張景洲 馮相偉 孟繁平

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室,延吉133002)

扶正解毒通絡(luò)方對(duì)人肝癌HepG2細(xì)胞MMP-2、MMP-9表達(dá)及細(xì)胞侵襲作用的影響①

張景洲 馮相偉②孟繁平

(延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)與病原生物學(xué)教研室,延吉133002)

目的：探討扶正解毒通絡(luò)方對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞侵襲作用和基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metallo proteinases，MMP)-2、MMP-9表達(dá)水平的影響及可能的作用機(jī)制。 方法：CCK8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)扶正解毒通絡(luò)方對(duì)HepG2細(xì)胞活性影響； Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)扶正解毒通絡(luò)方對(duì)HepG2侵襲能力的影響；ELISA法檢測(cè)扶正解毒通絡(luò)方干預(yù)HepG2細(xì)胞后 MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平。結(jié)果：CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，扶正解毒通絡(luò)方對(duì)HepG2細(xì)胞意志呈劑量時(shí)間相關(guān)性。Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)顯示，2.65 mg/ml扶正解毒通絡(luò)方對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲力抑制率為52.45% (P<0.05)。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，扶正解毒通絡(luò)方干預(yù)后 HepG2 細(xì)胞上清液中MMP-2 和 MMP-9表達(dá)水平下降(P<0.05)。結(jié)論：扶正解毒通絡(luò)方可以抑制肝癌HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲，其機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)MMP-2、MMP-9在肝癌細(xì)胞HepG2的表達(dá)。

扶正解毒通絡(luò)方；肝癌HepG2細(xì)胞；MMP-2；MMP-9；細(xì)胞侵襲

肝癌是目前實(shí)體瘤中預(yù)后很差的惡性腫瘤之一。肝癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的生長(zhǎng)增殖、基質(zhì)黏附和侵襲轉(zhuǎn)移能力，這些都是影響肝癌預(yù)后的主要因素，因此尋找能抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲的藥物，成為人們進(jìn)行抗肝癌藥物研究的熱點(diǎn)[1]。扶正解毒通絡(luò)方是基于中醫(yī)“毒損肝絡(luò)”理論，方由姜黃、半邊蓮、半枝蓮、虎杖、白術(shù)、茯苓等十味中藥配伍而成，結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)而制定經(jīng)驗(yàn)方，用于肝癌的治療，前期研究證實(shí)有較好的抗癌作用[2]。本文闡述扶正解毒通絡(luò)方對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞侵襲作用和MMP-2、MMP-9表達(dá)水平的影響，旨在為進(jìn)一步闡述中藥復(fù)方制劑抗肝癌的分子機(jī)制提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及實(shí)驗(yàn)試劑 人肝癌HepG2細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司，由本實(shí)驗(yàn)室傳代培養(yǎng)；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清均購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司；MMP-2 ELISA試劑盒、MMP-9 ELISA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Cloud-clone公司，Transwell小盒及基質(zhì)膠購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%FBS及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中。待其在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代或鋪板。

1.2．2 扶正解毒通絡(luò)配方組成 取姜黃1 g、半邊蓮1 g、半枝蓮1 g、虎杖1 g、白術(shù)1 g、茯苓1 g、黃芪2 g、當(dāng)歸0.667 g、雞血藤1 g、桂枝0.667 g，放入離心管中；加30 ml雙蒸水，煮沸1 h；離心，將上層藥液轉(zhuǎn)移到新的離心管中，再加入20 ml雙蒸水將深沉重懸，再次煮沸1 h；將上層藥液與第1次離心得到的上層藥液合并；加熱煮沸，將藥液濃縮至30 ml。以毫克生藥/每毫升水(mg/ml)進(jìn)行計(jì)量。由此算得藥物濃度為 10.334 g/30 ml=344 mg/ml；配制好的扶正解毒通絡(luò)方，抽濾后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 CCK8檢測(cè)扶正解毒通絡(luò)方對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響 取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HepG2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為2×103cells/ml，96孔板中每孔加入100 μl 細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h(37℃，5%CO2)。實(shí)驗(yàn)分為藥物處理組和對(duì)照組，藥物處理濃度為6、5、4、3、2、1、0 mg/ml。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱中孵育適當(dāng)?shù)臅r(shí)間(如24、48、72 h)后，根據(jù)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)，向每孔中加入10 μl CCK8培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1.5 h。酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。計(jì)算抑制率，以藥物濃度為橫坐標(biāo)軸，抑制率為縱坐標(biāo)軸作圖并計(jì)算IC50。

1.2.4 Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 采用帶有8 μm微孔聚碳酸酯膜Transwell小室，在小室上鋪50 μg膠；將HepG2 細(xì)胞使用2.65 mg/ml藥物處理48 h后的，棄去舊培養(yǎng)基，用1×PBS洗一次，加0.25%胰酶消化，1 500 r/min離心5 min收集細(xì)胞；計(jì)數(shù)板下計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度至7×105cells/ml，將每組細(xì)胞懸液取200 μl加入上室。下室加入細(xì)胞條件培養(yǎng)液共孵育24 h，每組三個(gè)平行樣本；取出濾膜，用棉簽擦盡上室面的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定15 min；結(jié)晶紫染色后，1×PBS清洗3次，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.5 ELISA檢測(cè)MMP-2、MMP-9含量 取適量包被的抗體/抗原與包被液混勻。在酶標(biāo)板上加入稀釋液100 μl/孔，4℃室溫包被過(guò)夜；吸去包被液，每孔加入200 μl封閉液于37℃封閉2 h。封閉液是含3%BSA的PBS液；用PBST液洗滌3次，400 μl/孔；每孔加100 μl細(xì)胞上清液或者標(biāo)準(zhǔn)品，震蕩混勻，置37℃室溫孵育0.5～2 h。樣品或標(biāo)準(zhǔn)品用PBS液稀釋；用PBST液洗滌3次； 每孔加100 μl辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗豬IgG稀釋液，置37℃室溫孵育0.5～2 h。二抗用3% BSA的 PBS液稀釋；用PBST液洗滌3次；每孔加TMB底物液100 μl，37℃室溫顯色5～15 min(底物液可以由10 ml顯色劑B和0.4 ml顯色劑A配制而成的，或者購(gòu)買TMB底物液)；每孔加50 μl 1 mol/L HCl (2 mol/L 硫酸)的終止液來(lái)終止反應(yīng)；用酶標(biāo)儀測(cè)OD450值。

2 結(jié)果

2.1 CCK8篩選出最佳處理濃度和處理時(shí)間 經(jīng)過(guò)3次24 h CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算藥物處理IC50值分別為2.8、2.4、2.75 mg/ml，我們?nèi)【禐?.65 mg/ml作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)最佳處理濃度，以最佳濃度分別處理細(xì)胞24、48、72 h，結(jié)果24 h處理后細(xì)胞CCK8檢測(cè)未見(jiàn)明顯變化，處理72h后細(xì)胞死亡嚴(yán)重影響判讀，故以48 h作為最佳藥物處理時(shí)間(圖1)。

2.2 扶正解毒通絡(luò)方對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的影響 扶正解毒通絡(luò)方作用于HepG2細(xì)胞后，進(jìn)行Transwell實(shí)驗(yàn)，24 h后在10×10倍鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行拍照。經(jīng) 2.65 mg/ml給藥組(扶正解毒通絡(luò)方)處理后，HepG2細(xì)胞的侵襲能力在扶正解毒通絡(luò)方的作用下明顯降低，HepG2 細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)(58.33±2.89)明顯少于對(duì)照組穿膜細(xì)胞數(shù)(122.67±6.66),P<0.05，圖2、3。給藥組對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲力抑制率達(dá)52.45%。

2.3 扶正解毒通絡(luò)方對(duì)人肝癌HepG2中基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9表達(dá)的影響 ELISA 檢測(cè)

圖1 CCK8檢測(cè)扶正解毒通絡(luò)方對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effect of Fuzhen Jiedu Tongluofang on HepG2 cell activity by CCK8

圖2 扶正解毒通絡(luò)方對(duì)HepG2細(xì)胞侵襲的影響Fig.2 Effect of Fuzheng Jiedu Tongluofang on invasion of human hepatoma HepG2 cells

圖3 扶正解毒通絡(luò)方對(duì)穿膜的細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析Fig.3 Effect of Fuzheng Jiedu Tongluofang on cell invasion of HepG2 cells

圖4 扶正解毒通絡(luò)方對(duì)HepG2細(xì)胞MMP2和MMP9表達(dá)量的影響Fig.4 Effect of Fuzheng Jiedu Tongluofang on expression of MMP-2 and MMP-9 of human hepatoma HepG2 cells

結(jié)果顯示，應(yīng)用2.65 mg/ml給藥組 (扶正解毒通絡(luò)方)作用于HepG2細(xì)胞48 h后 ，上清液中MMP-2及MMP-9表達(dá)水平明顯下降，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4) 。

3 討論

肝癌是世界癌癥發(fā)病率第5位的常見(jiàn)腫瘤,并且在腫瘤相關(guān)性死亡危險(xiǎn)因素中排名第3位,尤其是受肝炎病毒影響十分嚴(yán)重的亞洲和非洲地區(qū)[3]。肝癌難以早期發(fā)現(xiàn)，一旦出現(xiàn)臨床癥狀，多為中晚期。中晚期肝癌來(lái)勢(shì)猛，發(fā)展快，生存期短，西醫(yī)藥至今尚無(wú)較為理想的治療方法，中醫(yī)藥在治療中晚期肝癌時(shí)發(fā)揮著重要作用[4]。中草藥來(lái)源廣泛，在肝癌的防治方面有一定優(yōu)勢(shì)，因此國(guó)內(nèi)外對(duì)于肝癌的中醫(yī)藥防治都有著迫切的需求[5]。

“毒損肝絡(luò)”的基本理論基礎(chǔ)認(rèn)為毒邪作祟、阻滯于肝絡(luò)，出現(xiàn)絡(luò)虛、毒侵,而化毒為害則是絡(luò)病遷延和深化的關(guān)鍵所在，此時(shí)疾病處于正虛邪實(shí)、病勢(shì)膠著狀態(tài)。其中，“毒”是啟動(dòng)因子，即“肝絡(luò)之損”由“邪毒”啟動(dòng)，最終引起“肝絡(luò)之變”(一是癌變，二是壞證之變)。“瘀”是其樞紐因子，是各種慢性肝病的中心環(huán)節(jié)，也是“肝炎一肝硬化一肝癌”三部曲的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[6]。所以通絡(luò)的基礎(chǔ)上,兼以扶正解毒,故選用姜黃、半邊蓮、半枝蓮、虎杖、白術(shù)、茯苓、黃芪、當(dāng)歸、雞血藤、桂枝等中藥，使血和氣行,血絡(luò)通暢。肝絡(luò)通達(dá)，則虛可補(bǔ)，毒可解，瘀可祛，達(dá)到通絡(luò)治療目的。

MMP-2、MMP-9能降解基底膜的主要成分—Ⅳ型膠原，在腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，是參與細(xì)胞外基質(zhì)代謝的最主要的蛋白水解酶類，在腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程中有著重要的作用[7]。本實(shí)驗(yàn)ELISA結(jié)果顯示，經(jīng)扶正解毒通絡(luò)方藥物處理后，基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平明顯下降，提示扶正解毒通絡(luò)方可能通過(guò)降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平，進(jìn)而阻止基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)地不斷降解，從而抑制肝癌HepG2細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

對(duì)于肝癌患者來(lái)說(shuō)，肝癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是影響其預(yù)后及復(fù)發(fā)的最重要因素，為了研究扶正解毒通絡(luò)方對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞侵襲能力的影響，本實(shí)驗(yàn)采用簡(jiǎn)單易行且重復(fù)性好的Transwell侵襲小室進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，經(jīng)扶正解毒通絡(luò)方藥物干預(yù)后，HepG2細(xì)胞穿透室膜和基質(zhì)膠的數(shù)量明顯減少，抑制率達(dá)52.45%，提示經(jīng)扶正解毒通絡(luò)方藥物作用后，可顯著抑制HepG2細(xì)胞的侵襲能力，此作用對(duì)延緩甚至控制肝癌轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)具有重要的臨床意義。

綜上所述，本研究表明扶正解毒通絡(luò)方具有降低MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移侵襲等能力，闡述了扶正解毒通絡(luò)方抗肝癌作用的部分作用機(jī)理，延緩及控制肝癌轉(zhuǎn)移可能是扶正解毒通絡(luò)方發(fā)揮抗肝癌作用的重要機(jī)制之一，中藥復(fù)方在熬制過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)，其發(fā)揮療效的具體組分以及具體分子機(jī)制值得我們進(jìn)一步研究。扶正解毒通絡(luò)方是一種臨床中有效的抗肝癌復(fù)方制劑，進(jìn)一步深入研究可為中藥復(fù)方制劑應(yīng)用于肝癌的臨床治療提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[收稿2016-12-07 修回2017-01-28]

(編輯 許四平)

Effect of Fuzheng Jiedu Tongluofang on MMP-2 and MMP-9 and invasion of human hepatoma HepG2 cells

ZHANGJing-Zhou，F(xiàn)ENGXiang-Wei，MENGFan-Ping.

DepartmentofImmunologyandPathogenicBiology,CollegeofBasicMedicineofYanbianUniversity，Yanji133002，China

Objective:To investigate the effect and mechanism of Fuzheng Jiedu Tongluofang on the expression of MMP-2，MMP-9 and invasion of human hepatoma HepG2 cell.Methods：Hepatioma HepG2 cell was treated with Fuzheng Jiedu Tongluofang．The cell viability was measured by CCK8.The invasion of HepG2 was detected by Transwell assay．The expression of MMP-2 and MMP-9 was analyzed by ELISA． Results：In the CCK8 assay,Fuzheng Jiedu Tongluofang could inhibit the proliferation of HepG2 cells at a density and time measure.In the Transwell assay,the inhibitory rate of invasion was 52.45% when treated with Fuzheng Jiedu Tongluofang at a concentration of 2.65 mg/ml． The ELISA assay indicated that the expression of MMP-2 and MMP-9 decreased significantly after treated with Fuzheng Jiedu Tongluofang(P<0.05)． Conclusion：Fuzheng Jiedu Tongluofang suppressed the invasion of HepG2 with the possible mechanism of down-regulating the expression of MMP-2 and MMP-9 in HepG2．

Fuzheng Jiedu Tongluofang;Hepatioma HepG2 cells;MMP-2;MMP-9;Invasion

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.04.013

①本文受吉林省科技發(fā)展規(guī)劃項(xiàng)目(330201Q00)資助。

張景洲(1978年-)，男，碩士，副教授，主要從事中醫(yī)藥治療消化道系統(tǒng)疾病的研究，現(xiàn)任職于長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，E-mail：zjz362@126.com。

及指導(dǎo)教師：孟繁平(1958年-)，男，博士，科主任，教授，主要從事自身免疫性疾病分子免疫學(xué)的研究，E-mail：fpmeng@ybu.edu.cn。

R392.4

A

1000-484X(2017)04-0542-03

②吉林大學(xué)第一醫(yī)院,長(zhǎng)春130021。