朱培冉，吳秋月，余毛毛，張明超，倪夢霞，劉帥妹，蔣衛(wèi)軍，張靜，李衛(wèi)巍，曹進，李伊，薛春燕，夏欣一

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院a.全軍檢驗醫(yī)學(xué)研究所，b.眼科，南京 210002)

一漢族玻璃體淀粉樣變性家系的TTR基因突變檢測

朱培冉a，吳秋月a，余毛毛a，張明超a，倪夢霞a，劉帥妹a，蔣衛(wèi)軍a，張靜a，李衛(wèi)巍a，曹進a，李伊a，薛春燕b，夏欣一a

(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院a.全軍檢驗醫(yī)學(xué)研究所，b.眼科，南京 210002)

目的 對一漢族玻璃體淀粉樣變性家系的致病基因Transthyretin(TTR)進行檢測，明確該家系玻璃體淀粉樣變性的致病基因突變位點。方法 采集該家系9個成員(包括臨床確診患者2例，無癥狀者7例)外周血，提取其基因組DNA。用PCR技術(shù)對TTR基因的4個外顯子進行擴增，并對擴增產(chǎn)物進行Sanger測序；同時選取100例無血緣關(guān)系的健康人作為對照。結(jié)果 該家系8例受檢者中有4例受檢者檢測到TTR第2號外顯子中第35位的密碼子發(fā)生了A>C(Lys35Thr)的雜合突變，而100例健康人對照組中均未發(fā)現(xiàn)相同突變。結(jié)論TTR基因Lys35Thr雜合突變是導(dǎo)致該家系玻璃體淀粉樣變性的致病基因。

玻璃體淀粉樣變性；甲狀腺激素結(jié)合蛋白；基因突變

玻璃體淀粉樣變性(OMIM:105210)普遍認(rèn)為是甲狀腺激素結(jié)合蛋白(Transthyretin，TTR)基因突變所導(dǎo)致的淀粉樣物質(zhì)在眼部組織中沉積所引起的疾病[1]。其發(fā)病存在明顯的地域以及時間差異。國外研究顯示，在葡萄牙北部以及日本地區(qū)發(fā)病時間約為30歲，而在瑞典以及其他歐洲國家發(fā)病時間較晚，一般約為40歲[2-3]。國內(nèi)的相關(guān)報道較少，左晶等[4]報道一少數(shù)民族玻璃體淀粉樣變性家系的臨床觀察及分析。謝兵等[5]對由Gly83Arg引起的一玻璃體淀粉樣變性家系進行分析，結(jié)果顯示發(fā)病年齡為40～50歲。本研究對一漢族玻璃體淀粉樣變性家系的患者及家庭成員進行了TTR基因的檢測與分析，旨在確定引起該家系淀粉樣變性的致病突變位點，為患者提供遺傳診斷，并為遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供實驗依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 先證者(Ⅲ-2)，男，40歲，因2年前無誘因下出現(xiàn)雙眼視力漸進性下降，來我院就診?；颊邿o頭痛、頭暈、惡心嘔吐，無黑影飄動、視物變形、暗點、視野缺損、無眼前閃光感、眩光、眩暈等現(xiàn)象。左眼視力0.02，雙眼結(jié)膜無充血，角膜透明，前房深淺正常，房水清，虹膜紋理清，色正常，瞳孔圓，直徑3 mm，對光反射靈敏晶體尚透明，玻璃體腔內(nèi)見大量淀粉樣物質(zhì)散在分布，眼底窺不清。體格檢查正常，無其他器官組織異常，被診斷為雙眼玻璃體淀粉樣變性。主訴無既往史，個人史正常，家族史母親眼睛視力差，小姨媽眼睛近2年視力差。

在征得患者及其家屬知情同意后，我們對該家系9名包括先證者(Ⅲ-2),先證者小姨(Ⅱ-7)以及無癥狀者7名(Ⅱ-4、Ⅱ-8、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-7、Ⅲ-8、Ⅳ-1)于2016年8月在我院檢驗科進行外周血采集(3 mL)。用EDTA-K2抗凝管采集9名成員血液樣本，置-80 ℃保存，同時采集同期無血緣關(guān)系的體檢健康者100例為健康人對照組。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器與試劑 PCR擴增儀(Gray-96G，上海山富公司)；凝膠成像分析系統(tǒng)(GelX1650，上海歐翔公司)；PCR電泳儀(PowerPacTMBasic，Bio-Rad公司)；立式超低溫保存箱(DW-86L682，Haire公司)；高速離心機(D2012，Scilogex公司)；血液基因組DNA提取試劑盒(DP318-02，北京天根公司)。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 按照DNA提取試劑盒說明書操作提取各樣本外周血DNA，稀釋樣品濃度至5～10 ng/μL，置于-80 ℃保存。

1.3.2 PCR擴增 從美國國立生物技術(shù)信息中心官方網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)查詢并獲取TTR全基因序列，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計TTR基因4個外顯子的引物序列(表1)，由上海華大基因公司合成。PCR總反應(yīng)體系為25 μL，包括10×PCR緩沖液2.5 μL，2.5 mmol/L MgCL2溶液1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 2 μL，700 ng/μL DNA模板2 μL，10 μmol/L上、下游引物各1 μL，5 U/μL Taq酶0.25 μL，ddH2O 14.75 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)15 g/L瓊脂糖凝膠凝膠。

表1 TTR基因擴增引物序列

1.3.3 測序及序列比對 取PCR產(chǎn)物送華大基因測序公司進行Sanger測序，將測序結(jié)果與GenBank文庫中的參考序列進行BLAST比對分析。

2 結(jié)果

2.1 先證者家系遺傳特征 該家系4代共21例，男10例，女11例，已故5例，Ⅱ3和Ⅲ2為患者(圖1)。該家系為獨立發(fā)病的遺傳性玻璃體淀粉樣變性，患者均于40歲左右發(fā)病，臨床表現(xiàn)為進行性的單側(cè)或雙側(cè)玻璃體混濁以及視力下降。先證者弟弟及女兒均未出現(xiàn)眼部病變。

注：□，正常男性；○，正常女性；■，男性患者；●，女性患者；↗，先證者；□，去世正常男性；○，去世正常女性；●，去世患病女性；■，去世患病男性。

圖1 患者家系圖譜

2.2TTR基因PCR擴增及測序結(jié)果 受檢者(Ⅱ-4、Ⅱ-7、Ⅱ-8、Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅲ-4、Ⅲ-7、Ⅲ-8、Ⅳ-1)TTR基因的4個外顯子均擴增出預(yù)期大小的DNA片段，測序后發(fā)現(xiàn)家系成員(Ⅱ-7、Ⅲ-2、Ⅲ-3、Ⅳ-1)在TTR基因的第2號外顯子中第35位的密碼子均發(fā)生了A>C的雜合突變(AAG→ACG,圖2A)，其在該位點的編碼氨基酸由賴氨酸變?yōu)榱颂K氨酸。而在其家系中其余受檢者以及100例健康人對照組中均未檢測到該突變(圖2B)。

3 討論

TTR是一種可溶性的四聚體蛋白，主要在肝臟中合成，在血液循環(huán)中主要轉(zhuǎn)運甲狀腺激素和視黃醇結(jié)合蛋白。該病的發(fā)病機制并不清楚,其可能的機制是由于TTR基因的突變引起了四聚體的解體，解體后的單體由于自我聚集形成淀粉樣的物質(zhì)沉積，從而引起組織功能異常甚至衰竭[6]。Ruzhansky等[7]發(fā)現(xiàn)一美國雙胞胎姐妹攜帶TTR基因2號外顯子第35位的密碼子的雜合突變A>C(Lys35Thr)，從而導(dǎo)致玻璃體淀粉樣變性。國內(nèi)文獻對該位點突變引起的玻璃體淀粉樣變性的報道較少，王輝林等[8]研究發(fā)現(xiàn)，TTR基因Lys35Thr、Leu55Agr、Lys35Asn、Ser100Ser位點突變均可導(dǎo)致玻璃體淀粉樣變性，并且Lys35Thr突變引起的玻璃體淀粉樣變性家系中存在攜帶該突變位點的未發(fā)病成員。Long等[9]發(fā)現(xiàn)一玻璃體淀粉樣變性的家系中TTR基因2號外顯子第35位的密碼子發(fā)生了A>C(Lys35Thr)的雜合突變，且在該家系中也發(fā)現(xiàn)有攜帶該突變位點的未發(fā)病成員。謝兵等[5]發(fā)現(xiàn)TTR基因3號外顯子Gly83Arg雜合突變可導(dǎo)致玻璃體淀粉樣變性。以上結(jié)果均表明，引起的玻璃體淀粉樣變性的突變位點眾多，給臨床診療帶來了較多困難。

本研究通過對該家系TTR基因進行Sanger測序發(fā)現(xiàn)該家系先證者(Ⅲ-2)在2號外顯子中第35位的密碼子發(fā)生了A>C(Lys35Thr)的雜合突變，且先證者女兒(Ⅳ-1)、先證者弟弟(Ⅲ-3)以及小姨(Ⅱ-7)均攜帶有該突變，但其余攜帶者均正常。分析原因可能為TTR基因突變的發(fā)病的平均年齡為40～50歲[4-5]。結(jié)合攜帶者年齡，可以推測先證者女兒以及弟弟均未到該病的發(fā)生年齡。這一延遲性發(fā)病的特點提醒我們在攜帶有Lys35Thr突變的遺傳性家系的檢查中對表現(xiàn)正常的成員有必要進行基因檢測以確定該位點是否發(fā)生了突變。從數(shù)據(jù)庫查詢以及100例健康人測序結(jié)果看，該家系玻璃體淀粉樣變性是由TTR基因2號外顯子第35位的密碼子發(fā)生了A>C(Lys35Thr)的雜合突變導(dǎo)致。有力的證明了TTR基因2號外顯子Lys35Thr的雜合突變是引起該家系玻璃體淀粉樣變性的原因。

注：A，先證者；B,對照組。

圖2 遺傳性玻璃體淀粉樣變性TTR基因第2號外顯子部分測序結(jié)果

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(本文編輯：許曉蒙)

Pathogenic gene mutation in a Han Chinese family with hereditary vitreous amyloidosis identified by Sanger sequencing

ZHUPei-rana，WUQiu-yuea，YUMao-maoa，ZHANGMing-chaoa，NIMeng-xiaa，LIUShuai-meia，JINGWei-juna，ZHANGJinga，LIWei-weia，CAOJina，LIYia，XUEChun-yanb，XIAXin-yia

(JinlingHospital，NanjingUniversitySchoolofMedicinea．InstituteofClinicalLaboratoryMedicine，PLA，b．OphthalmologyDepartment，Nanjing210002，Jiangsu,China)

Objective Our purpose was to investigate the pathogenic gene mutation of a Han Chinese family with vitreous amyloidosis. Methods The 9 individuals(proband, 1 affected member and 7 unaffected members) of the family were selected and their DNA was extracted from peripheral blood. The 4 exons of transthyretin(TTR) gene were amplified by polymerase chain reaction(PCR) technique. The amplified products ofTTRgene were sequencing by Sanger technique. We also selected 100 unrelated healthy individual as the control group. Results By DNA sequencing, a heterozygous mutation was found in 4 of the 9 subjects from the family. The transition of adenine to cytosine(AAG>ACG) was detectable in exon 2 ofTTR, which changed the amino acid composition at codon 35(Lys35Thr). This mutation did not presented in control group. Conclusion The heterozygosis mutation ofTTRgene Lys35Thr should be a pathogenic mutation for the family with vitreous amyloidosis.

vitreous amyloidosis; transthyretin; gene mutation

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.07

南京軍區(qū)總醫(yī)院院管題(2015046)；南京市科技計劃項目(201605004)。

朱培冉，1990年生，男，碩士研究生，研究方向為分子遺傳學(xué)；吳秋月，1989年生，女，技師，碩士，研究方向為分子遺傳學(xué)。二人對該研究具有同等貢獻，同為第一作者。

夏欣一，副主任醫(yī)師，副教授，E-mail: xxybio@126.com;薛春燕，副主任醫(yī)師，博士，E-mail：xuechunyancn@163.com。

R776.4

A

2017-01-18)