楊瓊梁 袁佳敏 黃星雨 顏 沖 楊仁義 蘇啟后 李博楊 顏 紅

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙410208)

·免疫學(xué)技術(shù)與方法·

楊樹花粉過敏BALB/c小鼠動物模型的建立①

楊瓊梁 袁佳敏 黃星雨 顏 沖②楊仁義③蘇啟后④李博楊 顏 紅

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，長沙410208)

目的：建立楊樹花粉粗提物致敏激發(fā)的小鼠過敏模型。方法：將60只BALB/c小鼠隨機(jī)均分為正常組、卵清蛋白(OVA)陽性對照組和模型組，每隔5 d經(jīng)腹腔注射致敏1次，共4次，末次致敏后第5天滴鼻激發(fā)。觀察支氣管肺泡灌洗液(BALF)中炎癥細(xì)胞變化情況；PAS染色觀察氣道黏液分泌情況；HE染色觀察鼻黏膜、肺炎癥情況；免疫組化法檢測肺組織中IL-4及IFN-γ陽性細(xì)胞平均光密度值；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測血清中的總IgE水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組誘導(dǎo)鼻黏膜、肺組織出現(xiàn)明顯的變應(yīng)性炎癥且氣道黏液分泌明顯增加；BALF涂片顯示明顯的炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞)增多；肺組織中IL-4陽性細(xì)胞平均光密度值均高于正常組，IFN-γ陽性細(xì)胞平均光密度值均低于正常組；血清中總IgE高于正常組。結(jié)論：楊樹花粉粗提物能夠成功建立小鼠過敏模型。該模型的建立有利于過敏性疾病機(jī)制的研究。

楊樹花粉粗提物；過敏反應(yīng)；動物模型

花粉是引起Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病重要的致敏原之一，致敏花粉的種類因地區(qū)、海拔、季節(jié)的不同而有所不同。楊樹是我國分布最廣的樹種，其每年產(chǎn)生的花粉及飛絮已成為春季主要的致敏花粉之一，常引起人類過敏性鼻炎、哮喘等過敏性疾病發(fā)作，臨床上需給予抗炎、平喘、解痙等治療[1]。鑒于人體試驗(yàn)的局限性和安全性，建立合適的動物模型來研究楊樹花粉過敏顯得尤為重要。許多不同品種的動物如豚鼠、大鼠、小鼠等已成功用于多種變應(yīng)原炎癥動物模型的構(gòu)建，如塵螨、花生、卵蛋白等[2-4]。小鼠因其免疫遺傳背景較清楚、來源廣、品系較純、價格低廉等優(yōu)點(diǎn)，同時隨著免疫學(xué)的發(fā)展及大量分子生物學(xué)試劑的出現(xiàn)，其應(yīng)用于過敏模型的建立逐年增加。目前國內(nèi)尚無資料直接顯示Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)疾病患者中對楊樹花粉過敏的比例，為此，本研究采用楊樹花粉粗提物致敏和激發(fā)小鼠，初步探討小鼠楊樹花粉過敏的發(fā)病機(jī)理，為后續(xù)研究及開發(fā)治療楊樹花粉過敏藥物提供良好的動物模型，同時也可為其他花粉過敏模型提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 BALB/c雌性小鼠60只，體重(18±2)g，購于湖南太平生物科技有限公司[許可證號：SCXK(湘)2015-0004]，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心[許可證號：SCXK(湘)2011-0003]。

1.1.2 藥物與試劑 楊樹花粉由中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所提供，參照文獻(xiàn)[5]制備得到楊樹花粉粗提物；Albumin Egg購自Solarbio公司；氫氧化鋁凝膠由本實(shí)驗(yàn)室自制；總IgE酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)檢測(ELISA)試劑盒均購于欣博盛生物科技有限公司；IL-4免疫組織化學(xué)試劑購于武漢博士德生物工程有限公司；IFN-γ免疫組織化學(xué)試劑購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 臺式高速離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；ELX800酶標(biāo)儀(基因有限公司)；Spectrumlab 722sp可見分光光度計(jì)(Lengguang Tech)；CP114型電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；KD2258型石蠟切片機(jī)(中國浙江金華)，Motic B5顯微攝像圖像分析系統(tǒng)(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 將60只小鼠按體重隨機(jī)分成3組，即正常組，卵清蛋白(OVA)陽性對照組，模型組。

1.2.2 動物免疫 參照文獻(xiàn)[6]方法加以改進(jìn)，OVA陽性對照組每只小鼠腹腔注射100 μg/ml的OVA 生理鹽水(含5%氫氧化鋁免疫佐劑)溶液0.1 ml。模型組將楊樹花粉粗提物混懸于含5%氫氧化鋁免疫佐劑生理鹽水中，配成濃度為2 mg/ml的溶液，腹腔注射給予該組每只小鼠0.4 ml。正常對照組采用生理鹽水溶液，注射方法、劑量均同陽性對照組。每間隔5 d重復(fù)致敏1次，共4次。

1.2.3 抗原激發(fā) 第4次致敏后的第5天進(jìn)行滴鼻激發(fā)。陽性對照組所有小鼠給予40 μl(10 mg/ml)OVA溶液滴鼻激發(fā)；模型組所有小鼠給予40 μl(10 mg/ml) 楊樹花粉粗提物滴鼻激發(fā)；正常對照組采取生理鹽水進(jìn)行滴鼻；每天1次，連續(xù)5 d。

1.2.4 血液的采集及處理 最后一次激發(fā)后24 h，眼窩取血，室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，血清移至干凈的Eppendorf管，-20℃保存。

1.2.5 鼻黏膜病理學(xué)檢查 取雙側(cè)鼻組織，固定于10%甲醛中，石蠟包埋，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察鼻黏膜局部炎癥變化。

1.2.6 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集及處理 每組取10只小鼠切開頸部皮膚，行氣管插管術(shù)，用含5%的胎牛血清生理鹽水1 ml，分2次從氣管插管緩慢注入肺內(nèi)，緩慢收集，回收率為70%～80%(0.7～0.8 ml)。灌洗液2 000 r/min離心5 min后取沉淀涂片，干后進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡高倍鏡下觀察炎癥細(xì)胞變化。

1.2.7 肺組織病理學(xué)檢查及評分 往每組剩余小鼠肺中注入甲醛0.5 ml固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，HE染色和PAS染色，顯微鏡高倍鏡下觀察肺組織中炎癥浸潤程度及氣道黏液分泌情況。采用Underwood的標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)血管周圍和支氣管周圍嗜酸粒細(xì)胞浸潤情況(分為0～5分)、組織水腫情況(分為0～5分)和肺組織中上皮損傷情況(分為0～5分)分別給每組小鼠評分，并計(jì)算出其平均總評分[7]。參照Henderson提供的方法，依據(jù)氣道上皮著色情況(分為0～5分)確定支氣管周圍黏液分泌情況[8]。

1.2.8 肺組織中IL-4及IFN-γ表達(dá) 取固定好的小鼠肺組織，應(yīng)用免疫組化法對肺組織中IL-4及IFN-γ的表達(dá)進(jìn)行測定，采用圖像分析系統(tǒng)檢測。

1.2.9 血清中總IgE含量的測定 參照總IgE檢測試劑盒說明書，酶聯(lián)免疫吸附法測定血清中的總IgE含量。

2 結(jié)果

2.1 模型組出現(xiàn)過敏癥狀 模型組和OVA對照組小鼠于激發(fā)后均出現(xiàn)不同程度的煩躁不安或安靜少動、立毛撓鼻、打噴嚏、呼吸加快加深、前肢縮抬、二便失禁等過敏反應(yīng)表現(xiàn)；而正常組小鼠除有輕微撓鼻外無上述表現(xiàn)。

2.2 模型組鼻黏膜炎癥細(xì)胞浸潤明顯 模型組及OVA對照組鼻黏膜上皮脫落，有大量炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞及少量的中性粒細(xì)胞)浸潤，而對照組鼻黏膜呈淡紅色、光滑、黏膜結(jié)構(gòu)正常，無炎癥細(xì)胞浸潤(圖1)。

2.3 模型組BALF中炎癥細(xì)胞浸潤程度增加 模型組及OVA對照組BALF涂片中炎癥細(xì)胞(嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞)顯著高于正常組(P<0.05，圖2)。

2.4 模型組肺組織炎癥浸潤程度及氣道黏液分泌增加 HE染色及PAS染色結(jié)果表明：正常組小鼠肺組織切片未見明顯病理學(xué)變化(圖3A、D)；模型組氣管、支氣管及血管周圍大量炎性細(xì)胞(肥大細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、啫酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞與中性粒細(xì)胞)浸潤，上皮細(xì)胞脫落，間質(zhì)大量中性粒細(xì)胞浸潤(圖3B)；OVA對照組氣管、支氣管及血管周圍大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤，支氣管黏膜腫脹、破裂(圖3C)，較之正常組(2.16±1.44)，模型組(14.39±1.79)及OVA對照組(15.96±2.03)肺組織炎癥浸潤程度顯著增加(P<0.05)。模型組(4.5±0.97)及OVA對照組(4.7±0.68)較之正常組(0.5±0.85)PAS著色細(xì)胞明顯增加，氣道上皮杯狀細(xì)胞增生，管腔中有黏液滲出，有的可見黏液栓(圖3E、F)。

2.5 模型組肺組織中IL-4免疫反應(yīng)性增強(qiáng)，IFN-γ免疫反應(yīng)性降低 OVA對照組、模型組肺組織IL-4表達(dá)明顯高于正常組，IFN-γ表達(dá)明顯低于對照組(表1、圖4)。

圖1 鼻黏膜炎癥細(xì)胞浸潤程度(HE×200)Fig.1 Inflammatory cell infiltration in nasal mucosa(HE ×200)Note：A.Control group;B.Model group;C.OVA group.

圖2 BALF中炎癥細(xì)胞浸潤程度(HE×200)Fig.2 Inflammatory cell infiltration in BALF(HE×200)Note：A.Control group；B.Model group；C.OVA group.

2.6 模型組血清中總IgE含量增加 OVA對照組、模型組血清中總IgE的含量顯著高于正常組，OVA對照組與模型組之間無顯著性差異(表2)。

圖3 肺組織病理學(xué)變化(HE,PAS×400)Fig.3 Inflammatory cell infiltration in lung tissues(HE,PAS×400)Note：A.Control group of HE staining;B.Model group of HE staining;C.OVA group of HE staining;D.Control group of PAS staining;E.Model group of PAS staining;F.OVA group of PAS staining.

GroupsIL?4IFN?γControl0 19±0 030 52±0 08Model0 35±0 051)0 33±0 101)OVA0 38±0 081)0 30±0 121)

Note：Compared with control group，1)P<0.05.

圖4 肺組織中IL-4、IFN-γ免疫反應(yīng)性(×400)Fig.4 IL-4 immune reactivity and IFN-γ immune react-ivity in lung tissue(×400)Note：A.IL-4 expression of control group;B.IL-4 expression of OVA group;C.IL-4 expression of model group;D.IFN-γ expression of control group;E.IFN-γ expression of OVA group;F.IFN-γ expression of model group.

GroupsIgE/(ng/ml)Control9 71±1 26Model16 3±1 421)OVA15 14±0 941)

Note：Compared with control group，1)P<0.01.

3 討論

目前研究認(rèn)為，花粉過敏主要是由IgE介導(dǎo)的Ⅰ型超敏反應(yīng)，機(jī)體吸入花粉變應(yīng)原后產(chǎn)生IgE抗體，IgE與花粉變應(yīng)原結(jié)合后黏附于嗜酸性細(xì)胞、肥大細(xì)胞表面，引起嗜酸性細(xì)胞浸潤及炎癥介質(zhì)的釋放，導(dǎo)致過敏性鼻炎、哮喘等疾病的發(fā)生。由于IgE存在血液循環(huán)中，過敏反應(yīng)并不局限于局部，故本實(shí)驗(yàn)不僅對鼻黏膜、肺組織及BALF進(jìn)行病理學(xué)檢查，也對IgE抗體及相關(guān)細(xì)胞因子水平進(jìn)行檢測，以評價建立的過敏模型。

大量研究者采用OVA成功制備小鼠過敏模型，且OVA是過敏實(shí)驗(yàn)常用的陽性對照品，在本研究中選用其作為陽性對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)楊樹花粉粗提物變應(yīng)原及OVA能成功誘導(dǎo)小鼠過敏反應(yīng)，均表現(xiàn)為撓鼻、打噴嚏次數(shù)增多，二便失禁，鼻黏膜炎癥細(xì)胞浸潤，肺部氣管、小支氣管及血管周圍有明顯的炎性細(xì)胞浸潤，部分切片可見細(xì)支氣管內(nèi)含有黏稠痰液及黏液栓，并可見許多嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，PAS著色細(xì)胞明顯增多；而正常對照組并無此癥狀。BALF中亦存在大量以嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞，表明楊樹花粉粗提物變應(yīng)原效價與OVA過敏原相近。

目前公認(rèn)的過敏反應(yīng)發(fā)生的機(jī)制理論為過敏介質(zhì)理論與Th1/Th2平衡理論，前者是研究最多的一種發(fā)生機(jī)制[9]，后者是較新的理論。研究報道認(rèn)為，過敏性疾病是由Th2型細(xì)胞因子引起的免疫系統(tǒng)失調(diào)的疾病[10，11]。正常機(jī)體Th1、Th2細(xì)胞以及Th1型、Th2型細(xì)胞因子處于平衡狀態(tài)，發(fā)生過敏反應(yīng)時，細(xì)胞因子表達(dá)打破平衡，Th2型細(xì)胞因子過度表達(dá)，引起過敏反應(yīng)。按此理論可將細(xì)胞因子的產(chǎn)生分為Th1型和Th2型，Th1型(IFN-γ、IL-2等)是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和遲發(fā)型的變態(tài)反應(yīng)，其可以抑制Th2型細(xì)胞因子作用，起到保護(hù)氣道作用[12]；Th2型(IL-4、IL-5、IL-6 等)主要介導(dǎo)的是速發(fā)型過敏反應(yīng)及Ⅰ型超敏反應(yīng)，其可使IgE合成增多，募集EOS向小氣道浸潤。在本試驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)與正常對照組相比，OVA對照組和模型組小鼠肺組織中IL-4陽性細(xì)胞平均光密度值顯著增加，IFN-γ陽性細(xì)胞平均光密度值顯著降低，表明楊樹花粉粗提物與OVA致敏激發(fā)均誘導(dǎo)了小鼠Th2型免疫反應(yīng)。由于實(shí)驗(yàn)條件的局限性，本實(shí)驗(yàn)僅觀察了小鼠鼻黏膜、肺部炎癥的病理學(xué)改變及與過敏反應(yīng)相關(guān)的特異性細(xì)胞因子的變化，尚未觀察此模型的氣道反應(yīng)性變化，有待后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步完善。

綜上可知，研究結(jié)果證實(shí)了本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建了楊樹花粉誘導(dǎo)小鼠過敏反應(yīng)模型，提供了一種楊樹花粉粗提物誘導(dǎo)小鼠過敏模型的方法，并對楊樹花粉過敏的發(fā)病機(jī)理及病理特征進(jìn)行了研究，為楊樹花粉引發(fā)的過敏性疾病的預(yù)防和治療奠定了理論基礎(chǔ)。

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[收稿2016-11-15 修回2016-12-08]

(編輯 許四平)

BALB/c mice model of allergic diseases induced by populus pollen

YANGQiong-Liang,YUANJia-Min,HUANGXing-Yu,YANChong,YANGRen-Yi,SUQi-Hou,LIBo-Yang,YANHong.

SchoolofPharmacy,HunanUniversityofChineseMedicine,Changsha410208,China

Objective:To study performed of develop a mice model of allergic diseases induced by crude extractings from populus pollen.Methods: A total of 60 BALB/c mice were divided randomly into there groups:normal control group,Albumin Egg(OVA) group and populus pollen model group with 20 in each.Mices were repeatedly sensitized by intraperitoneal injections of OVA or crude populus pollen extract every 5 d for four doses.Five days after the last sensitization,mices were repeatedly challenged by once daily antigen from 21-25 d.The changes of inflammatory cells in bronchoalveolar lavage fluid(BALF) were stained with hematoxylin and eosin(HE) to evaluate the degree of allergic inflammation.PAS staining was used to observe the secretion of airway mucus;The changes of the nasal mucosas and lungs of mice were stained with HE to evaluate the degree of allergic inflammation.And the average optical density of IL-4 and IFN-γ positive cells in lung tissue was measured by immunohistochemistry.The total IgE in the serum was also measured by enzyme-linked immunoassay(ELISA).Results: Compared with the mice in normal control group,those in OVA group and model group developed obvious allergic inflammation in the nasal mucosas and lungs,and increased airway mucus secretion.The number of inflammatory cells including eosinophil and neutrophils markedly increased in BALF smear.The average optical density of IL-4 positive cells in lung tissue was all increased in OVA group and model group compared with those in normal control group,and the average optical density of IFN-γ in lung tissue was on the contrary.The total IgE in the serum were all increased in OVA group and model group compared with those in normal control group,and the IFN-γ in the serum was significantly reduced in OVA group and model group compared with those in normal control group.Conclusion: Taken together,crude populus pollen extract can successfully induce a mice model of allergic diseases.This model is a useful tool in studying the mechanisms of allergic disease.

Crude populus pollen extract;Allergy;Animal models

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.016

①本文為國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201304103)和湖南省“中藥學(xué)”重點(diǎn)學(xué)科項(xiàng)目(湘教通[2011]76號)。

楊瓊梁(1992年-)，女，在讀碩士，主要從事天然活性產(chǎn)物及中藥新制劑的研究，E-mail：598789133@qq.com。

及指導(dǎo)教師：顏 紅(1978年-)，女，博士，副教授，主要從事天然產(chǎn)物研究及中藥新劑型及新技術(shù)的研究，E-mail：yh8632@126.com。

R363

A

1000-484X(2017)04-0554-04

②湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院，長沙 410208。

③湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，長沙410208。

④湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，長沙410208。