胡海霞 朱曉勤 李鉆芳 林如輝 陳立典

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 350122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 福州 350122）

●中西藥苑●

栝樓桂枝湯對(duì)活化小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎作用的研究*

胡海霞1朱曉勤1李鉆芳1林如輝1陳立典2#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院 福州 350122；2福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院 福州 350122）

目的：探討栝樓桂枝湯對(duì)活化小膠質(zhì)細(xì)胞抗炎因子的表達(dá)水平及上游炎癥信號(hào)通路的活化情況。方法：先用MTT實(shí)驗(yàn)篩選出藥物的最佳干預(yù)濃度，然后體外LPS刺激制備出小膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞炎癥模型，經(jīng)栝樓桂枝湯水提液處理后，應(yīng)用ELISA法、RT-PCR法、Western-blotting法分別檢測(cè)細(xì)胞抗炎因子的表達(dá)及相關(guān)炎癥信號(hào)通路蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：栝樓桂枝湯水提液可顯著促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞中抗炎因子的表達(dá)，并上調(diào)相應(yīng)通路蛋白的表達(dá)水平。結(jié)論：栝樓桂枝湯可通過(guò)TRIF信號(hào)通路發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥的作用。

神經(jīng)炎癥；栝樓桂枝湯；小膠質(zhì)細(xì)胞；抗炎

小膠質(zhì)細(xì)胞（M icroglia，MG）是公認(rèn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的固有免疫細(xì)胞，約占成年中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞總量的10%～20%[1]，主要介導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷等疾病的免疫反應(yīng)，在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮核心作用[2]。神經(jīng)炎癥反應(yīng)的標(biāo)志就是MG的激活[3]，MG作為CNS固有的免疫效應(yīng)細(xì)胞參與缺血性中風(fēng)過(guò)程中的免疫反應(yīng)和病理過(guò)程[4]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，TLR4主要表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞，而TLR4所識(shí)別的外源性配體主要為L(zhǎng)PS。前期實(shí)驗(yàn)研究[5]已證實(shí)栝樓桂枝湯可以抑制LPS刺激所引起的細(xì)胞促炎因子的表達(dá)，且可能與炎癥通路TLR4/NFkB有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中，先用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力后得出最佳刺激濃度，再以LPS干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞在體外制備小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥模型，然后用栝樓桂枝湯水提液進(jìn)行干預(yù)處理，觀察藥物對(duì)于活化小膠質(zhì)細(xì)胞中抗炎因子的影響作用，并探討其可能的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下：

1 材料

1.1 細(xì)胞小鼠源小腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞BV2（購(gòu)自上海復(fù)祥生物科技有限公司），源自C57BL/6小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞，成纖維樣細(xì)胞，半貼壁生長(zhǎng)。

1.2 藥物栝樓桂枝湯組方：栝樓根30 g，桂枝9 g，芍藥9 g，甘草6 g，生姜9 g，大棗12枚（藥材購(gòu)自福州國(guó)醫(yī)堂醫(yī)藥公司）。

1.3 試劑高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、青鏈雙抗、PBS緩沖液（美國(guó)Hyclone公司），胎牛血清（美國(guó)GIBCO公司），LPS（Escherichia coli 055：B5）、MTT（美國(guó)Sigma公司），DEPC處理水（上?；鶢栴D生物技術(shù)公司），Trizol（美國(guó)Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Promega公司），SYBR-GreenⅠ定量PCR試劑盒（日本Takara公司），引物合成（上海生工生物工程公司），ELISA kit IFNβ、IL10（美國(guó)R&D公司），大鼠抗TLR3、TRIF（美國(guó)Santa Cruz公司），PVDF膜（美國(guó)M illipore公司），RAPI細(xì)胞裂解液、凝膠配制試劑盒、化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.4 儀器SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái)（蘇州安泰儀器設(shè)備有限公司）；ELX808酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司）；HF212UV CO2培養(yǎng)箱（香港力康儀器設(shè)備有限公司）；電泳儀、凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Red公司），TS-100F型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。7500型熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），垂直電泳槽、轉(zhuǎn)移槽（北京六一儀器廠），凝膠成像分析系統(tǒng)（美國(guó)BioRad公司）。

2 方法

2.1 栝樓桂枝湯水提液的制備取栝樓根30 g，桂枝9 g，芍藥9 g，甘草6 g，生姜9 g，大棗12枚，浸泡0.5 h，加5倍量的水加熱回流2次，1 h/次，過(guò)濾，濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，真空干燥成干浸膏，－20℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)BV2培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%青霉素/鏈霉素雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于飽和濕度、37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞呈現(xiàn)80%匯合度后，用0.05%胰蛋白酶消化傳代，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MTT法篩選栝樓桂枝湯水提液干預(yù)濃度和細(xì)胞炎癥模型制備小膠質(zhì)細(xì)胞株BV2生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期，以5×104個(gè)/m l的細(xì)胞濃度接種于96孔板，LPS（1 μg/m l）和栝樓桂枝湯水提液（50 μg/m l、100 μg/m l、200 μg/m l）分別干預(yù)細(xì)胞24 h后，加入MTT（0.5 mg/m l）100 μl繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，再加入培養(yǎng)級(jí)DMSO 100 μl溶解甲瓚，振蕩后在570 nm處檢測(cè)各孔吸光度值，觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)活力。本研究選用的細(xì)胞干預(yù)濃度為不影響細(xì)胞生長(zhǎng)活力的濃度范圍。

2.4 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的炎癥因子細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期后，將細(xì)胞以5×105個(gè)/m l的細(xì)胞濃度接種于24孔板，貼壁過(guò)夜后，按如下分組：對(duì)照組、LPS（1 μg/m l）干預(yù)組、栝樓桂枝湯（50 μg/m l）+LPS組、栝樓桂枝湯（100 μg/m l）+LPS組、栝樓桂枝湯（200 μg/m l）+LPS組，每組各3孔。干預(yù)24 h后，收集各組的細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照TGFβ、IL10的ELISA試劑盒說(shuō)明書操作，檢測(cè)培養(yǎng)上清液中抗炎因子的含量。

2.5 Western-blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平細(xì)胞以5×105個(gè)/m l的細(xì)胞濃度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶（規(guī)格為25 cm2），用與2.5相同的干預(yù)方式干預(yù)細(xì)胞24 h，干預(yù)結(jié)束后，提取細(xì)胞總蛋白/核蛋白，按每20 mg組織加200～400 μl的比例加入裂解液，冰上放置30 m in，每隔10 m in搖晃1次助融。然后將EP管置于低溫離心機(jī)中，4℃，12 000 r/m in離心15 min，吸取上清。采用BCA蛋白定量法測(cè)定樣本蛋白濃度。進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出轉(zhuǎn)移膜放入封閉液中，在搖床上常溫封閉1 h。用封閉液稀釋一抗（抗體稀釋度為1∶1 000），封閉結(jié)束后將膜浸入配制好的一抗中，置于4℃冰箱過(guò)夜。將洗滌后的一抗反應(yīng)膜放入二抗工作液（抗體稀釋度為1∶3 000）中，置于搖床上室溫反應(yīng)1 h。用TBST洗膜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯色：置于凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行顯色并拍照。實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)用Gel Doc凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行半定量分析。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件（One-way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 栝樓桂枝湯對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)活力的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，栝樓桂枝湯在50 μg/m l、100 μg/m l、200 μg/m l濃度范圍內(nèi)對(duì)細(xì)胞活力的影響相比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即對(duì)BV2細(xì)胞沒(méi)有毒性。說(shuō)明栝樓桂枝湯在該濃度范圍內(nèi)可用于后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的干預(yù)。見(jiàn)圖1。

圖1 MTT法觀察栝樓桂枝湯對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞（BV2）生長(zhǎng)活力的影響

3.2 栝樓桂枝湯對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)基因和蛋白表達(dá)水平的影響LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞活化后可釋放抗炎因子TGFβ、IL10等，但主要釋放哪類因子與細(xì)胞的活化狀態(tài)和時(shí)間有關(guān)?？寡滓蜃覶GFβ、IL10在LPS刺激細(xì)胞后變化不明顯，而栝樓桂枝湯可促進(jìn)抗炎因子的分泌，P＜0.05，與蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致；RT-PCR結(jié)果提示，小膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)LPS活化后TGFβ、IL10等抗炎因子的基因表達(dá)量沒(méi)有顯著變化，P＞0.05；栝樓桂枝湯可以促進(jìn)抗炎因子的基因表達(dá)，P＜0.05。見(jiàn)圖2～圖3。

圖2 栝樓桂枝湯對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)分泌水平的影響

圖3 栝樓桂枝湯對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥介質(zhì)基因表達(dá)水平的影響

3.3 栝樓桂枝湯對(duì)炎癥相關(guān)通路蛋白表達(dá)水平的影響TLR3是唯一啟動(dòng)MyD88非依賴性途徑TRIF-IRF3的Toll樣受體。LPS干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞BV2后，TLR3和TRIF的基因及蛋白表達(dá)水平變化不大，P＞0.05；而栝樓桂枝湯可以濃度依賴性促進(jìn)TLR3和TRIF基因和蛋白水平的升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。見(jiàn)圖4～圖5。

圖4 栝樓桂枝湯對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞IRF3介導(dǎo)的通路蛋白基因表達(dá)的影響

圖5 栝樓桂枝湯對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞IRF3介導(dǎo)的通路蛋白表達(dá)的影響

4 討論

小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。在正常生理狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞呈靜息狀態(tài)，當(dāng)腦缺血損傷發(fā)生時(shí)，小膠質(zhì)細(xì)胞被活化，但小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度激活會(huì)啟動(dòng)強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答，釋放大量炎性因子和細(xì)胞毒性物質(zhì)，引發(fā)神經(jīng)元損傷[6～7]。

在人類中樞神經(jīng)系統(tǒng)中小膠質(zhì)細(xì)胞可表達(dá)TLR1-9[8]，基于募集特異的銜接蛋白，TLRs誘導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路主要有MyD88依賴和非MyD88依賴的兩個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[9]。最近的研究證實(shí)，TLRs家族中TLR3發(fā)揮著重要的抗炎作用。TLR3特異性募集銜接蛋白TRIF可啟動(dòng)TRIF依賴性途徑從而誘導(dǎo)一系列神經(jīng)保護(hù)因子的表達(dá)，如IFNβ、TGFβ、IL10、BDNF（Brain Derived Neurotrophic Factor）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白4（Neurotrophin）、多效生長(zhǎng)因子（Pleiotrophin）等，以上這些因子均已證實(shí)具有抗炎和/或神經(jīng)保護(hù)作用。研究顯示，TGFβ具有很強(qiáng)的抗炎活性，它能降低腦梗死面積和減輕腦水腫，修復(fù)腦組織損傷[10]，對(duì)興奮性神經(jīng)毒素和缺氧所致的神經(jīng)細(xì)胞死亡發(fā)揮重要的保護(hù)作用[11]。Bsibsi等[12]的研究表明，TLR3激活后還可上調(diào)膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)抗炎細(xì)胞因子IL10，IL10本身可減少M(fèi)CAO大鼠的腦梗死體積[13]，且與正常小鼠相比，IL10缺乏的小鼠的神經(jīng)細(xì)胞對(duì)興奮性毒性和低糖低氧所致?lián)p傷更敏感[14]。TLR3的信號(hào)通路則是由銜接蛋白TRIF啟動(dòng)的MyD88非依賴性途徑，TRIF被招募至受體啟動(dòng)IKKε磷酸化，最終活化轉(zhuǎn)錄因子IRF3、IRF7的活化，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，產(chǎn)生抗炎因子TGFβ等[15]。

本實(shí)驗(yàn)首先采用MTT法檢測(cè)了細(xì)胞存活率的變化，通過(guò)觀察藥物對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的毒性作用影響，篩選LPS和栝樓桂枝湯的干預(yù)濃度。與對(duì)照組相比，LPS和栝樓桂枝湯干預(yù)組中細(xì)胞存活率未見(jiàn)顯著改變，表明LPS在1 μg/m l、栝樓桂枝湯在50～200 μg/m l濃度范圍對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性影響，即后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選用LPS和栝樓桂枝湯的相應(yīng)濃度范圍干預(yù)結(jié)果是在不影響小膠質(zhì)細(xì)胞活力的前提下得出的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，用LPS干預(yù)小膠質(zhì)細(xì)胞后，栝樓桂枝湯在抑制TLR4途徑活化的情況下[4]，同時(shí)激活了TLR3信號(hào)途徑，TLR3/TRIF/IRF3信號(hào)途徑可啟動(dòng)抑炎因子的表達(dá)，包括TGFβ、IL10等，且與該通路相關(guān)的蛋白水平也顯著升高，而LPS刺激組中TLR3/TRIF信號(hào)通路無(wú)明顯變化，因此，可以推斷，栝樓桂枝湯對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化的抑制作用是雙向調(diào)節(jié)完成的，即是通過(guò)下調(diào)TLR4信號(hào)和TLR3信號(hào)而實(shí)現(xiàn)其抑制作用的，維持一定的內(nèi)環(huán)境，即調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞中TLR3通路的活化狀態(tài)可能是栝樓桂枝湯發(fā)揮潛在的神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制之一。

[1]Lawson LJ,Perry VH,Dri P,et al.Heterogeneity in the distribution and morphology of m icroglia in the normal adult mouse brain[J]. Neuroscience,1990,39(1):151-170

[2]Streit WJ,Conde JR,Fendrick SE,et al.Role of microglia in the central nervous system’s immune response[J].Neurol Res,2005,27(7): 685-691

[3]Wilms H,Zecca L,Rosenstiel P,et al.Inflammation in Parkinson’s diseases and other neurodegenerative diseases:cause and therapeutic implications[J].Curr Pharm Des,2007,13(18):1925-1928

[4]Haixia Hu,Zuanfang Li,Xiaoqin Zhu,et al.Gua Lou Gui Zhi decoction suppresses LPS-induced activation of TLR4/NF-κB pathway in BV-2murine m icroglia cells[J].Int J Mol Med,2013,31(6):1327-1332

[5]Taylor RA,Sansing LH.M icroglial responses after ischemic stroke and intracerebral hemorrhage[J].Clin Dev Immunol,2013:746068

[6]Ouyang YB.Inflammation and stroke[J].Neurosci Lett,2013,548:1-3

[7]Kum ral A,Tuzun F,Ozbal S,et al.Lipopolysaccharide-preconditioning protects against endotoxin-induced white matter injury in the neonatal rat brain[J].Brain Res,2012,1489:81-89

[8]陳瑩瑩,孫光玲,蘭倩,等.Toll樣受體與腦缺血[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,14(12):2369-2375

[9]Marsh BJ,W illiams-Karnesky RL,Stenzel-Poore MP.Toll-Like receptor signaling in endogenous neuroprotection and stroke[J]. Neuroscience,2009,158(3):1007-1020

[10]付劍亮,劉雨,聶成福,等.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1與腦缺血[J].卒中與神經(jīng)疾病,2000,7(2):125-126

[11]Henrich-Noack P,Prehn JH,Krieglstein J.TGF-beta 1 protects hippocampal neurons against degeneration caused by transient global ischem ia.Dose-response relationship and potential neuroprotective mechanisms[J].Stroke,1996,27(9):1609-1614

[12]Bsibsi M,Persoon-Deen C,Verwer RW,et al.Toll-like receptor 3 on adult human astrocytes triggers production of neuroprotective mediators[J].Glia,2006,53(7):688-695

[13]Spera PA,Ellison JA,Feuerstein GZ,et al.IL-10 reduces rat brain injury follow ing focal stroke[J].Neurosci Lett,1998,251(3):189-192

[14]張莉,杜冠華.細(xì)胞因子在腦缺血損傷機(jī)制中的作用[J].國(guó)外醫(yī)學(xué):腦血管疾病分冊(cè),2004,12(5):379-382

[15]Takeda K,Akira S.TLR signaling pathways[J].Sem in Immunol, 2004,16(1):3-9

R743

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.01.090

2016-12-30）

國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：81403265）

#通訊作者：陳立典，E-mail：cld@fjtcm.edu.cn