15）、新疆（編號(hào)31、41）、浙江（編號(hào)86、87、88、89）等地48個(gè)蜂膠及汪氏蜜蜂園有限公司提供的6批蜂膠，經(jīng)江西省中醫(yī)藥研究院余良忠研究員鑒定為蜜蜂Apis ceranaFabr.將采自植物的枝條、葉芽及愈傷組織等的分泌物與上腭腺、蠟腺等的分泌物同少量花粉混合后所形成的黏性物質(zhì)。短葉松素對(duì)照品（自制，純度98.69%），AB-8型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司），葡聚糖凝膠Sephadex LH-20、CG161型大孔樹脂（美國(guó)羅門哈斯公司），甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 短葉松素的提取分離參考文獻(xiàn)[8]稱取蜂膠原料約200 g，置于冰箱冷凍層24 h后，用粉碎機(jī)粉碎，過1號(hào)篩，加入1 000 m l的95%乙醇，振搖提取2次，每次提取4 h，濾過，回收乙醇，濃縮，真空干燥（80℃，-0.1 MPa）12 h，得蜂膠提取物。取蜂膠提取物倒入圓底燒瓶，加入200 m l 95%乙醇回流，至蜂膠提取物全部溶解。將蜂膠提取物乙醇溶解減壓濃縮至適宜濃度，濕法上樣，上大孔吸附樹脂柱。甲醇-水溶劑系統(tǒng)（1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、10∶0）梯度洗脫，收集各段的洗脫液2 000 m l，按極性大小分為A、B、C、D、E、F。取D洗脫液，濃縮，將濃縮液上Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱。甲醇-水溶劑系統(tǒng)（1∶10、2∶10、3∶10、4∶10、5∶10、10∶0）梯度洗脫，收集各段的洗脫液2 000 m l，按極性大小分為AA、BB、CC、DD、EE、FF。組分CC經(jīng)硅膠柱（石油醚-丙酮2∶1）及制備液相（40%～70%）得化合物（1 g）。經(jīng)高效液相色譜歸一法測(cè)定，其純度＞98.5%。

2.2 短葉松素的結(jié)構(gòu)鑒定淡黃色針狀結(jié)晶（甲醇）。1H-NMR（600 MHz,DMSO-d6）δ：11.89（1H,s, 5-OH），10.85（1H,s,7-OH），5.85（1H,d,J=6.6 Hz, 3-OH），7.38～7.53（5H,m,B環(huán)上的H），5.90（1H,d, J=1.8 Hz,H-6），5.94（1H,d,H-8），4.64（1H,dd,J= 11.4,6.0 Hz,H-3），5.19（1H,d,J=11.4 Hz,H-2）。13C-NMR（150 MHz,DMSO-d6）δ：83.4（C-2），72.0 （C-3），198.1（C-4），163.8（C-5），96.7（C-6），167.4 （C-7），95.6（C-8），163.0（C-9），101.0（C-10），137.8 （C-1′），128.6（C-2′,6′），128.7（C-3′,5′），129.1（C-4′）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道[9]一致，故鑒定為短葉松素（pinobaksin）。

2.3 短葉松素的含量測(cè)定

2.3.1 色譜條件的選擇取對(duì)照品短葉松素約10 mg，精密稱定，置25 m l量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為400 μg·m l-1的對(duì)照品溶液。精密吸取上述溶液1 m l于10 m l容量瓶中，加甲醇至刻度搖勻。取上述對(duì)照品溶液置紫外分光光度計(jì)上進(jìn)行光譜掃描，在292 nm有明顯吸收峰。結(jié)果見圖1。色譜條件選擇YMC C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流速為1.0 m l·m in-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：292 nm，按甲醇-0.1%磷酸溶液（60∶40）進(jìn)行洗脫，結(jié)果蜂膠分離峰型好，分離度滿足液相色譜要求。見圖2、圖3。

圖1 短葉松素紫外光譜圖

圖2 短葉松素對(duì)照品色譜圖

圖3 蜂膠供試品色譜圖

2.3.2 供試品溶液的制備取蜂膠藥材約50 mg，精密稱定，至25 m l容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理15 min取出，放置至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，作為供試品溶液。

2.3.3 線性關(guān)系的考察取對(duì)照品短葉松素約10.64 mg，精密稱定，置25 m l量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻得濃度為425.6 μg·m l-1的對(duì)照品溶液。將此對(duì)照品溶液分別稀釋至1 m l含8.512、17.024、34.048、42.560、85.120 μg短葉松素的溶液。精密吸取上述短葉松素對(duì)照品溶液各10 μl，注入液相色譜儀中，在292 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其峰面積，將濃度對(duì)峰面積值進(jìn)行回歸，回歸方程為Y＝61 451.82X+22 195.95（R2＝0.999 9），短葉松素在進(jìn)樣量8.512～425.6 μg，與峰面積值呈良好的線性關(guān)系。

2.3.4 精密度試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液10 μl，注入液相色譜儀中，重復(fù)進(jìn)樣6次，在292 nm處測(cè)定其峰面積，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，RSD＝1.39%。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取同一供試品溶液10 μl，在不同時(shí)間點(diǎn)0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀中，分別測(cè)定短葉松素峰面積，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，RSD＝1.23%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)取同一批蜂膠藥材共6份，測(cè)定短葉松素平均含量為0.60%，RSD＝0.01%。

2.3.7 回收率試驗(yàn)取蜂膠供試品約25 mg共6份，精密稱定，置25 m l量瓶中，分別精密加入短葉松素對(duì)照品溶液5 m l（1 m l含短葉松素42.56 μg），加入適量甲醇，超聲處理15 m in，取出，放置至室溫，加甲醇至刻度，搖勻，微孔濾膜（0.45 μm）濾過，注入液相色譜儀測(cè)定短葉松素含量，計(jì)算回收率。見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 樣品中短葉松素和咖啡酸的含量測(cè)定取54批蜂膠樣品，按上述方法測(cè)定其短葉松素含量。見表2。

表2 合格蜂膠中短葉松素測(cè)定結(jié)果

3 討論

本文以蜂膠中短葉松素為研究對(duì)象，考察其提取分離技術(shù)，成功在蜂膠中分離出短葉松素。從本文表2測(cè)定結(jié)果可知，54批合格蜂膠短葉松素的含量范圍為0.95%～3.85%，平均含量為1.85%，結(jié)合本項(xiàng)目前期研究測(cè)得結(jié)果[10]，規(guī)定蜂膠中短葉松素含量不得低于0.95%。由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出各地蜂膠中短葉松素平均含量有顯著差異，云南2.42%、四川2.02%、江西1.48%、湖南1.77%、山東1.73%、河南2.30%、山西2.11%、內(nèi)蒙1.66%、遼寧1.09%、陜西2.42%、甘肅1.63%、新疆2.66%，其中以新疆、云南、陜西三地含量最高。汪氏蜜蜂園有限公司提供的6批蜂膠中短葉松素平均含量為1.69%，也在合格范圍內(nèi)。通過對(duì)12省54批蜂膠藥材中短葉松素的含量測(cè)定和比較，規(guī)定了短葉松素含量下限，為以后蜂膠質(zhì)量和資源開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

[1]孟曉英,王玉華,魏春琴.蜂膠藥理作用研究概述[J].中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用,2010,4(18):245

[2]蔣春紅,呂武清,胡棠洪.蜂膠的藥理作用研究概況[J].中國(guó)醫(yī)藥指南,2011,9(17):42-43

[3]張翠平,胡福良.蜂膠中的黃酮類化合物[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2009,21(6):1084-1090

[4]王馨.蜂膠黃酮對(duì)小鼠N2a細(xì)胞缺氧缺糖所致?lián)p傷的保護(hù)作用及機(jī)理研究[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院.2014.1-10

[5]尹志華.云南蜂膠對(duì)四種牙周主要可疑致病菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].昆明:昆明醫(yī)科大學(xué).2012.24-44

[6]杜夏.蜂膠保肝活性成分的分離及其保肝機(jī)制初探[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院.2013.23-33

[7]吳健全,高蔚娜,韋京豫,等.不同產(chǎn)地蜂膠成分含量的比較[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2013,19(7):62-65

[8]呂武清,文萍,姚劍平,等.蜂膠提取物制備工藝研究[J].中草藥, 2014,45(6):791-794

[9]安寧,楊世林,鄒忠梅,等.高良姜黃酮類化學(xué)成分的研究[J].中草藥, 2006,37(5):663-664

[10]文萍,范婷婷,呂武清,等.RP-HPLC測(cè)定蜂膠中喬松素、白楊素和高良姜素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué),2013,19(19):108-110

R284.2

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.01.091

2016-09-27）

江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20141BBG70075）

#通訊作者：陳樂，E-mail：76349830@qq.com