時永輝，王成，閆巖，郭鵬濤，張辰宇，汪俊軍，張春妮

(1.南京總醫(yī)院臨床檢驗科，南京 210002；2.中國人民解放軍第41醫(yī)院檢驗科，西藏乃東 856000；3.南京大學生命科學學院，南京 210093)

藏族和漢族健康人群血漿miRNA表達譜的差異*

時永輝1，王成1，閆巖1，郭鵬濤2，張辰宇3，汪俊軍1，張春妮1

(1.南京總醫(yī)院臨床檢驗科，南京 210002；2.中國人民解放軍第41醫(yī)院檢驗科，西藏乃東 856000；3.南京大學生命科學學院，南京 210093)

目的 檢測并比較藏族和漢族健康人群血漿miRNA表達譜。方法 分別采集246例藏族健康人和128例漢族健康人血漿樣本，用TaqMan低密度芯片技術(shù)對50例藏族和50例漢族組成的2組人混合血漿中的754種miRNA進行檢測，隨機選取存在miR-130a-3p和miR-629-5p表達差異的樣本，用qRT-PCR法進行驗證。結(jié)果 低密度芯片結(jié)果顯示，藏族和漢族健康人群血漿中miRNA表達譜的相關(guān)系數(shù)(r)為0.592。與漢族組相比,藏族組血漿中139種miRNA的表達水平發(fā)生明顯改變，其中62種miRNA表達上調(diào)，77種miRNA表達下調(diào)。qRT-PCR進一步證實miR-130a-3p 和 miR-629-5p在藏族組血漿中的含量明顯高于漢族組[(467±27.30) ×10-5vs(236±9.69) ×10-5和(14.67±0.94)×10-5vs(7.58±0.52)×10-5，P均<0.01]。結(jié)論 藏族人群血漿miRNA的表達譜與漢族人群存在明顯差異，臨床檢測miRNA時應(yīng)考慮民族因素的影響。

藏族；漢族；血漿微小核糖核酸； 表達譜

微小核糖核酸(microRNA，miRNA)是一類長度為22個核苷酸的非編碼RNA，其在轉(zhuǎn)錄后水平通過降低或阻斷信使RNA的翻譯，從而調(diào)節(jié)基因的表達，參與多種生理、病理過程[1]。miRNA能夠穩(wěn)定存在于人血液循環(huán)中，并且是多種腫瘤或非腫瘤性疾病的潛在生物學標志物[2-4]。人循環(huán)miRNA表達水平受年齡、性別等因素的影響[5]，但不同種族、民族間循環(huán)miRNA表達譜是否存在差異目前的報道較為少見。本研究采用高通量的miRNA低密度芯片結(jié)合實時熒光定量PCR(qRT-PCR)法，對我國西藏地區(qū)藏族和漢族健康人群血漿miRNA表達譜進行比較分析。報道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對象 于2013年6-12月，中國人民解放軍第41醫(yī)院檢驗科采集的體檢健康的藏族人血漿樣本246例(男149例，女97例；年齡36.5±13.2歲)。以同時間段到南京總醫(yī)院進行體檢健康的南京及周邊地區(qū)漢族人128例(男76例；女52例；年齡34.7±9.7歲)血漿樣本為對照。所有入選對象均經(jīng)病史詢問、影像學檢查和實驗室檢查，且排除血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、高血壓、心臟病、全身免疫性疾病、急慢性感染性疾病等干擾性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學委員會批準，研究對象知情同意。

1.2 樣本采集 用EDTA-K2抗凝真空采血管采集各研究對象禁食12 h以上靜脈血，迅速在室溫下以1 500×g離心10 min。用Eppendorf(EP)管收集分離的血漿，置于-80 ℃保存。

1.3 主要儀器及試劑 5418高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司)，ABI 7300實時熒光PCR儀(美國Applied Biosystem公司)，XE-2100全自動血液分析儀(日本Sysmex公司)；Trizol試劑(美國Invitrogen公司)，人工合成peu-MIR2911、microRNA引物和探針 (美國Applied Biosystem公司)；逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系、qRT-PCR反應(yīng)體系(日本TaKaRa公司)。

1.4 血漿RNA提取

1.4.1 低密度芯片所用RNA的提取 隨機選取藏族和漢族血漿樣本各50例，分別混合得到2組混合血漿(每例標本取250 μL，每組總體積12.5 mL)。按文獻[3]并作適當改進，用Trizol試劑分別提取2份血漿總RNA。步驟：按照混合血漿體積1∶2的比例加入Trizol試劑，混勻，室溫靜置15 min。加入1/5 Trizol體積的氯仿溶液，混勻，室溫靜置15 min，4℃、10 000×g離心15 min。取上清，加入等體積的水飽和酚，混勻，4 ℃、10 000×g，離心15 min。取上清，分別加入上清液體積1/2的水飽和酚和氯仿、等體積的氯仿、等體積的異丙醇，每次加入前均混勻，4 ℃、10 000×g離心15 min。然后冰上沉淀60 min， 4 ℃、10 000×g離心30 min。每管加入1 mL Trizol試劑洗滌沉淀，4 ℃、12 000×g離心15 min。取沉淀，分別用氯仿、異丙醇、乙醇洗滌沉淀。最后加入20 μL的DEPC處理的ddH2O溶解沉淀，測定并記錄RNA濃度。委托上海英濰捷基公司對上述2組混合血漿的RNA樣本進行低密度芯片檢測，共檢測人類基因組中的754種miRNA。

1.4.2 qRT-PCR所用RNA的提取 取上述混合血漿參照文獻[3]并作適當改進，采用苯酚氯仿抽提法進行。在RNA提取過程中加入外源性向日葵屬的植物miRNA(MIR-2911序列：5′-GGCCGGGGGACGGGCUGGGA-3′)以控制樣本提取純化過程中的差異。步驟：100 μL血漿中加入300 μL焦碳酸二乙酯DEPC處理的ddH2O混勻，加入200 μL水飽和酚劇烈震蕩，室溫靜置2 min，加入20 μL 103pmol/L外源MIR-2911(最終濃度106fmol/L)，再加入200 μL 氯仿，劇烈震蕩，室溫靜置5 min后于4 ℃、12 000×g離心5 min。取上清，加入上清1/10體積的醋酸鈉溶液(3 mol/L，pH=5.3)，再加入上清2倍體積的異丙醇，渦旋混勻后置-20 ℃靜置1 h，4 ℃、12 000×g離心20 min。留取RNA沉淀，加入1 mL 75%乙醇，渦旋混勻，洗滌RNA沉淀，4 ℃、12 000×g離心20 min。去上清，留沉淀，室溫晾干10 min后加入20 μL DEPC處理的ddH2O溶解RNA沉淀。待RNA完全溶解后置-80 ℃保存。

1.5 qRT-PCR 用基于TaqMan探針的qRT-PCR法檢測246例藏族血漿標本和119例漢族血漿樣本中miR-130a-3p和miR-629-5p表達水平。參照文獻[3]進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。qRT-PCR所用引物及探針由美國ABI公司設(shè)計并合成。qRT-PCR總反應(yīng)體系為20 μL，包括ddH2O 14.77 μL、10×PCR緩沖液2 μL、25 mmol/L MgCl21.2 μL、10 mmol/L dNTP 0.4 μL、Taq酶0.3 μL、探針及上、下游引物0.33 μL，cDNA 1 μL。循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環(huán)。每個樣本設(shè)3個復(fù)孔，以DEPC處理的ddH2O作為陰性對照。血漿中miRNA的含量采用相對定量方法(2-ΔCt)進行計算。低密度芯片檢測結(jié)果用 Ct值表示，以U6作為內(nèi)參照，藏族標本相對于漢族標本中miRNA的變化倍數(shù)用2-ΔΔCt法計算(△Ct=CtmiRNA-CtU6snRNA;ΔΔCt=△Ct藏族-△Ct漢族)。

2 實驗與結(jié)果

2.1 血漿miRNA低密度芯片檢測結(jié)果 Pearson相關(guān)性分析顯示，藏族和漢族血漿中miRNA表達譜的相關(guān)系數(shù)r=0.592(P<0.01)。參照文獻[6], 以Ct值<35，變化倍數(shù)>2為篩選標準，低密度芯片結(jié)果顯示與漢族相比，藏族血漿中有62種miRNA表達上調(diào)，77種miRNA表達下調(diào)。

2.2 MIR2911作為血漿miRNA外參照的評價

2.2.1 MIR2911檢測限、線性范圍及檢測重復(fù)性評價 將人工合成的MIR2911成熟體(原液為1 μmol/L)稀釋成不同的濃度梯度(0.1至106fmol/L)。用qRT-PCR方法檢測不同濃度下的MIR2911的含量，繪制曲線并分析MIR2911的檢測限及線性范圍。結(jié)果顯示，MIR2911的最低檢測限為1 fmol/L。qRT-PCR檢測MIR2911濃度為102～106fmol/L時的線性方程為Y=-3.131X+34.81,R2=0.999,P<0.01。提示在102～106fmol/L范圍內(nèi)Ct值與MIR2911濃度之間的線性關(guān)系良好。

2.2.2 MIR2911的檢測重復(fù)性 取10例健康人對照血漿樣本進行等量(每例100 μL)混合，混勻后，將混合血漿平均分成10份。然后將10份血漿按上前述方法進行RNA提取，提取過程中每份血漿中加入20 μL濃度為106fmol/L的MIR2911。按照上述方法進行逆轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR檢測樣本中MIR2911的含量以測定檢測重復(fù)性。結(jié)果顯示10份混合血漿中MIR2911的Ct值差異無統(tǒng)計學意義(F=0.943,P=0.516)，見圖1。提示MIR2911的提取及檢測的重復(fù)性良好，可作為血漿 miRNA的外參照。

圖1 MIR2911的重復(fù)性

2.3 血漿miRNA的qRT-PCR驗證結(jié)果 從62種在藏族血漿中表達上調(diào)的miRNA中選取2種miRNA： miR-130a-3p 和 miR-629-5p(Ct值分別為漢族的1 021倍和505倍)，用 qRT-PCR法在246例藏族和119例漢族血漿樣本中進行驗證，結(jié)果表明與漢族相比，miR-130a-3p [(467±27.30)×10-5vs(236±9.69)×10-5](t=9 257,P<0.01)和 miR-629-5p [(14.67±0.94)×10-5vs(7.58±0.52)×10-5](t=8 189,P<0.01)在藏族血漿中的含量明顯增加。與低密度芯片驗證結(jié)果相符。

3 討論

越來越多的研究顯示，miRNA是潛在的非侵入性分子標志物。然而其是否受種族、民族以及環(huán)境等影響因素不甚了解。本研究分析比較了藏族和漢族人血漿miRNA表達譜的異同。首先利用低密度芯片技術(shù)對2個民族健康人群血漿中754種miRNA的表達進行初篩，發(fā)現(xiàn)2個民族間血漿miRNA的表達譜存在較大差異，兩者相關(guān)性較低。與漢族相比，藏族血漿中有62種miRNA表達上調(diào)，77種miRNA表達下調(diào)。進一步用qRT-PCR法對其中的miR-130a-3p和 miR-629-5p進行驗證，結(jié)果與低密度芯片相符，該2個miRNA在藏族血漿中的含量顯著高于漢族。以上結(jié)果提示，藏漢族之間血漿miRNA的表達譜存在明顯差異。

以往研究發(fā)現(xiàn)，在缺氧情況下機體、細胞中的一些miRNA的表達水平會發(fā)生變化，除此之外，在與缺氧相關(guān)的疾病中一些miRNA的表達水平也會發(fā)生改變。然而以上研究多集中在組織或細胞中的miRNA的表達水平上?？紤]到miRNA是應(yīng)對缺氧的關(guān)鍵因素，筆者推測高原低氧環(huán)境可能對人循環(huán)miRNA的表達也存在影響。本研究發(fā)現(xiàn)的在藏族血漿中含量升高的miR-130a-3p已被證實缺氧情況下，其在細胞內(nèi)的表達水平升高[7]。此外，我們還通過生物信息學技術(shù)分析預(yù)測miR-130a-3p的某些靶基因與氧敏感性及氧代謝有關(guān)。而miR-130a-3p能夠通過靶向調(diào)節(jié)DDX6進而增強缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的作用來調(diào)節(jié)細胞對缺氧的反應(yīng)[6]。miR-629-5p的某些靶基因也與氧敏感性及氧代謝有關(guān)。例如，缺氧誘導因子3(HIF-3)作為miR-629-5p的靶基因，能在缺氧情況下激活特異的轉(zhuǎn)錄過程以應(yīng)對低氧環(huán)境[8]。此外，本研究通過低密度芯片發(fā)現(xiàn)的在藏族血漿中表達變化的一些miRNA(如miR-21、miR-24、miR-30b和miR-224)也有文獻證實與哺乳動物內(nèi)細胞缺氧反應(yīng)有關(guān)[9-10]。由此推測，藏族與漢族人血漿miRNA表達譜的不同，不僅與民族差異有關(guān)，還可能與2個民族所處環(huán)境條件有關(guān)，藏族人所處的高原缺氧環(huán)境對血漿miRNA的表達情況有一定的影響。此外，飲食生活習慣的差異可能也具有一定的作用。以上推測這些都需要深入研究加以證實。然而，由于實驗條件受限，本研究未對西藏地區(qū)的漢族人群進行分析，今后研究中將進一步證實。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)藏族和漢族人血漿miRNA表達譜存在明顯差異。在將來miRNA的臨床應(yīng)用時，應(yīng)充分考慮民族、環(huán)境等因素的影響。

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(本文編輯：許曉蒙)

Difference of miRNA expression profile in plasma between Tibetan and Han nationality

SHIYong-hui1,WANGCheng1,YANYan1,GUOPeng-tao2,ZHANGChen-yu3,WANGJun-jun1,ZHANGChun-ni1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,JinlingHospital,StateKeyLaboratoryofAnalyticalChemistryforLifeScience,NanjingUniversitySchoolofMedicine,NanjingUniversity,Nanjing210002,Jiangsu; 2.DepartmentofClinicalLaboratory,theForty-FirstHospitalofPLA,Nêdong856000,Tibet; 3.JiangsuEngineeringResearchCenterformicroRNABiologyandBiotechnology,AdvanceResearchInstituteofLifeSciences,NanjingUniversity,Nanjing210093,Jiangsu,China)

Objective To measure and compare the expression profiles of plasma miRNA between Tibetan and Han nationality. Methods Plasma samples were taken from 246 healthy Tibetans and 128 Han individuals. The randomly selected 50 Tibetan and Han plasma samples were pooled respectively and the levels of 754 miRNAs were examined using a TaqMan Low Density Array. Two markedly differentially expressed miRNAs，miR-130a-3p and miR-629-5p，were verified in all the plasma samples by individual qRT-PCR. Results The Low Density Array results showed that the correlation coefficient of expression profiles of plasma miRNA for the Tibetan and Han population was 0.592. Compared with Han population, the expression levels of 139 miRNAs were distinctly different, in Tibetan(62 up-regulated and 77 down-regulated). The levels of miR-130a-3p and miR-629-5p were further verified to be significantly higher in the plasma from Tibetans than those in the plasma from Han population [(467±27.30)×10-5vs(236±9.69)×10-5，P<0.01;(14.67±0.94)×10-5vs(7.58±0.52)×10-5，P<0.01] by qRT-PCR assay. Conclusion There may be marked difference of plasma miRNA expression profile between Tibetan and Han nationality. The influence of the nationality factors on miRNA profiles should be taken into account in the application of miRNAs in clinical detection in the future.

Tibetan nationality; Han nationality; plasma microRNA; profile

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.05

國家自然科學基金(81472021)；南京總醫(yī)院基金(2012041)。

時永輝，1972年生，男，副主任技師，大學本科，主要從事臨床檢驗工作。

張春妮，主任技師，博士，E-mail: zchunni27@hotmail.com。

R446.5

A

2016-11-29)