王燕云，吳凱，楊行，楊靜*

(1.西南林業(yè)大學(xué)云南省木材膠黏劑及膠合制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 2.西南林業(yè)大學(xué)材料工程學(xué)院，昆明650224)

基于高底物濃度的纖維素酶三段水解桑木粉得率與形貌分析

王燕云1,2，吳凱1,2，楊行2，楊靜1,2*

(1.西南林業(yè)大學(xué)云南省木材膠黏劑及膠合制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室; 2.西南林業(yè)大學(xué)材料工程學(xué)院，昆明650224)

為改善高底物濃度酶水解過(guò)程中產(chǎn)物抑制問(wèn)題，采用三段酶水解方法，通過(guò)在水解過(guò)程中及時(shí)移除反應(yīng)產(chǎn)物纖維二糖和葡萄糖，降低產(chǎn)物抑制作用，增加酶反應(yīng)速率，從而提高酶水解得率、縮短酶反應(yīng)時(shí)間。與原料和經(jīng)NaOH預(yù)處理的桑木比較，NaOH-Fenton預(yù)處理后的桑木中木聚糖含量明顯降低，纖維素含量相對(duì)增加，木質(zhì)素含量變化較小。無(wú)論是一段水解還是三段水解，纖維素酶水解得率均隨底物質(zhì)量濃度的升高而下降。在0.30 g/mL(m/V)底物質(zhì)量濃度下，當(dāng)酶用量增加為40 U/g(以纖維素質(zhì)量計(jì))時(shí)，三段(10+10+10)h酶水解得率74.16%，比一段水解72 h得率45.61%增長(zhǎng)了62.60%，并且水解時(shí)間縮短了42 h。該研究結(jié)果對(duì)提高纖維素酶水解得率、降低纖維資源制取燃料乙醇成本具有指導(dǎo)意義。

木質(zhì)纖維原料；預(yù)處理；纖維素酶；三段酶水解

纖維素酶水解是木質(zhì)纖維原料制備燃料乙醇的重要技術(shù)步驟，酶水解的初速度和得率受水解底物濃度的影響。低底物濃度可以提高水解得率并縮短酶解時(shí)間，但設(shè)備的利用效率低，并導(dǎo)致后續(xù)酒精分離生產(chǎn)成本過(guò)高。過(guò)高的底物濃度又會(huì)使得酶解體系的黏度增加，影響傳質(zhì)效果，并形成強(qiáng)烈的產(chǎn)物抑制效應(yīng)，但高底物濃度水解將帶來(lái)高發(fā)酵糖濃度和高酒精濃度，進(jìn)而降低后續(xù)蒸餾成本，并提高整個(gè)酒精工藝的勞動(dòng)生產(chǎn)率[1-4]。

傳統(tǒng)的木質(zhì)纖維原料酶水解技術(shù)在0.10 g/mL底物質(zhì)量濃度下進(jìn)行，如果葡萄糖得率達(dá)到80%，發(fā)酵后的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)尚不到2%。而高底物濃度水解和發(fā)酵技術(shù)在以淀粉質(zhì)原料制備燃料乙醇工藝中應(yīng)用已較為成熟，當(dāng)?shù)矸鬯獾孜镔|(zhì)量濃度為0.20 g/mL時(shí)，發(fā)酵后乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%。研究表明，只有糖液發(fā)酵后的乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到4%～5%，后續(xù)的酒精分離過(guò)程才經(jīng)濟(jì)可行[5]。增加酶水解過(guò)程的底物濃度，可以提高體系中糖濃度和乙醇得率，并降低水解和發(fā)酵過(guò)程中操作費(fèi)用，減少后續(xù)酒精分離的能量消耗和成本。有研究表明，當(dāng)水解底物質(zhì)量濃度從0.05 g/mL提高至0.08 g/mL時(shí)，每加侖燃料乙醇的成本將降低20%[6-7]。但是當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過(guò)0.15 g/mL時(shí)，二步法糖化發(fā)酵技術(shù)和同步糖化發(fā)酵技術(shù)均未取得較好研究成果。主要存在以下問(wèn)題：1)高底物濃度導(dǎo)致高傳質(zhì)和傳熱阻力；2)高底物濃度帶來(lái)高發(fā)酵抑制物；3)高底物濃度引起高濃度產(chǎn)物抑制。

針對(duì)以上問(wèn)題，國(guó)內(nèi)外學(xué)者采用反應(yīng)器設(shè)計(jì)或分批補(bǔ)料技術(shù)來(lái)減少傳質(zhì)和傳熱阻力，通過(guò)及時(shí)除去生成的單糖、同步糖化發(fā)酵技術(shù)或添加外源β-葡萄糖苷酶而降低產(chǎn)物抑制作用[8-10]。

解決高底物濃度引起的高濃度產(chǎn)物抑制問(wèn)題，并建立高效利用纖維素酶各組分的酶解工藝及模式，已成為木質(zhì)纖維原料糖化研究領(lǐng)域中亟待解決的問(wèn)題。云南省大姚縣廣泛種植白桑，白桑生長(zhǎng)速度較快，桑葉用于飼料喂養(yǎng)家蠶。每年雨季前(6—10月)需修剪桑木以提高葉片生長(zhǎng)率，然而大量修剪枝條未得到較好利用。Fenton反應(yīng)可無(wú)選擇地氧化水中大多數(shù)有機(jī)物，特別適用化學(xué)或生物難降解的有機(jī)廢水氧化處理，而用于降解木質(zhì)纖維素方面的研究鮮見(jiàn)報(bào)道[11-13]。Fenton反應(yīng)能夠產(chǎn)生大量中間產(chǎn)物羥基自由基氧化分解有機(jī)物，起到解聚纖維素作用。本研究以縮短水解時(shí)間和提高水解效率為目的，以白桑枝條為原料，NaOH-Fenton反應(yīng)為預(yù)處理方式，通過(guò)不同底物濃度的纖維素酶分段水解、不同酶用量的高底物濃度分段水解及預(yù)處理前后、酶水解后原料表面形貌變化，分析高底物濃度下纖維素酶分段酶水解的可行性，為纖維素乙醇的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 原 料

桑木(MorusalbaL.)采自云南省大姚縣。纖維素酶(C2730)，由里氏木霉(ATCC 26921)生產(chǎn)，丹麥諾維信(Novozyme)生產(chǎn)，Sigma公司提供，其濾紙酶活為128.10 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活為27 U/mL。

1.2 桑木原料預(yù)處理

桑木2% NaOH預(yù)處理：將桑木粉末用2% NaOH溶液(固液比1∶10)，在65℃條件下處理2 h，待反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水洗滌固體殘?jiān)林行?。固體渣作為后續(xù)Fenton試劑預(yù)處理底物。

桑木Fenton試劑預(yù)處理：取20 g經(jīng)2% NaOH預(yù)處理的絕干桑木置于1 L三角瓶中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)30% 的H2O280 mL，16 mmol/L Fe2+溶液，固液比1∶15，使用醋酸調(diào)節(jié)pH至 3.0，在160 r/min 條件下處理12 h。反應(yīng)結(jié)束后洗滌固體渣，并進(jìn)行后續(xù)纖維素酶水解[14]。

1.3 高底物濃度纖維素酶一段水解NaOH-Fenton試劑預(yù)處理桑木

取絕干15 g NaOH-Fenton試劑預(yù)處理的桑木置于250 mL三角瓶中，加入一定量的水、檸檬酸緩沖液和纖維素酶液，使初始底物質(zhì)量濃度為0.15 g/mL，分別在3，4和5 h補(bǔ)加絕干底物質(zhì)量濃度0.05 g/mL, 使得最終反應(yīng)體系中底物質(zhì)量濃度為0.20，0.25和0.30 g/mL，酶用量為15 U/g(以總纖維素質(zhì)量計(jì)，下同)。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，置?0℃、150 r/min的搖床中反應(yīng)。分別于2，4，8，12，24，48和72 h取樣，于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取清液適當(dāng)稀釋后采用高效液相色譜(HPLC)測(cè)定反應(yīng)液中葡萄糖和纖維二糖的濃度變化，并計(jì)算酶解得率[15-16]。

1.4 高底物濃度纖維素酶(10+10+10)h三段水解NaOH-Fenton試劑預(yù)處理桑木

取絕干質(zhì)量10 g NaOH-Fenton預(yù)處理桑木于250 mL三角瓶中，加入一定量的水、檸檬酸緩沖液和纖維素酶液，使底物質(zhì)量濃度為0.10 g/mL，酶用量為15 U/g，pH為4.8。充分?jǐn)嚢杈鶆蚝?，置?0℃、150 r/min搖床中進(jìn)行第一段10 h的酶水解，然后于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，收集上清液，HPLC測(cè)定其中纖維二糖和葡萄糖的含量，計(jì)算纖維素酶水解得率。酶解渣用100 mL蒸餾水洗滌兩次，于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，收集酶解渣。將第一段洗滌后的酶解渣作為底物，添加1 mol/L檸檬酸緩沖液0.5 mL、纖維素酶3 U/g和蒸餾水，使反應(yīng)體系總體積與初始反應(yīng)一致，于pH 4.8、50℃、150 r/min的搖床中再酶解10 h后，按第一段方法進(jìn)行固液分離，將第二段的酶解渣進(jìn)行洗滌。將第二段洗滌后的酶解渣作為底物，添加1 mol/L檸檬酸緩沖液0.5 mL、纖維素酶2 U/g和蒸餾水，使反應(yīng)體系總體積與初始反應(yīng)一致，于pH 4.8、50℃、150 r/min的搖床中再酶解10 h后，按第一段方法進(jìn)行固液分離，棄用酶解渣[17]。

1.5 掃描電鏡(SEM)分析

取分段水解30 h后的預(yù)處理底物進(jìn)行掃描電鏡(SEM)觀察。掃描電鏡設(shè)備：日立HCP-2臨界點(diǎn)干燥器、日立E-1010離子濺射儀、飛利浦Quanta200電子顯微鏡。處理步驟：將經(jīng)過(guò)NaOH-Fenton預(yù)處理和30 h分段酶水解后的桑木，真空干燥，在40℃條件下處理4 h。干燥后粘于金屬臺(tái)上，真空噴金膜，采用飛利浦Quanta200電子顯微鏡進(jìn)行掃描觀察、拍照[18]，分析預(yù)處理及水解后原料表面形貌變化。

1.6 分析方法

1.6.1 水分含量測(cè)定

水分含量采用紅外線水分計(jì)FD-720測(cè)定。

1.6.2 纖維素、半纖維素和木質(zhì)素測(cè)定

樣品纖維素、半纖維素和木質(zhì)素含量根據(jù)美國(guó)可再生能源實(shí)驗(yàn)室(NREL)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試方法DE-AC3608GO28308-2008進(jìn)行測(cè)定[19]。

1.6.3 酶水解液中糖組分測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定酶水解液中糖組分。使用Agilent1100 型高效液相色譜儀，糖柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H色譜柱，流動(dòng)相為0.005 mol/L的H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫55℃。采用示差

折光檢測(cè)器檢測(cè)，外標(biāo)法測(cè)定。纖維素水解得率計(jì)算公式如下：

纖維素水解得率=

式中：C1、C2和C3分別為第一段、第二段和第三段水解液及洗液中纖維二糖和葡萄糖的質(zhì)量濃度，g/L；V1、V2和V3分別為第一段、第二段和第三段水解液及洗液體積，L；G為原料質(zhì)量，g；W為原料中纖維素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%；1.1為纖維素和葡萄糖之間轉(zhuǎn)換系數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NaOH-Fenton試劑預(yù)處理前后桑木化學(xué)成分變化

未處理桑木、NaOH預(yù)處理桑木和NaOH-Fenton預(yù)處理桑木的化學(xué)成分變化見(jiàn)表1。原料桑木化學(xué)成分中纖維素占(38.80±2.1)%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，木聚糖占(20.70±1.0)%，糖類(lèi)化合物約占原料的59.5%。經(jīng)NaOH處理(2% NaOH，65℃，2 h)后，纖維素含量提高至(42.25±1.8)%，木聚糖降低至(16.88±1.1)%，主要是由于部分半纖維素生成可溶性糖溶出，使得纖維素和木質(zhì)素在固體殘?jiān)泻肯鄬?duì)增加。經(jīng)NaOH-Fenton 試劑預(yù)處理后，桑木中纖維素含量為(53.99±1.9)%，木聚糖含量為(8.08±2.3)%，木質(zhì)素(30.44±2.0)%，95%乙醇抽出物為(3.08±2.1)%。固體殘?jiān)心揪厶堑暮孔兓畲?，表明NaOH-Fenton試劑預(yù)處理?xiàng)l件較為溫和，主要是催化半纖維素糖苷鍵發(fā)生降解，纖維素和木質(zhì)素等受到降解和破壞較少。

表1 預(yù)處理前后桑木化學(xué)成分

將桑木原料、NaOH預(yù)處理桑木和NaOH-Fenton預(yù)處理桑木在底物質(zhì)量濃度為0.10 g/mL，pH 4.8，溫度50℃，攪拌速度150 r/min，纖維素酶用量15 U/g條件下水解72 h，結(jié)果見(jiàn)圖1。經(jīng)2% NaOH預(yù)處理的桑木，72 h酶水解得率為16.13%，與未處理桑木相比增加了15.82個(gè)百分點(diǎn)；而經(jīng)NaOH-Fenton預(yù)處理的桑木，72 h酶水解得率為60.46%，分別比未經(jīng)處理和經(jīng)2% NaOH預(yù)處理的酶水解得率增加了60.15和44.33個(gè)百分點(diǎn)。木質(zhì)纖維原料是以纖維素作為骨架，半纖維素作為填充物，木質(zhì)素作為黏結(jié)劑結(jié)合而成的，被認(rèn)為是自然界中對(duì)生物作用和化學(xué)作用抗性最強(qiáng)的材料之一，因而酶水解對(duì)原料幾乎不起作用[17]。原料經(jīng)2% NaOH預(yù)處理后，其結(jié)構(gòu)受到部分破壞(部分半纖維素溶解，表1)，纖維素潤(rùn)脹，纖維素酶與纖維素的結(jié)合位點(diǎn)增加，使得酶水解得率增加。而Fenton預(yù)處理是通過(guò)模擬褐腐菌降解木質(zhì)纖維素的原理，利用Fenton反應(yīng)生成羥基自由基(·OH)破壞纖維素分子間或分子內(nèi)的氫鍵結(jié)構(gòu)，使木質(zhì)纖維素解聚，最終起到提高酶水解得率作用。

圖1 NaOH和NaOH-Fenton試劑預(yù)處理對(duì)酶水解得率的影響Fig. 1 Effect of NaOH and NaOH-Fenton pretreatment on hydrolysis yield

2.2 底物濃度對(duì)(10+10+10)h三段水解NaOH-Fenton預(yù)處理桑木影響

當(dāng)初始底物質(zhì)量濃度為0.15 g/mL，分別在3，4和5 h補(bǔ)加絕干底物質(zhì)量濃度0.05 g/mL, 使得最終反應(yīng)體系中底物質(zhì)量濃度分別為0.20，0.25和0.30 g/mL，在纖維素酶用量為15 U/g，50℃、pH 4.8 和 150 r/min 條件下進(jìn)行纖維素酶一段水解和(10+10+10)h三段水解，底物濃度對(duì)酶水解得率的影響如圖2所示。

由圖2a可知，纖維素酶一段水解NaOH-Fenton

試劑預(yù)處理桑木72 h 后，盡管水解液中纖維素降解產(chǎn)物纖維二糖和葡萄糖濃度隨底物濃度的增加而升高，但纖維素酶水解得率隨底物濃度增加而下降。當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度從0.15 g/mL升至0.30 g/mL時(shí)，48 h的水解得率由43.11%降至32.78%，72 h 水解得率由45.44%降至34.76%。這主要是高底物濃度下酶擴(kuò)散阻力增加和水解液中高濃度葡萄糖與纖維二糖對(duì)纖維素酶的反饋抑制作用增強(qiáng)的結(jié)果；與底物質(zhì)量濃度為0.10 g/mL的一段水解相比較，底物質(zhì)量濃度0.30 g/mL的水解體系中的反饋抑制更為強(qiáng)烈。本試驗(yàn)采用分段水解技術(shù)以解除高底物濃度下酶水解反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)物抑制作用。

由圖2b可知，在(10+10+10)h三段酶水解過(guò)程中，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為0.15 g/mL時(shí)，30 h 水解得率為54.82%，較一段水解72 h 的水解得率45.44%增加了20.64%；當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為0.20和0.25 g/mL時(shí)，30 h水解得率分別為52.57%和50.18%；底物質(zhì)量濃度為0.30 g/mL時(shí)，第一段、第二段和第三段的水解得率分別為19.73%，15.38%和13.30%，30 h 水解得率為48.41%，較一段水解72 h 的水解得率34.76%增加了39.27%，且水解時(shí)間縮短了42 h。研究表明，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)低時(shí)，雖然酶解得率較高，但酶解液中的還原糖濃度較低。為提高后續(xù)發(fā)酵工藝效率，需增加酶解液中還原糖濃度，因此需提高水解底物濃度。

圖2 不同底物濃度對(duì)纖維素酶一段水解(a)和(10+10+10)h三段水解(b)的影響Fig. 2 Effect of substrate concentration on one-stage (a) and three-stage (b) hydrolysis yield

由圖2b可以看出，在(10+10+10)h分段酶水解過(guò)程中，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為0.20，0.25和0.30 g/mL時(shí)，30 h水解得率變化不大。這可能是由第一段和第二段酶解殘?jiān)姓掣降母咛菨舛葘?dǎo)致的，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度高于0.20 g/mL時(shí)，盡管固體殘?jiān)?jīng)過(guò)兩次洗滌，但其纖維二糖和葡萄糖濃度仍較高，尚存在產(chǎn)物對(duì)水解反應(yīng)的抑制作用；另外，酶和底物的作用是通過(guò)酶和底物生成復(fù)合物進(jìn)行，當(dāng)?shù)孜餄舛仍龃笾聊撤N程度時(shí)，酶的活性中心被飽和或趨于飽和，反應(yīng)速度達(dá)到一個(gè)極限值，故水解得率變化不大[20]。

2.3 不同酶用量對(duì)高底物濃度纖維素酶三段(10+10+10)h水解得率影響

當(dāng)初始底物質(zhì)量濃度為0.15 g/mL時(shí)，分別在3，4和5 h補(bǔ)加絕干底物0.05 g/mL, 使得最終反應(yīng)體系中底物質(zhì)量濃度為0.30 g/mL，纖維素酶用量為20，25，30，35和40 U/g條件下，纖維素酶用量對(duì)一段水解得率的影響見(jiàn)圖3a，酶用量對(duì)(10+10+10)h三段水解得率的影響如圖3b所示。

由圖3可知，一段水解和三段水解的纖維素酶水解得率均隨酶用量的增加而升高，在底物質(zhì)量濃度0.30 g/mL條件下，酶用量增加使底物可吸附更多纖維素酶，從而提高平均酶反應(yīng)速率。當(dāng)酶用量由20 U/g升至40 U/g時(shí)，在一段酶水解中，72 h纖維素酶水解得率由23.29%升至45.61%；在三段(10+10+10)h酶水解中，30 h纖維素酶水解得率由52.59%升至74.16%。

在不同酶用量的三段(10+10+10)h酶水解過(guò)程中，第一段(0～10 h)期間酶用量對(duì)纖維素酶水解得率的影響不大；而在第二段(10～20 h)和第三段(20～30 h)中，當(dāng)酶用量為30～40 U/g時(shí)，酶水解得率呈顯著增加趨勢(shì)。當(dāng)酶用量增加至一定程度時(shí)，水解得率增加緩慢，主要是由于纖維表面最初吸附的酶形成單分子層，當(dāng)結(jié)合位點(diǎn)全部被纖維素酶分子飽和后，即使再增加過(guò)量的纖維素酶也起不到提高水解得率的作用[20]。因此，在木質(zhì)纖維原料酶水解過(guò)程中，增加纖維素酶用量在一定程度上對(duì)水解有利，可以提高水解得率，但當(dāng)纖維素酶量超過(guò)一定量后，對(duì)水解的影響不大，而且過(guò)高的纖維素酶用量將導(dǎo)致纖維素酶水解成本的增加。

圖3 纖維素酶用量對(duì)一段(a)和三段(10+10+10)h(b)酶水解得率的影響Fig. 3 Effect of enzymatic dosage on one-stage (a) and three-stage (b) hydrolysis yield

2.4 掃描電鏡(SEM)分析

圖4 分段酶水解30 h固體殘?jiān)鼟呙桦婄R圖Fig. 4 SEM micrographs of mulberry wood enzymatic hydrolyzed for 30 h

將桑木原料先后進(jìn)行NaOH-Fenton試劑預(yù)處理和30 h分段酶水解后，水解固體殘?jiān)砻嫘螒B(tài)見(jiàn)圖4。圖4a為預(yù)處理底物經(jīng)30 h酶水解后放大80倍的掃描電鏡圖，可以看出底物原本結(jié)構(gòu)緊密有序，但完全受到破壞，纖維被不規(guī)則地解聚及斷裂。在350倍掃描電鏡下觀察(圖4b)發(fā)現(xiàn)，微纖維斷裂部位，且經(jīng)預(yù)處理和酶水解后，纖維束相互分開(kāi)松散。在600倍下觀察(圖4c)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)酶水解后纖維質(zhì)地變得更為柔軟，結(jié)構(gòu)變得更為疏松，該處糖化現(xiàn)象較為明顯。在800倍下觀察(圖4d)可以看出，纖維間孔隙較大，有細(xì)小纖維剝離脫落現(xiàn)象。由掃描電鏡分析結(jié)果可見(jiàn)，桑木原料經(jīng)NaOH-Fenton預(yù)處理和纖維素酶水解后，纖維結(jié)構(gòu)受到明顯破壞，纖維長(zhǎng)鏈被降解斷開(kāi)，部分木質(zhì)纖維素已轉(zhuǎn)化為水溶性糖。

3 結(jié) 論

本研究以桑木作原料，以NaOH-Fenton為預(yù)處理方法，通過(guò)分段酶水解技術(shù)改善高底物濃度水解過(guò)程中產(chǎn)物抑制問(wèn)題。桑木經(jīng)NaOH-Fenton預(yù)處理后，木聚糖含量明顯降低，纖維素含量相對(duì)增加，木質(zhì)素含量變化較小。對(duì)于一段水解和(10+10+10)h三段水解，纖維素酶水解得率均隨底物濃度增高而下降。在底物質(zhì)量濃度為0.30 g/mL，酶用量為15 U/g時(shí)，三段水解得率48.41%，比一段水解72 h 的水解得率34.76%增加了39.27%，且水解時(shí)間縮短42 h。當(dāng)酶用量為40 U/g時(shí)，三段酶水解得率74.16%，比一段水解72 h得率45.61%增加了62.60%，且水解時(shí)間縮短42 h。在今后的研究工作中還需對(duì)預(yù)處理手段進(jìn)行改進(jìn)，并在酶反應(yīng)機(jī)制和酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方面進(jìn)行深入研究。

[1]J?RGENSEN H, VIBE-PEDERSEN J, LARSEN J, et al. Liquefaction of lignocellulose at high-solids concentrations[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2007, 96(5):862-870.

[2]WENG J, LI X, BONAWITZ N, et al. Emerging strategies of lignin engineering and degradation for cellulosic biofuel production[J]. Current Opinion in Biotechnology, 2008, 19(2):166-172.[3]CHEN M, XIA L M, XUE P. Enzymatic hydrolysis of corncob and ethanol production from cellulosic hydrolysate[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2007, 59(2):85-89.

[4]HODGE D B, KARIM M N, SCHELL D J, et al. Soluble and insoluble solids contributions to high-solids enzymatic hydrolysis of lignocellulose[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(18):8940-8948.

[5]ZACCHI G, AXELSSON A. Economic evaluation of preconcentration in production of ethanol from dilute sugar solutions[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1989, 34(2):223-233.

[6]STENBERG K, BOLLK M, RéCZEY K, et al. Effect of substrate and cellulase concentration on simultaneous saccharification and fermentation of steam-pretreated softwood for ethanol production[J]. Biotechnology and Bioengineering, 2000, 68(2):204-210.[7]WINGREN A, GALBE M, ZACCHI G. Techno-economic evaluation of producing ethanol from softwood:comparison of SSF and SHF and identification of bottlenecks[J]. Biotechnology Progress, 2003, 19(4):1109-1117.

[8]KNUTSEN J S, DAVIS R H. Cellulase retention and sugar removal by membrane ultrafiltration during lignocellulosic biomass hydrolysis[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2004, 114(1/3):585-599.

[9]YANG S, DING W Y, CHEN H Z. Enzymatic hydrolysis of rice straw in a tubular reactor coupled with UF membrane[J]. Process Biochemistry, 2006, 41(3):721-725.

[10]瞿麗莉.β-葡萄糖苷酶的分離純化及在纖維素水解上的應(yīng)用[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué), 2008. QU L L. Separation and purification ofβ-glucosidase and its application in cellulose hydrolysis[D]. Nanjing:Nanjing Forestry University, 2008.

[11]MICHALSKA K, MIAZEK K, KRZYSTEK L, et al. Influence of pretreatment with Fenton’s reagent on biogas production and methane yield from lignocellulosic biomass[J]. Bioresource Technology, 2012, 119:72-78.

[12]DE HEREDIA J B, TORREGROSA J, DOMINGUEZ J R, et al. Kinetic modelfor phenolic compound oxidation by Fenton’s reagent[J]. Chemosphere, 2001, 45:85-90.

[13]ERDEN G, FILIBELI A. Improving anaerobic biodegradability of biological sludges by Fenton pre-treatment:effects on single stage and two-stage anaerobic digestion[J]. Desalination, 2010, 251:58-63.

[14]王燕云, 楊靜. 稀堿-芬頓試劑預(yù)處理對(duì)云南苦竹酶水解得率的影響[J]. 生物質(zhì)化學(xué)工程, 2015, 49(5):17-22. WANG Y Y, YANG J. The influence of alkaline-fenton pretreatment on the enzymatic hydrolysis yield of Yunnan bamboo[J]. Biomass Chemical Engineering, 2015, 49(5):17-22.

[15]BALLESTEROS I, OLIVA J M, NEGRO M J, et al. Enzymic hydrolysis of steam exploded herbaceous agricultural waste (Brassicacarinata) at different particule sizes[J]. Process Biochemistry, 2002, 38(2):187-192.

[16]CHEN M, ZHAO J, XIA L M. Enzymatic hydrolysis of maize straw polysaccharides for the production of reducing sugars[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 71(3):411-415.

[17]楊靜. 木質(zhì)纖維原料分段酶水解技術(shù)的研究[D]. 南京：南京林業(yè)大學(xué)，2010. YANG J. Multi-stage enzymatic saccharification of lignocellulosic materials[D]. Nanjing:Nanjing Forestry University, 2010.

[18]朱圓圓, 顧夕梅, 朱均均, 等. 兩步堿法預(yù)處理對(duì)玉米秸稈組分及結(jié)構(gòu)的影響[J]. 中國(guó)科技論文, 2015, 10(12):1376-1381. ZHU Y Y, GU X M, ZHU J J, et al. Effects of two-step alkaline pretreatment on components and structure of corn stover[J]. China Science Paper, 2015, 10(12):1376-1381.

[19]SLUITER A D, HAMES B, RUIZ R O, et al. Determination of structural carbohydrates and lignin in biomass:laboratory analytical procedure[R]. Golden:National Renewable Energy Laboratory, 2008.

[20]黃愛(ài)玲, 周美華. 玉米秸稈酶水解影響因素的研究[J]. 中國(guó)資源綜合利用, 2004(8):25-27. HUANG A L, ZHOU M H. Study on affecting factor of enzymolysis corn stalk[J]. China Resources Comprehensive Utilization, 2004(8):25-27.

Multi-stage enzymatic hydrolysis in high substrate concentrationof NaOH-Fenton pretreated mulberry wood

WANG Yanyun1,2, WU Kai1,2, YANG Hang2, YANG Jing1,2*

(1. Yunnan Provincial Key Laboratory of Wood Adhesives and Glued Products, Southwest Forestry University; 2. College of Materials Engineering, Southwest Forestry University, Kunming 650224, China)

Since the large-scale bioethanol industrialization is not fully mature, as one of the main technical steps, the enzymatic hydrolysis process needs to be further studied. In this paper, the three-stage enzymatic hydrolysis method was used to solve the problem of high glucose concentration inhibition during the high substrate concentration hydrolysis process. The enzymatic hydrolysis rate was improved by the three-stage enzymatic hydrolysis method, which could increase the enzymatic hydrolysis rate and shorten the enzymatic reaction time by removing the reaction products, i.e., cellobiose and glucose, in the hydrolysis process, reducing the product inhibition and increasing the enzyme reaction rate. The hydroxyl radical produced by the fenton reaction caused the loose structure and changed the three-dimensional structure of the cellulose in the biomass, which was propitious to improve the hydrolysis efficiency of the subsequent enzyme by NaOH-Fenton pretreatment method. The results showed that 2% NaOH-Fenton pretreated sample had higher cellulose content and lower hemicellulose content compared with the materials with 2% NaOH pretreated sample. The enzymatic hydrolysis yield decreased with the increase of substrate concentration, either in one-stage or three-stages enzymatic hydrolysis. The NaOH-Fenton pretreated mulberry at 30% substrate concentration were performed the three-stage hydrolysis, using the enzyme dosage 40 U/g cellulose, and the three-stage hydrolysis could reach much higher hydrolysis yields of 74.16% in 30 h. Compared with the 72 h yield (45.61%) of the one-stage hydrolysis, a 62.60% increase in hydrolysis yield was achieved and 42 h hydrolysis time was reduced. The results have practical significance for improving the yield of cellulase hydrolysis and reducing the cost of making fuel ethanol from biomass resources.

lignocellulosic materials; pretreatment; cellulase; three-stage hydrolysis

2016-06-04

2016-09-25

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(2011FZ137)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31260162)。

王燕云，女，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)資源生物降解與轉(zhuǎn)化。通信作者：楊靜，女，副教授。E-mail:kmjingyang@163.com

TQ35

A

2096-1359(2017)02-0058-06