于 濤李 耕張成芬劉 鵬董樹亭張吉旺趙 斌

?

玉米籽粒早期發(fā)育相關(guān)蛋白的差異表達(dá)特性

于 濤1,**李 耕1,**張成芬2劉 鵬1,*董樹亭1,*張吉旺1趙 斌1

1作物生物學(xué)國家重點實驗室/ 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 山東泰安 271018;2淄博市周村職業(yè)中等專業(yè)學(xué)校, 山東淄博 255300

玉米籽粒發(fā)育早期, 代謝活動旺盛, 細(xì)胞分裂與增大活躍, 為后續(xù)貯藏物質(zhì)的合成形成充足庫容。為闡明籽粒早期發(fā)育的蛋白合成、積累與調(diào)控過程, 本研究以夏玉米品種登海661為試驗材料, 在開花期人工飽和授粉后第3、第5、第10天取果穗中部籽粒, 利用同位素標(biāo)記相對定量(iTRAQ)技術(shù)分析其蛋白差異表達(dá)特性。玉米籽粒早期發(fā)育階段總計鑒定及定量2639種蛋白, 這些蛋白涉及多種生物過程與分子功能, 其中代謝過程和分子過程是最主要的2個生物過程; 催化活性和綁定功能是最主要的2個分子功能, 這些生物過程與分子功能對籽粒早期發(fā)育具有重要作用。定量分析結(jié)果表明137種蛋白在籽粒發(fā)育早期顯著差異表達(dá), 其功能涉及蛋白代謝、脅迫響應(yīng)、細(xì)胞生長與分裂、碳水化合物與能量代謝、轉(zhuǎn)運、次生物質(zhì)代謝、淀粉合成、轉(zhuǎn)錄、油脂代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、氨基酸代謝等。其中, 表達(dá)差異較大的是與蛋白代謝、脅迫響應(yīng)、細(xì)胞生長與分裂以及碳水化合物與能量代謝相關(guān)的蛋白。表達(dá)模式聚類結(jié)果顯示這些不同功能類別的蛋白協(xié)同表達(dá), 共同調(diào)控玉米籽粒的早期發(fā)育。

玉米; 籽粒早期發(fā)育; iTRAQ; 蛋白質(zhì)組學(xué); 蛋白功能

玉米籽粒發(fā)育一般劃分為3個階段, 即早期發(fā)育、灌漿期與成熟期[1]。其早期發(fā)育階段是一個關(guān)鍵時期, 一般從授粉到授粉后第12天。在此期間, 籽粒細(xì)胞經(jīng)歷核內(nèi)復(fù)制、細(xì)胞化、細(xì)胞分化、分裂等過程, 其胚乳細(xì)胞數(shù)量與體積持續(xù)增大, 進(jìn)而為后續(xù)營養(yǎng)物質(zhì)的貯藏奠定基礎(chǔ)[2]。玉米籽粒早期發(fā)育過程中的胚乳細(xì)胞增殖受內(nèi)源激素和相關(guān)酶活性的直接或者間接調(diào)控, 胚乳細(xì)胞數(shù)目與粒重呈極顯著正相關(guān)關(guān)系[3]。早期發(fā)育階段也是籽粒極易敗育的時期, 籽粒敗育顯著影響玉米穗粒數(shù)和產(chǎn)量的進(jìn)一步提高[4-5]。因此, 探明玉米籽粒早期發(fā)育復(fù)雜的生理生化過程及潛在的分子調(diào)控機(jī)理對提升籽粒產(chǎn)量具有重要意義。

近年來, 已有不少研究在轉(zhuǎn)錄水平上探討玉米籽粒發(fā)育的分子調(diào)控過程。轉(zhuǎn)錄組學(xué)的相關(guān)結(jié)果表明, 涉及激素代謝、細(xì)胞壁代謝、細(xì)胞循環(huán)、氨基酸代謝、DNA及蛋白合成的基因在玉米籽粒早期大量表達(dá), 顯示出這些過程與籽粒早期發(fā)育密切相關(guān)[6-7]。然而, 蛋白才是細(xì)胞活性和功能的最終執(zhí)行者, 由于存在轉(zhuǎn)錄后修飾與翻譯后修飾, mRNA表達(dá)水平與其對應(yīng)蛋白之間并沒有顯著一致性[8]。因此, 有必要在蛋白質(zhì)組學(xué)水平上探討籽粒發(fā)育過程中的蛋白表達(dá)特性。研究發(fā)現(xiàn)小麥籽粒發(fā)育早期249種蛋白存在差異表達(dá), 主要涉及碳代謝、細(xì)胞分化、細(xì)胞骨架、蛋白合成以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 表明這些過程對小麥籽粒的早期發(fā)育具有重要作用[9]。Méchin等[10]在玉米胚乳中鑒定到496種蛋白, 主要參與代謝、蛋白合成、細(xì)胞防御、死亡及老化等過程。Jin等[11]研究了玉米籽粒灌漿期的蛋白表達(dá)特性, 在胚乳中發(fā)現(xiàn)39種差異蛋白, 主要涉及糖酵解與氧化還原平衡反應(yīng); 胚中發(fā)現(xiàn)43種差異蛋白, 主要參與油脂代謝過程。Huang等[12]研究了玉米籽粒成熟期的耐脫水機(jī)制, 發(fā)現(xiàn)11種脅迫響應(yīng)蛋白與籽粒的耐脫水能力顯著相關(guān)。然而, 有關(guān)玉米籽粒早期發(fā)育階段蛋白表達(dá)特性與功能分布的研究鮮見報道。

基于傳統(tǒng)凝膠的雙向電泳技術(shù)一直是植物蛋白質(zhì)組學(xué)最主要的研究方法[13-15]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的迅速發(fā)展, 同位素標(biāo)記相對定量(iTRAQ)技術(shù)已經(jīng)成為植物蛋白質(zhì)組學(xué)研究的重要工具之一。該技術(shù)能夠在復(fù)雜的樣品中高通量地鑒定蛋白, 并且提供精確的定量信息[16-17]。因此, 本文利用iTRAQ技術(shù)分析了玉米籽粒早期發(fā)育階段蛋白的表達(dá)特性, 通過鑒定差異表達(dá)蛋白并分析其生物學(xué)功能, 進(jìn)而闡明籽粒早期發(fā)育階段相關(guān)分子調(diào)控機(jī)理, 為探索促進(jìn)玉米籽粒早期發(fā)育, 進(jìn)而提高籽粒產(chǎn)量提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以高產(chǎn)夏玉米品種登海661為試驗材料, 在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)黃淮海玉米區(qū)域技術(shù)創(chuàng)新中心(36.09°N, 117.09°E)和作物生物學(xué)國家重點實驗室進(jìn)行相關(guān)試驗。播種前精細(xì)整地, 造墑, 種植密度為67 500株hm–2。田間管理按照常規(guī)高產(chǎn)栽培技術(shù)管理, 生育期內(nèi)肥水供應(yīng)充足, 及時預(yù)防病蟲草害。吐絲期, 選擇生長發(fā)育一致的玉米植株掛牌標(biāo)記, 開花期人工飽和授粉。在授粉后的第3、第5、第10天分別取3個玉米果穗作為生物學(xué)重復(fù)。隨后, 將每個果穗等分為上、中、下三部分, 迅速剝離中部籽粒后液氮速凍, 置-80℃冰箱保存。

1.2 蛋白提取

采用三氯乙酸-丙酮法獨立提取每個生物學(xué)重復(fù)玉米籽?？偟鞍?。稱取1 g籽粒樣品于液氮中研磨并懸浮于10倍體積預(yù)冷的-20℃丙酮溶液中(含10%三氯乙酸)。充分混勻后, 于-20℃靜置2 h, 4℃、20 000′離心30 min, 棄上清液。重復(fù)用預(yù)冷的-20℃丙酮溶液懸浮沉淀并離心多次直至沉淀基本為白色, 后將沉淀真空干燥。稱取0.2 g沉淀于3 mL裂解液(8 mol L–1Urea, 30 mmol L–1HEPES, 1 mmol L–1PMSF, 2 mmol L–1EDTA, 10 mmol L–1DTT)中提取籽粒蛋白。4℃、20 000′離心30 min, 取上清液, 加入DTT至終濃度10 mmol L–1, 56℃水浴1 h, 隨后迅速加入IAM至終濃度55 mmol L–1, 暗室靜置1 h?；旌虾蟮臉悠分屑尤?倍體積預(yù)冷的-20℃丙酮溶液,-20℃靜止3 h, 4℃、20 000′離心30 min。取沉淀溶解于400 μL的復(fù)溶液(0.5 mol L–1TEAB, 0.1% SDS)中, 4℃、20 000′再次離心30 min, 取上清液。采用蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。

1.3 蛋白消化與肽段標(biāo)記

取100 μg蛋白樣品加入3.3 μg胰蛋白酶, 37℃水浴24 h。再次補(bǔ)加胰蛋白酶1 μg, 37℃水浴24 h。真空離心泵抽干肽段, 加入40 μL 0.5 mol L–1TEAB及60 μL異丙醇重新溶解肽段。按照試劑盒說明, 每組生物學(xué)重復(fù)中的授粉后第3、第5、第10天的籽粒蛋白樣品用iTRAQ試劑中的113、114、115分別標(biāo)記(AB SCIEX, Framingham, MA, USA)。3個標(biāo)記的蛋白樣品經(jīng)室溫培養(yǎng)2 h, 混合后真空干燥。

1.4 強(qiáng)陽離子交換色譜與質(zhì)譜鑒定

將混合后的肽段樣品溶于10倍體積的緩沖液A (10 mmol L–1KH2PO4, 25%乙腈, pH 3.0)。采用島津高效液相色譜系統(tǒng)并裝配強(qiáng)陽離子交換色譜柱(250.0 mm × 4.6 mm, 5 μm, 100 ?)洗脫肽段。洗脫液B (10 mmol L–1KH2PO4, 2 mol L–1KCl, 25%乙腈, pH 3.0)的流速為1 mL min–1并設(shè)置分級梯度(0, 45 min; 0~5%, 1 min; 5%~30%, 20 min; 30%~50%, 5 min并維持5 min; 50%~100%, 5 min并維持10 min)。在241 nm吸光度下檢測, 篩選得到16個組分, 將每個組分用StrataX除鹽, 低溫離心抽干,-80℃保存。質(zhì)譜分析使用納升液相系統(tǒng)(Shimadzu, Kyoto, Japan)并連接Q-Exactive質(zhì)譜分析儀(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)。對3組生物學(xué)重復(fù)進(jìn)行獨立的質(zhì)譜分析, 每組包括3個時期(3 d, 5 d, 10 d)的肽段樣品, 并且采用Ma等[17]的試驗方法進(jìn)行質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置。

1.5 蛋白鑒定與相對定量

采用 MASCOT軟件(版本2.3.01, Matrix Science, London, UK)以及Proteome Discoverer軟件(版本1.3, Thermo Fisher Scientific, MA, USA)對蛋白進(jìn)行定性及定量分析。將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)自動匹配Uniprot玉米蛋白數(shù)據(jù)庫。搜索參數(shù)設(shè)置, 以胰蛋白酶作為消化類型, 并且允許1個最大的酶漏切位點; 固定修飾采用半胱氨酸, 可變修飾采用iTRAQ 8-plex(K)、iTRAQ 8-plex(Y)、iTRAQ 8-plex(N-term)及Oxidation(M); 肽段質(zhì)量誤差為15 U; 串聯(lián)質(zhì)譜誤差為0.1 Da。蛋白至少含有一個唯一肽段, 并且陽性結(jié)果錯誤率(FDR)≤1%才被認(rèn)為鑒定有效。對于蛋白定量, 在每一個生物學(xué)重復(fù)中以授粉后第3天的籽粒樣品為參考, 將后續(xù)2個時期的蛋白樣品分別與之比對。只有蛋白的定量信息至少存在于2次的生物學(xué)重復(fù)中才作進(jìn)一步分析。以3次生物學(xué)重復(fù)的平均值作為最終蛋白表達(dá)倍率。籽粒發(fā)育過程中, 定義平均相對表達(dá)水平上調(diào)或下調(diào)差異大于1.5倍, 并且在統(tǒng)計學(xué)ANOVA檢驗上<0.05的蛋白為顯著差異表達(dá)的蛋白。

1.6 生物信息學(xué)及聚類分析

鑒定及量化的玉米籽粒蛋白按照生物過程(biological process)、分子功能(molecular function)、細(xì)胞組成(cellular component)的功能范疇進(jìn)行基因本輪(GO)注釋。進(jìn)一步, 對這些蛋白根據(jù)KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋及歸類。采用Cluster 3.0軟件對籽粒發(fā)育過程中差異蛋白進(jìn)行表達(dá)模式聚類分析, 聚類參數(shù)為相似性及歐氏距離。對聚類結(jié)果采用Java TreeView軟件進(jìn)行可視化處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米籽粒蛋白的GO分析及KEGG分析

用iTRAQ技術(shù)分析玉米籽粒早期發(fā)育階段3個時期的籽粒蛋白樣品, 總計2639種蛋白被成功鑒定和定量。GO注釋分析發(fā)現(xiàn)玉米籽粒蛋白參與多重生物過程, 具有多種分子功能。生物過程中, 代謝過程和分子過程所占的比例最高; 分子功能中, 催化活性和綁定功能所占的比例最高; 細(xì)胞組成中, 細(xì)胞和細(xì)胞器所占的比例最高(圖1)。

進(jìn)一步運用KEGG數(shù)據(jù)庫對這些蛋白進(jìn)行功能歸類。如圖2所示, 玉米籽粒中的蛋白涉及多樣的代謝通路, 最主要的10個代謝通路分別是代謝途徑(metabolic pathways, 1202種)、次生代謝物合成(biosynthesis of secondary metabolites, 683種)、碳代謝(carbon metabolism, 263種)、氨基酸合成(biosynthesis of amino acids, 246種)、核糖體(ribosome, 238種)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工(protein processing in endoplasmic reticulum, 171種)、RNA轉(zhuǎn)運(RNA transport, 164種)、糖酵解/糖異生(glycolysis/gluconeogenesis, 149種)、剪接體(spliceosome, 143種)以及淀粉與蔗糖代謝(starch and sucrose metabolism, 117種)。

1: 代謝過程; 2: 分子過程; 3: 單一生物過程; 4: 刺激應(yīng)答; 5: 細(xì)胞成分組織; 6: 生物過程調(diào)控; 7: 定位; 8: 發(fā)育過程; 9: 多細(xì)胞組織過程; 10: 信號; 11: 再生; 12: 其他; 13: 多機(jī)體過程; 14: 催化活性; 15: 綁定; 16: 結(jié)構(gòu)分子活性; 17: 轉(zhuǎn)運因子活性; 18: 分子功能調(diào)控; 19: 抗氧化活性; 20: 電荷載體活性; 21: 營養(yǎng)受體活性; 22: 其他; 23: 細(xì)胞; 24: 細(xì)胞器; 25: 細(xì)胞膜; 26: 大分子復(fù)合物; 27: 膜結(jié)合腔體; 28: 細(xì)胞間區(qū)域; 29: 胞間連絲; 30: 共質(zhì)體; 31: 其他。

1: metabolic process; 2: cellular process; 3: single-organism process; 4: response to stimulus; 5: cellular component organization or biogenesis; 6: biological regulation; 7: localization; 8: developmental process; 9: multicellular organismal process; 10: signaling; 11: reproduction; 12: other; 13: multi-organism process; 14: catalytic activity; 15: binding; 16: structural molecule activity; 17: transporter activity; 18: molecular function regulator; 19: antioxidant activity; 20: electron carrier activity; 21: nutrient reservoir activity; 22: other; 23: cell; 24: organelle; 25: membrane; 26: macromolecular complex; 27: membrane-enclosed lumen; 28: extracellular region; 29: cell junction; 30: symplast; 31: other.

A: 代謝途徑; B: 次生代謝物合成; C: 碳代謝; D: 氨基酸合成; E: 核糖體; F: 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工; G: RNA轉(zhuǎn)運; H: 糖酵解/糖異生; I: 剪接體; J: 淀粉與蔗糖代謝。

A: metabolic pathways; B: biosynthesis of secondary metabolites; C: carbon metabolism; D: biosynthesis of amino acids; E: ribosome; F: protein processing in endoplasmic reticulum; G: RNA transport; H: glycolysis/gluconeogenesis; I: spliceosome; J: starch and sucrose metabolism.

2.2 籽粒早期發(fā)育階段差異蛋白表達(dá)量的分析與功能分類

定量分析顯示137個蛋白在3個時期出現(xiàn)顯著差異表達(dá)(<0.05)(見附表1)。按照蛋白數(shù)據(jù)庫預(yù)測的生物學(xué)功能將這些差異蛋白劃分為12種功能類別(表2)。其中, 差異蛋白所占比例最大的4種功能類別分別是蛋白代謝(31%)、脅迫響應(yīng)(17%)、細(xì)胞生長與分裂(13%)以及碳水化合物與能量代謝(12%), 表明這4種功能類別在籽粒早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。其他的功能類別包括轉(zhuǎn)運(4%)、次生物質(zhì)代謝(4%)、淀粉合成(4%)、轉(zhuǎn)錄(4%)、油脂代謝(3%)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(3%)、氨基酸代謝(1%)及未分類蛋白(4%)(表2)。

進(jìn)一步聚類分析表明差異蛋白主要為四大類表達(dá)模式(圖3)。表達(dá)模式c1包含64種蛋白, 其在授粉后第3、第10天均顯著積累, 而在授粉后第5天表達(dá)水平最低, 這些蛋白主要涉及蛋白代謝(32種)、細(xì)胞生長與分裂(14種); 表達(dá)模式c2僅包含8種蛋白, 且在授粉后第3天具有表達(dá)高峰; 表達(dá)模式c3包含43種蛋白, 與表達(dá)模式c1正好相反, 在授粉后第5天顯著積累, 這些蛋白主要參與脅迫響應(yīng)(10種)、蛋白代謝(8種)、碳水化合物與能量代謝(8種); 表達(dá)模式c4包含22種蛋白, 其表達(dá)水平在授粉后第10 天最高, 這些蛋白主要涉及碳水化合物與能量代謝(7種)、脅迫響應(yīng)(6種)(表2)。

3 討論

玉米籽粒發(fā)育是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程, 其中早期發(fā)育階段是一個關(guān)鍵時期, 在此期間, 胚乳細(xì)胞數(shù)目與體積快速增大, 進(jìn)而為后續(xù)營養(yǎng)物質(zhì)的貯藏奠定基礎(chǔ)[1-2]。本研究為充分解析在這一階段的蛋白表達(dá)特性及其調(diào)控過程, 利用iTRAQ技術(shù)對授粉后第3、第5、第10天的籽粒進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。成功鑒定及定量總計2639種蛋白, 其數(shù)量顯著高于過去以雙向電泳技術(shù)為基礎(chǔ)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[10-12], 表明iTRAQ技術(shù)的高通量特性。定量分析顯示137種蛋白在籽粒發(fā)育早期顯著差異表達(dá), 主要涉及蛋白代謝、脅迫響應(yīng)、細(xì)胞生長與分裂以及碳水化合物與能量代謝(表2和附表1)。這些結(jié)果與玉米籽粒轉(zhuǎn)錄組[6-7]以及小麥籽粒蛋白質(zhì)組學(xué)研究結(jié)果[9]相一致, 表明多重代謝途徑參與了籽粒的早期發(fā)育。

圖中3列分別代表授粉后天數(shù)(3、5、10 d), 每行代表單個蛋白, 左側(cè)是對蛋白聚類, 右側(cè)是表達(dá)模式, 紅色代表上調(diào)表達(dá), 綠色代表下調(diào)表達(dá)。左上方彩條的顏色強(qiáng)度代表不同蛋白表達(dá)量的變化。

The columns represent three development stages (3, 5, and 10 days), the rows represent the individual protein. The protein cluster is on the left and the expression pattern is showed on the right. The up- or down-regulated proteins are indicated in red and green, respectively. The intensity of the colors increases with increasing expression level as noted on the color bar on the top left side.

細(xì)胞快速增殖是籽粒發(fā)育早期的主要過程[2]。相對應(yīng)的, 18種涉及細(xì)胞生長與分裂的蛋白(如DNA replication licensing factor MCM3 homolog 1、Histone、tubulin alpha-3 chain等)在籽粒發(fā)育早期差異表達(dá), 并且主要在授粉后第3、第10天顯著積累(c1, 表2)。其中, α-3鏈微管蛋白(tubulin alpha-3 chain)作為骨架蛋白可以通過調(diào)控細(xì)胞器以及染色體的分離, 參與細(xì)胞循環(huán)中的分裂與擴(kuò)大過程[18]。該蛋白同樣在小麥籽粒發(fā)育早期顯著積累[9], 可見α-3鏈微管蛋白的差異表達(dá)與玉米籽粒早期發(fā)育階段快速的細(xì)胞增殖密切相關(guān)。同時, 還發(fā)現(xiàn)4種差異蛋白(auxin-induced protein PCNT115、colorless 2、gibberellin receptor GID1L2和isopentenyl transferase IPT8)參與籽粒的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程, 其中生長素誘導(dǎo)蛋白PCNT115參與IAA的信號轉(zhuǎn)導(dǎo), 赤霉素受體GID1L2參與GA3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(見附表1)。研究發(fā)現(xiàn)IAA對籽粒灌漿和粒重的形成起調(diào)節(jié)作用, 這種調(diào)節(jié)作用可能是通過調(diào)控胚乳細(xì)胞的分裂和增加庫強(qiáng)來實現(xiàn)[19], 而GA3在玉米胚乳細(xì)胞增殖和籽粒灌漿早期含量最高[20]。因此, 推測這2種蛋白的顯著差異表達(dá)提升了IAA與GA3的信號傳導(dǎo)過程, 進(jìn)而促進(jìn)籽粒發(fā)育早期的胚乳細(xì)胞增殖。

表2 玉米籽粒早期發(fā)育階段差異蛋白在不同表達(dá)模式中的功能分布

蛋白幾乎調(diào)控細(xì)胞內(nèi)所有的生理生化反應(yīng), 同時還作為結(jié)構(gòu)蛋白以及信號分子影響細(xì)胞進(jìn)程。因此, 蛋白的合成包括起始、延長及終止過程都對籽粒發(fā)育具有重要作用[21]。本研究中, 蛋白代謝是包含差異蛋白數(shù)目最多的功能類別(表2), 主要包括參與蛋白合成途徑的蛋白, 如翻譯起始因子(如eukaryotic initiation factor 4A等)、延長因子(如elongation factor 1-alpha等)以及一系列的核糖體蛋白(如40S ribosomal protein、60S ribosomal protein等), 這些蛋白主要在授粉后第3、第10天顯著積累(c1, 表2), 顯示出活躍的蛋白合成過程, 以滿足快速的細(xì)胞增殖對新生蛋白的需求。其中, 核糖體蛋白不但參與蛋白的合成途徑, 還參與細(xì)胞的生長與死亡過程, 核糖體蛋白突變會引起植物細(xì)胞的生長缺陷[22]。在小麥[17]和水稻[23]中的研究發(fā)現(xiàn)籽粒發(fā)育早期存在活躍的蛋白周轉(zhuǎn)與重排過程。本研究中, 4個差異蛋白(polyubiquitin-like protein isoform 1、putative ubiquitin-conjugating enzyme family和2個proteasome subunit alpha type)參與泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)。該系統(tǒng)是真核細(xì)胞中主要的蛋白水解途徑, 可通過調(diào)節(jié)蛋白合成與水解的比例在多重生理過程中, 如細(xì)胞循環(huán)、細(xì)胞形態(tài)及脅迫響應(yīng)等發(fā)揮重要作用[24]。定量分析顯示這些泛素26S蛋白酶體系統(tǒng)相關(guān)蛋白主要在授粉后第3、第10天顯著表達(dá)(c1, 見附表1), 表明玉米籽粒發(fā)育早期同樣存在活躍的蛋白周轉(zhuǎn)與重排過程, 這對籽粒早期發(fā)育具有重要作用。

玉米籽粒早期發(fā)育階段需要大量的能量以及代謝物[25],而中心碳代謝能夠為多種代謝途徑提供必要的能量與中間產(chǎn)物, 并且中間產(chǎn)物的濃度梯度還可以作為信號分子調(diào)控生理過程[28]。本研究中, 17種碳水化合物與能量代謝相關(guān)的差異蛋白主要涉及糖酵解(如fructokinase-2、glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase、pyruvate kinase、triosephosphate isomerase等)、磷酸戊糖途徑(如6-phosphogluconolactonase、glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase)以及氧化磷酸化(如ATP synthase epsilon chain、cytochrome c、NADH-ubiquinone oxidoreductase 13 kD-B subunit等)(見附表1)。Lee等[23]研究發(fā)現(xiàn)糖酵解相關(guān)酶在水稻籽粒發(fā)育早期顯著積累, 活躍的糖酵解途徑為籽粒發(fā)育提供了大量能量。本研究中, 玉米籽粒的糖酵解相關(guān)酶主要在授粉后第5、第10天顯著表達(dá)(c3、c4, 見附表1), 氧化磷酸化相關(guān)酶主要在授粉后第5天顯著積累(c3, 見附表1), 說明玉米籽粒早期同樣存在活躍的糖酵解以及氧化磷酸化途徑, 進(jìn)而產(chǎn)生更多的能量以滿足其生長發(fā)育的高能量需求。磷酸戊糖途徑作為重要的植物代謝途徑, 主要為其他代謝過程提供必要的還原力與磷酸戊糖[29]。2種差異蛋白涉及磷酸戊糖途徑, 其中6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯酶(6-phosphogluconolactonase)在授粉后第10天顯著積累, 而1,6-磷酸葡萄糖脫氫酶(glucose-6-phosphate 1-dehydrogenase)在授粉后第3天顯著積累(見附表1)。研究發(fā)現(xiàn)籽粒發(fā)育早期快速的細(xì)胞分裂需要大量脂肪酸與核酸的供應(yīng), 而活躍的磷酸戊糖途徑能夠為脂肪酸與核酸的合成提供必需的還原力與磷酸戊糖[27]。此外, 本研究還發(fā)現(xiàn)5種差異蛋白(glucose-1-phosphate adenylyltransferase、granule bound starch synthase IIa precursor、soluble starch synthase I, chloroplastic/amyloplastic、soluble starch synthase III、starch branching enzyme IIb)與淀粉合成相關(guān), 并且在授粉后第5天顯著積累(c3, 見附表1)。研究發(fā)現(xiàn)在玉米籽粒的發(fā)育早期就已經(jīng)觀察到少量淀粉粒的出現(xiàn)[28], 這些差異表達(dá)的淀粉合成相關(guān)酶可能參與了玉米籽粒的早期淀粉合成。

籽粒發(fā)育過程中不可避免地遭受多重脅迫環(huán)境, 因此, 快速、協(xié)調(diào)的脅迫響應(yīng)機(jī)制對保護(hù)籽粒發(fā)育具有重要意義。籽粒發(fā)育早期, 種皮還未成熟, 氧氣易通過滲透作用進(jìn)入籽粒內(nèi)部, 同時該階段進(jìn)行著活躍的代謝反應(yīng), 籽粒細(xì)胞內(nèi)部會源源不斷地產(chǎn)生活性氧類物質(zhì)(ROS)[29]。過多積累的ROS會產(chǎn)生毒害作用, 進(jìn)而損傷細(xì)胞組件及功能蛋白。已有研究報道積累過多的ROS會導(dǎo)致龍眼籽粒的敗育[30], 而植物細(xì)胞可以啟動多重的抗氧化途徑來清除過多的ROS, 穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)ROS的平衡[31]。本研究中, 多重的脅迫響應(yīng)相關(guān)蛋白在籽粒發(fā)育早期差異表達(dá), 其中包含一系列的抗氧化酶(如APx1-cytosolic ascorbate peroxidase、glutathione S-transferase 6、peroxiredoxin-5、superoxide dismutase、thioredoxin等)(見附表1), 表明籽粒發(fā)育早期存在多樣的抗氧化酶系統(tǒng), 協(xié)同維護(hù)了ROS的體內(nèi)平衡。同時, 同一蛋白的不同亞型表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式, 如3種硫氧還原蛋白(thioredoxin), 一種在授粉后第3、第10天均顯著積累(c1), 其余的2種分別在授粉后第5、第10天顯著積累(c3、c4, 見附表1)。這表明籽粒不同發(fā)育時期不同的蛋白亞型發(fā)揮作用, 這也與小麥中的研究結(jié)果相一致[17]。同時, 一些差異蛋白(如cystatin、lipoxygenase、subtilisin-chymotrypsin inhibitor CI-1B等)還參與其他的脅迫響應(yīng)過程。其中, 脂氧合酶(lipoxygenase)是植物體內(nèi)一類重要同工酶, 在植物的生長發(fā)育、成熟衰老以及抵御機(jī)械傷害和病蟲侵染等逆境過程起重要的調(diào)節(jié)作用[32]。生物脅迫或者非生物脅迫條件下, 脂氧合酶被誘導(dǎo)積累, 顯著增強(qiáng)了植物的耐脅迫能力,同時該蛋白還可以通過合成茉莉酸進(jìn)而直接調(diào)控脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[33]。本研究中, 3種脂氧合酶亞型分別在授粉后第3、第5、第10天顯著積累(c2、c3、c4, 見附表1), 可見脂氧合酶在籽粒發(fā)育早期對抵御生物、非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用。

此外, 本研究中還發(fā)現(xiàn)一些差異蛋白涉及油脂代謝、轉(zhuǎn)錄、次生物質(zhì)代謝、轉(zhuǎn)運及氨基酸代謝, 表明這些過程同樣參與籽粒的早期發(fā)育(表2和附表1)。其中, 參與氨基酸代謝的-腺苷甲硫氨酸合酶(-adenosylmethionine synthase)能夠催化甲硫氨酸和ATP反應(yīng)生成-腺苷甲硫氨酸(SAM)。一方面, SAM可以作為甲基供體參與植物的轉(zhuǎn)甲基、轉(zhuǎn)氨丙基、轉(zhuǎn)硫反應(yīng)等重要的生理代謝過程; 另一方面, SAM也是乙烯及多胺生物合成的前體, 而乙烯與多胺作為植物生長調(diào)節(jié)劑調(diào)控了植物多重生理生化反應(yīng)[34]。研究發(fā)現(xiàn)乙烯與多胺參與玉米籽粒的構(gòu)建過程[35]。本研究中, 2種-腺苷甲硫氨酸合酶在授粉后第3天顯著積累(c1, 見附表1), 推測其可能通過調(diào)控乙烯與多胺的合成參與籽粒的早期發(fā)育。

[1] Sabelli P A, Larkins B A. The development of endosperm in grasses.,2009, 149: 14–26

[2] 曠仁平, 姜孝成, 劉姜瑾, 張春來, Adrian S. 胚乳的發(fā)育及其調(diào)控. 植物生理學(xué)報, 2006, 42: 182–190 Kuang R P, Jiang X C, Liu J J, Zhang C L, Adrian S. Endosperm development and its regulation.,2006, 42: 182–190 (in Chinese with English abstract)

[3] 左振朋, 王婧, 董魯浩, 馬登超, 孫慶泉, 董樹亭. 不同品質(zhì)類型玉米籽粒充實期的胚乳細(xì)胞增殖與生理活性比較. 作物學(xué)報, 2010, 36: 848–855 Zuo Z P, Wang J, Dong L H, Ma D C, Sun Q Q, Dong S T. Comparison of multiplication of endosperm cell and physiological activity in developing kernels among normal corn, glutinous corn, and pop corn.,2010, 36: 848–855 (in Chinese with English abstract)

[4] 趙久然, 陳國平. 不同時期遮光對玉米籽粒生產(chǎn)能力的影響及籽粒敗育過程的觀察. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 1990, 23(4): 28–34 Zhao J R, Chen G P. Effect of shading treatment at different stages of plant development on grain production of corn (L.) and observations of tip kernel abortion., 1990, 23(4): 28–34 (in Chinese with English abstract)

[5] 孟佳佳, 董樹亭, 石德楊, 張海燕. 玉米雌穗分化與籽粒發(fā)育及敗育的關(guān)系. 作物學(xué)報, 2013, 39: 912–918 Meng J J, Dong S T, Shi D Y, Zhang H Y. Relationship of ear differentiation with kernel development and barrenness in maize (L.)., 2013, 39: 912–918 (in Chinese with English abstract)

[6] Li G S, Wang D F, Yang R L, Logan K, Chen H, Zhang S S, Skaggs M I, Lloyd A, Burnett W J, Laurie J D, Hunter B G, Dannenhoffer J M, Larkins B A, Drews G N, Wang X F, Yadegari R. Temporal patterns of gene expression in developing maize endosperm identified through transcriptome sequencing.2014, 111: 7582–7587

[7] Chen J, Zeng B, Zhang M, Xie S, Wang G, Hauck A. Dynamic transcriptome landscape of maize embryo and endosperm deve-lopment.,2014, 166: 252–264

[8] Hajduch M, Hearne L B, Miernyk J A, Casteel J E, Joshi T, Agrawal G K. Systems analysis of seed filling in Arabidopsis: using general linear modeling to assess concordance of transcript and protein expression., 2010, 152: 2078–2087

[9] Nadaud I, Girousse C, Debiton C, Chambon C, Bouzidi M F, Martre P. Proteomic and morphological analysis of early stages of wheat grain development., 2010, 10: 2901–2910

[10] Méchin V, Balliau T, Chateau-Joubert S, Davanture M, Langella O, Négroni L. A two-dimensional proteome map of maize endosperm.2004, 65: 1609–1618

[11] Jin X, Fu Z, Ding D, Li W, Liu Z, Tang J. Proteomic identification of genes associated with maize grain-filling rate.,2013, 8: e59353

[12] Huang H, M?ller I M, Song S Q. Proteomics of desiccation tole-rance during development and germination of maize embryos., 2011, 75: 1247–1262

[13] 吳林坤, 陳軍, 吳紅淼, 王娟英, 秦賢金, 張重義, 林文雄. 地黃連作脅迫響應(yīng)機(jī)制的塊根蛋白質(zhì)組學(xué)分析. 作物學(xué)報, 2016, 42: 243–254 Wu L K, Chen J, Wu H M, Wang J Y, Qin X J, Zhang Z Y, Lin W X. Comparative proteomics analysis oftuber root in response to consecutive monoculture., 2016, 42: 243–254 (in Chinese with English abstract)

[14] 韓平安, 逯曉萍, 米福貴, 張瑞霞, 李美娜, 薛春雷, 董婧, 叢夢露. 基于蛋白質(zhì)組學(xué)的高丹草苗期雜種優(yōu)勢分析. 作物學(xué)報, 2016, 42: 696–705 Han P A, Lu X P, Mi F G, Zhang R X, Li M N, Xue C L, Dong J, Cong M L. Analysis of heterosis in sorghum-sudan grass hybrid seedlings based on proteomics., 2016, 42: 696–705 (in Chinese with English abstract)

[15] 于濤, 李耕, 劉鵬, 董樹亭, 張吉旺, 趙斌, 柏晗. 玉米早期發(fā)育階段粒位效應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2016, 49: 54–68 Yu T, Li G, Liu P, Dong S T, Zhang J W, Zhao B, Bai H. Proteomics analysis of grain position effects during early developmental stages of maize., 2016, 49: 54–68 (in Chinese with English abstract)

[16] Lilley K S, Razzaq A, Dupree P. Two-dimensional gel electrophoresis: recent advances in sample preparation, detection and quantitation., 2002, 6: 46–50

[17] Ma C, Zhou J, Chen G, Bian Y, Lv D, Li X, Wang Z, Yan Y. iTRAQ-based quantitative proteome and phosphoprotein characterization reveals the central metabolism changes involved in wheat grain development.,2014, 15: 1–20

[18] Wasteneys G O, Yang Z. New views on the plant cytoskeleton., 2004, 136: 3884–3891

[19] 孫慶泉, 吳元奇, 胡昌浩, 董樹亭, 榮廷昭, 張穎. 不同產(chǎn)量潛力玉米籽粒胚乳細(xì)胞增殖與籽粒充實期的生理活性. 作物學(xué)報, 2005, 31: 612–618Sun Q Q, Wu Y Q, Hu C H, Dong S T, Rong T Z, Zhang G Y.Physiological activities and multiplication of endosperm cell at filling stage of kernels with different yield potential in maize., 2005, 31: 612–618 (in Chinese with English abstract)

[20] 徐云姬, 顧道健, 張博博, 張耗, 王志琴, 楊建昌. 玉米果穗不同部位籽粒激素含量及其與胚乳發(fā)育和籽粒灌漿的關(guān)系. 作物學(xué)報, 2013, 39: 1452–1461 Xu Y J, Gu D J, Zhang B B, Zhang H, Wang Z Q, Yang J C.Hormone contents in kernels at different positions on an ear and their relationship with endosperm development and kernel filling in maize., 2013, 39: 1452–1461 (in Chinese with English abstract)

[21] Miernyk J A. Seed proteomics.2011, 74: 389–400

[22] Schippers J H M, Mueller-Roeber B. Ribosomal composition and control of leaf development.,2010, 179: 307–315

[23] Lee J, Koh H J. A label-free quantitative shotgun proteomics analysis of rice grain development.,2011, 9: 1–10

[24] Zhang Z Y, Li J H, Liu H H, Chong K, Xu Y Y. Roles of ubiquitination-mediated protein degradation in plant responses to abiotic stresses.,2015, 114: 92–103

[25] Gutierrez-Marcos J F, Costa L M, Evans M M S. Maternal gametophytic baseless1 is required for development of the central cell and early endosperm patterning in maize ().2006, 174: 317–329

[26] Gutierrez L, VanW O, Castelain M, Bellini C. Combined networks regulating seed maturation.,2007, 12: 294–300

[27] Kruger N J, Schaewen A V. The oxidative pentose phosphate pathway: structure and organisation.,2003, 6: 236–246

[28] 張海艷. 玉米胚乳細(xì)胞淀粉質(zhì)體的發(fā)育和增殖方式. 玉米科學(xué), 2009, 17: 58–60 Zhang H Y. Amyloplast development and proliferation in maize starch endosperm cell., 2009, 17: 58–60 (in Chinese with English abstract)

[29] Rolletschek H, Koch K, Wobus U, Borisjuk L. Positional cues for the starch/lipid balance in maize kernels and resource partitioning to the embryo., 2005, 42: 69–83

[30] Liu H, Chen W. Comparative proteomic analysis of longan (Lour.) seed abortion., 2010, 231: 847–860

[31] Mittler R, Vanderauwera S, Gollery M, Breusegem F V. Reactive oxygen gene network of plants.,2004, 9: 490–498

[32] Kolomiets M V, Hannapel D J, Chen H, Tymeson M, Gladon R J. Lipoxygenase is involved in the control of potato tuber development., 2001, 13: 613–626

[33] 宮長榮, 李艷梅, 楊立均. 水分脅迫下離體煙葉中脂氧合酶活性、水楊酸與茉莉酸積累的關(guān)系. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2003, 36: 269–272 Gong C R, Li Y M, Yang L J. Relationship between LOX activity and SA and JA accumulations in tobacco leave under water stress., 2003, 36: 269–272 (in Chinese with English abstract)

[34] Fontecave M, Atta M, Mulliez E.-adenosylmethionine: nothing goes to waste.,2004, 29: 243–249

[35] Feng H Y, Wang Z M, Kong F N, Zhang M J, Zhou S L. Roles of carbohydrate supply and ethylene, polyamines in maize kernel set., 2011, 53: 388–398

Differential Expression Characteristics of Proteins Involved in Early Development of Maize Grain

YU Tao1,**, LI Geng1,**, ZHANG Cheng-Fen2, LIU Peng1,*, DONG Shu-Ting1,*, ZHANG Ji-Wang1, and ZHAO Bin1

1Agronomy College of Shandong Agricultural University / State Key Laboratory of Crop Biology, Tai’an 271018, China;2Zibo Zhoucun Vocational Secondary Specialized School, Zibo 255300, China

During the early stage of maize grain development, the metabolic activity is strong and the cell division and enlargement processes are also active, leading to increase the grain sink size for subsequent accumulation of storage material. To explore the protein synthesis, accumulation and regulation during early maize grain development, grains of maize cultivar Denghai 661 in the middle of ear were harvested at 3, 5, and 10 days after flowering artificial saturation pollination, respectively, and analyzed by isobaric tags for relative and absolute quantitation (iTRAQ) proteomics. A total of 2639 proteins were identified and quantified in maize grain during early stages of development, showing that these proteins were involved in diverse biological processes and molecular functions, of which the metabolic process and molecular processes were the two most important biological processes, and the catalytic activity and binding were the two most important molecular functions, all of them played important roles in maize grain development. Quantitative analysis showed that 137 proteins significantly differentially expressed during early maize grain development, and these proteins were involved in protein metabolism, stress response, cell growth and division, carbohydrate and energy metabolism, transport, secondary metabolism, starch synthesis, transcription, lipid metabolism, signal transduction and amino acid metabolism. Among them, the proteins expressed more differentially were related to protein metabolism, stress response, cell growth and division, carbohydrate and energy metabolism. Expression patterns clustering analysis showed that these proteins in different functional categories expressed synergically to regulate the early development of maize grain.

Maize; Grain at the early development; iTRAQ; Proteomics; Protein function

10.3724/SP.J.1006.2017.00608

本研究由國家自然科學(xué)基金項目(31371576, 31401339), 國家重點研發(fā)計劃項目(2016YFD0300106, 2016YFD0300205), 國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201203100, 201203096, 201503130), 國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(CARS-02-20), 山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)項目(SDAIT-02-08), 山東省高等學(xué)?？萍加媱濏椖?J14LF10), 山東省農(nóng)業(yè)重大應(yīng)用技術(shù)創(chuàng)新課題和山東省玉米育種與栽培技術(shù)企業(yè)重點實驗室資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31371576, 31401339), the National Key Research and Development Program of China (2016YFD0300106, 2016YFD0300205), the China National Public Welfare Industry (Agriculture) Plan (201203100, 201203096, 201503130), the National Modern Agricultural Technology & Industry System (CARS-02-20), the Shandong Modern Agricultural Technology & Industry System (SDAIT-02-08), the Colleges and Universities of Shandong Province Science and Technology Plan Projects (J14LF10), the Agriculture Technology Innovation Project of Shandong Province and Shandong Provincial Key Laboratory of Corn Breeding and Cultivation Technology.

劉鵬, E-mail: liupengsdau@126.com; 董樹亭, E-mail: stdong@sdau.edu.cn

E-mail: yutaosdnd@163.com**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

2016-11-01;

Accepted(接受日期): 2017-01-21;

Published online(網(wǎng)絡(luò)出版日期): 2017-02-17.

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20170217.0945.002.html