趙錦燕 張毓宸 萬蕓 曾建偉 洪振豐#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院福州 350122；2福建省老年性疾病重點實驗室福州 350122）

●論著●

片仔癀肝寶對慢性肝損傷凋亡的影響*

趙錦燕1,2張毓宸1,2萬蕓1,2曾建偉1,2洪振豐1,2#

（1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院福州 350122；2福建省老年性疾病重點實驗室福州 350122）

目的：探討片仔癀肝寶（肝寶）對CCl4誘導(dǎo)大鼠慢性肝損傷凋亡的影響。方法：60只SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、西利賓胺組、肝寶低劑量組、肝寶中劑量組、肝寶高劑量組，每組10只。除正常對照組外，SD大鼠腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液1 m l/kg，2次/周，連續(xù)8周。于造模第四周開始給藥，設(shè)正常對照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性藥對照組（西利賓胺，50 mg/kg），肝寶低劑量組（150 mg/kg）、肝寶中劑量組（300 mg/kg）、肝寶高劑量組（600 mg/kg），1次/d，連續(xù)4周。于末次給藥24 h后，HE染色觀察肝寶對肝組織病理學(xué)的影響，TUNEL法觀察肝組織凋亡情況，比色法檢測Caspase-3和Caspase-9的變化，western blot檢測肝寶對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響。結(jié)果：HE染色發(fā)現(xiàn)，各用藥組均可不同程度緩解CCl4誘導(dǎo)的肝損傷；肝寶抑制肝細胞凋亡；降低Caspase-3和Caspase-9的活力；下調(diào)Bax表達，上調(diào)Bcl-2表達。結(jié)論：片仔癀肝寶可以抑制CCl4誘導(dǎo)的肝細胞凋亡。

肝損傷；凋亡；片仔癀肝寶

片仔癀肝寶是一種由多種中草藥混合而成的中成藥制劑，由牛黃、田七、茵陳、龍膽草、梔子、大黃、白芍、甘草等多種名貴藥材組成，具有較好的保肝護肝作用。本實驗以四氯化碳（CCl4）誘導(dǎo)慢性肝損傷模型，用片仔癀肝寶進行干預(yù)治療，觀察片仔癀肝寶對慢性肝損傷的凋亡的影響，為臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)條件雄性SD大鼠，SPF級，體重（200±20）g，雄性，許可證號：SCXK（滬）2008-0016，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供。動物實驗室，溫度22℃，濕度65%，風(fēng)速0.1～0.2 m/s，氣流≥28次/m in。

1.2 實驗藥物及試劑片仔癀肝寶由福建省片仔癀藥業(yè)股份有限公司提供；TUNEL試劑盒購自邁新生物技術(shù)有限公司；Caspase-3和Caspase-9試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Bax、Bcl-2 和GAPDH抗體購自abcam公司；四氯化碳，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)，批號：090209。

2 實驗方法

2.1 動物分組、模型制備及給藥雄性SD大鼠60只，隨機分為六組（正常對照組、模型組、陽性藥對照組，肝寶低劑量組、肝寶中劑量組、肝寶高劑量組），每組10只。正常對照組腹腔注射等體積橄欖油，其余各組腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液1 m l/kg，2次/周，連續(xù)8周。于造模第四周開始給藥，正常對照組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、陽性藥對照組（西利賓胺，50 mg/kg），肝寶低劑量組（150 mg/kg）、肝寶中劑量組（300 mg/kg）、肝寶高劑量組（600 mg/kg），0.5 m l/100 g體重，1次/d，連續(xù)4周。末次給藥24 h后，空腹用2%戊巴比妥鈉60 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主動脈采血，脫頸處死，剝離完整肝臟，稱重，然后取右葉肝組織1 cm×1 cm×1 cm，用4%多聚甲醛（以pH 7.4的PBS配制）固定，用于組織形態(tài)學(xué)和TUNEL檢測；取等量組織，用于分子生物學(xué)指標(biāo)檢測。

2.2 觀察大鼠一般狀態(tài)每天上午8:30左右，觀察并記錄大鼠的精神狀態(tài)、行為、毛發(fā)光澤度、飲食、尿液、糞便以及死亡等情況。

2.3 肝組織病理學(xué)觀察多聚甲醛固定的肝組織制備石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察肝組織病理改變。

2.4 TUNEL法檢測細胞凋亡按照TUNEL試劑盒說明書操作步驟及反應(yīng)條件進行實驗。高倍鏡下觀察肝細胞形態(tài)、標(biāo)記強度及背景著色，低倍鏡下用Image-pro plus獲取圖像并分析計數(shù)凋亡細胞陽性率及積分吸光度值。實驗同時設(shè)陰性對照（無末端轉(zhuǎn)移酶）及陽性對照（DNaseⅠ處理），每張切片隨機選擇10個視野拍攝分析，計數(shù)1 000個細胞。

2.5 比色法檢測肝組織Caspase-3和Caspase-9的活力按照凱基生物公司Caspase-3和Caspase-9說明書進行。各取50 mg肝組織勻漿后加入裂解液提取總蛋白，取少量樣品測定蛋白濃度。按試劑盒體系加入反應(yīng)液，裂解液，待測樣品和Caspase-3 （Caspase-9）底物，37℃孵育4 h，在酶標(biāo)儀λ=405 nm處檢測吸光度值，通過計算OD干預(yù)組/OD陰性組的倍數(shù)確定Caspase-3和Caspase-9的活化程度。

2.6 western blot法檢測肝組織Bax、Bcl-2的蛋白表達取100 mg大鼠肝臟相同部位組織，每組加1 m l裂解液（含10 μl PMSF），冰上裂解30 m in。4℃、12 000 rpm離心10 m in，取上清。加入上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性。每孔上樣8 μl總蛋白，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)儀器將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，電壓15 V，時間30 m in。膜室溫下用5%脫脂奶粉封閉3 h，膜洗清后加入一抗，一抗?jié)舛纫?∶200稀釋后使用，4℃過夜。再分別加入與相應(yīng)的二抗，室溫放置1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯影，以GAPDH為內(nèi)參，分析條帶吸光度值。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以 （±s）表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 病理組織學(xué)結(jié)果肉眼觀察正常對照組大鼠肝臟表面光滑，呈紅褐色，輕按質(zhì)軟；模型組大鼠肝臟體積明顯縮小，顏色黯淡，邊緣鈍，質(zhì)硬，表面有大量纖維滲出物，與周圍組織粘連明顯；復(fù)方片仔癀肝寶各劑量組和陽性藥對照組有效改善大鼠肝臟的顏色及質(zhì)地，其中高劑量組變化明顯。光鏡下觀察，可見正常對照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝索排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰，未見肝細胞變性、淋巴細胞浸潤及肝臟組織壞死等病理變化；模型組大部分肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，肝索排列紊亂，部分氣球樣變及空泡變性，嚴重者可見肝細胞壞死灶及炎性浸潤；各用藥組均明顯改善了肝細胞氣球樣變及空泡變性，炎性浸潤有效緩解，無明顯組織壞死。見圖1。

圖1 片仔癀肝寶對肝臟病理組織學(xué)的影響（HE染色，×100）

3.2 復(fù)方片仔癀肝寶抑制CCl4誘導(dǎo)的細胞凋亡（1）TUNEL結(jié)果顯示，模型組大鼠肝組織細胞核呈現(xiàn)明顯棕褐色染色，表明CCl4誘導(dǎo)了肝細胞的凋亡，與對照組比較，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；西利賓胺和肝寶各劑量組均不同程度地抑制了陽性率的表達，與模型組比較，均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。（2）復(fù)方片仔癀肝寶對線粒體凋亡的影響：與對照組比較，模型組大鼠Caspase-9和Caspase-3表達上升，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），西利賓胺和肝寶不同劑量組均抑制了Caspase-9和Caspase-3的表達。見圖3。進一步研究發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠肝組織Bax表達上調(diào)，Bcl-2表達下調(diào)，肝寶高劑量顯著抑制了Bax，上調(diào)了Bcl-2的表達。見圖4。

圖2 片仔癀肝寶對肝組織凋亡的影響（TUNEL，×400）

圖3 片仔癀肝寶對Caspase-3和Caspase-9的影響

圖4 片仔癀肝寶對Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

4 討論

CCl4是一種經(jīng)典的化學(xué)毒物，利用CCl4制備的慢性肝損傷模型已廣泛用于研究慢性肝損傷和肝纖維化的發(fā)病機制、血清標(biāo)志物的研究及保肝藥物的藥效評價等[1]。本實驗采用腹腔注射50%CCl4橄欖油溶液制備慢性肝損傷以觀察片仔癀肝寶的藥效及其可能機制。

正常情況下，凋亡被認為是維持肝臟生理平衡的有效機制，然而，在肝臟損傷的情況下，凋亡過度超過其自身的調(diào)節(jié)范圍，凋亡就會成為加劇肝損傷的病理因素[2]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，凋亡在肝損傷的發(fā)病中發(fā)揮重要作用[3～4]。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCl4腹腔注射可以促進肝細胞凋亡，片仔癀肝寶能有效緩解肝細胞凋亡情況。線粒體功能失調(diào)是凋亡的重要因素[5]，Caspase-3凋亡執(zhí)行蛋白，實驗結(jié)果顯示，CCl4增加肝組織Caspase-3的表達；Bax和Bcl-2的比率失調(diào)一直被認為是線粒體凋亡途徑的重要標(biāo)志[6]，在本實驗中發(fā)現(xiàn)，片仔癀肝寶可以調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2的比率抑制凋亡的發(fā)生。綜上所述，片仔癀肝寶可以改善慢性肝損傷大鼠肝組織的病理狀況，說明片仔癀肝寶能有效預(yù)防慢性肝損傷,其機制可能與抑制肝細胞凋亡，促進肝細胞再生有關(guān)。

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Effect of Pianzaihuang Ganbao on the Apoptosis of Chronic Liver In jury

ZHAO Jin-yan1,2,ZHANG Yu-chen1,2,WAN Yun1,2,ZENG Jian-wei1,2,HONG Zhen-feng1,2#

(1The Institute of Traditional Chinese and Western Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou350122; 2Fujian Provincial Laboratory of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine,Fuzhou350122)

Objective:To explore the effect of Pianzaihuang Ganbao(GB)on the apotosis of chronic liver injury induced by CCl4in rats.Methods:Sixty Sprague–Daw ley(SD)rats were random ly divided into control,model,silymarin,GB-low,GB-m iddle and GB-high groups,ten rats per group.Except the control group was received olive oil,the rest groups were intraperitoneally injected with CCl41 m l/kg,tw ice a week for 8 weeks constitutively.At the fourth week,the model and the control group were orally adm inistration physiological saline(PS),while the silymarin(50 mg/kg),GB-Low(150 mg/kg),GB-m iddle(300 mg/kg),GB-high(600 mg/kg)were orally administrated in treatment group respectively for 4 weeks.Twenty-four hours after the last treatment,HE staining was used to observe the histopathological change in liver;the apoptosis was determ ined by TUNEL assay;Caspase-3 and Caspase-9 were detected;the protein expression of Bax and Bcl-2 were determ ined by western blot.Results:The results from HE staining found that all treatment could alleviate the injuried liver tissues differently;GB could inhibit the apotosis and decrease the activity of Caspase-3 and Caspase-9; furthermore,down-regulated the expression of Bax and up-regulated Bcl-2.Conclusion:GB could inhibit the apotosis induced by CCl4.

Liver injury;Apotosis;Pianzaihuang Ganbao

R965

B

10.13638/j.issn.1671-4040.2017.01.001

2016-12-19）

陳可冀中西醫(yī)結(jié)合發(fā)展基金（編號：CKJ2013015）

#通訊作者：洪振豐，E-mail：zfhong1953@163.com