王曉敏 宣錦 盧芳國++田維毅 楊娟??蔡琨

【摘要】目的：觀察仙茅多糖對(duì)體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞分泌幾種活性因子的影響，以期探索仙茅多糖活化巨噬細(xì)胞的部分機(jī)制。方法：將仙茅多糖體外與RAW2647巨噬細(xì)胞共同培養(yǎng)36h，ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1的含量，Griess比色法檢測(cè)培養(yǎng)上清中NO的含量。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，仙茅多糖高、中劑量組TNF-α、IL-1和NO等活性因子的水平明顯升高（P<005或P<001），且與陽性對(duì)照組的調(diào)節(jié)趨勢(shì)相似。結(jié)論：仙茅多糖刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1和NO等活性因子可能是其活化巨噬細(xì)胞的重要機(jī)制。

【關(guān)鍵詞】仙茅多糖（COP）；巨噬細(xì)胞；活性因子；腫瘤壞死因子-α；一氧化氮；白介素-1

【中圖分類號(hào)】R2855【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號(hào)】1007-8517（2017）07-0032-04

The Effect of Polysaccharide Extracted from Curculigo Orchioides Gaertn on Several Active Factors in RAW2647 Cells

WANG Xiaomin1XUAN Jin1LU Fangguo3TIAN Weiyi1YANG Juan2*CAI Kun1，3*

1.Guiyang college of traditional Chinese medicine，Guiyang 500025，China；2. Natural products chemistry，Chinese academy of sciences key laboratory of guizhou province，Guiyang 550002，China；3.Hunan University of Chinese Medicine，Changsha 410208，China

Abstract：Objective To investigate the effect of Polysaccharide extracted from Curculigo Orchioides Gaertn（COP） on several active factors in RAW2647 cells and explore the partial mechanism of how COP activates macrophages.Methods Macrophages co-culture with COP for 36h in vitro. TNF-α and IL-1 production of the cells induced by COP were measured by ELISA.NO production in supernatant was measured by Griess reagent.Results Compared with normal control group，COP significantly increased TNF-α、IL-1和NO production （P<005 or P<001）in 12500 and 6250μg/mL COP groups.And its adjustment trend is similar with the LNT group.Conclusion The effect of COP on these active factors in RAW264.7 cells may be the most important mechanism of how it activates macrophages.

Keywords：COP；Macrophages； Active Factors；TNF-a； NO ；IL-1

研究表明，多數(shù)中藥多糖類成分具有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，且相對(duì)毒性較低，是開發(fā)免疫調(diào)節(jié)制劑的較好來源[1-6]。中藥仙茅為石蒜科多年生草本植物仙茅（Curculigo orchioides Gaertn）根莖，具有補(bǔ)腎助陽、益精血、強(qiáng)筋骨、行血消腫等功效，主要用于腎陽不足、虛勞內(nèi)傷等癥[7]，是貴州苗族人民常用的一種藥物。仙茅多糖（Curculigo orchioides Gaertn polysaccharide，COP）是從仙茅中經(jīng)水提醇沉后得到，前期研究發(fā)現(xiàn)，COP具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化作用[8-9]，并觀察到COP可以增強(qiáng)環(huán)磷酰胺所致的免疫低下小鼠模型的免疫功能，且對(duì)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的作用尤為顯著，但機(jī)制尚不清楚。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的抗原提呈細(xì)胞，其分泌的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1（IL-1）、一氧化氮（NO）等活性因子，是巨噬細(xì)胞參與特異性免疫應(yīng)答的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[10-14]。為了研究COP對(duì)巨噬細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)機(jī)制，研究主要觀察COP對(duì)小鼠RAW2647巨噬細(xì)胞釋放TNF-α、IL-1、NO等活性因子的影響。香菇多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗衰老作用且具有組分單一、質(zhì)量穩(wěn)定、療效好、毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)[15]，它具有激活巨噬細(xì)胞的能力，并且已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外臨床，故研究選取其為陽性對(duì)照藥物。

1儀器與材料

[JP+1]11儀器USA3131水套式CO2培養(yǎng)箱（美國熱電）；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國熱電）；離心機(jī)（德國）。[JP]

12材料Mouse TNF-α ELISA試劑盒（批號(hào)：DKW12-2720-096）、Mouse IL-1β ELISA試劑盒（DKW12-2012-096）購自北京達(dá)科為生物技術(shù)有限公司； NO檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：E03N0041，BLUEGENE）； Dulbeccos Modified Eagle Media（DMEM）培養(yǎng)液（批號(hào)，SH3002201HyClone）；胎牛血清FBS（批號(hào)：20150914，浙江天杭生物科技有限公司）、胰酶（批號(hào)：J140032，HyClone，）以及香菇多糖LNT（批號(hào)：C11N6Y5663，上海源葉生物科技有限公司）。

13實(shí)驗(yàn)細(xì)胞小鼠單核巨噬細(xì)胞細(xì)胞（RAW 2647細(xì)胞）購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)昆明細(xì)胞庫，編號(hào)為：KCB200603YJ。

14[JP3]實(shí)驗(yàn)藥物仙茅多糖由貴州省中國科學(xué)院天然化學(xué)產(chǎn)物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，多糖含量≥50%。多糖溶于DMEM中配制成濃度為50000μg/mL的母液，濾菌后4℃保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用DMEM培養(yǎng)液稀釋即得。[JP]

2方法

21細(xì)胞分組及處理參考文獻(xiàn)方法[16]，選取對(duì)數(shù)生長期的RAW2647細(xì)胞并調(diào)濃度為106個(gè)/mL。接種至無菌96孔板中（100μL/well），總共21孔，隨機(jī)分為COP高、中、低劑量實(shí)驗(yàn)組、陽性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每個(gè)樣本濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。[JP3]待細(xì)胞貼壁后，吸棄上清，分別加入含COP（終濃度為12500、6250、3125μg/mL）的DMEM[JP]完全培養(yǎng)基；陽性對(duì)照組加入含香菇多糖的培養(yǎng)基（終濃度為6250μg/mL）；空白對(duì)照組加入等量的培養(yǎng)基，完成后置于37℃、5%的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。

22指標(biāo)檢測(cè)細(xì)胞孵育36h后，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。嚴(yán)格按照鼠TNF-α/ IL-1細(xì)胞因子ELISA試劑盒操作說明分別檢測(cè)培養(yǎng)上清中的TNF-α和IL-1含量；Griess比色法檢測(cè)細(xì)胞上清中的NO水平，采用酶標(biāo)儀于450nm處讀數(shù)，最后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各活性因子的含量。

23統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)采用SPSS 190軟件統(tǒng)計(jì)分析，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x[TX-*3]±s）

表示，組間比較采用單因素方差分析法，P<005表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

在COP對(duì)巨噬細(xì)胞釋放活性因子水平的影響中，與空白對(duì)照組比較：COP高劑量組TNF-α的分泌量明顯升高（P<005）；COP高、中劑量組NO的分泌量明顯升高（P<001）；COP高、中劑量組IL-1的分泌量明顯升高（P<001）。與陽性對(duì)照組比較：COP高劑量組TNF-α較陽性對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）；COP高、中劑量組均能提高巨噬細(xì)胞NO的分泌量，較陽性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<001）；COP各劑量組對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-1的水平較陽性對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<005）。

仙茅是藥用植物，其根莖具有益精血、強(qiáng)筋骨的功效，并與其中的多糖類成分密切相關(guān)。前期研究發(fā)現(xiàn)，仙茅多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能與促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬能力的作用，但機(jī)制不夠清晰。本實(shí)驗(yàn)旨在探索其作用機(jī)理并為進(jìn)一步的機(jī)制研究作好鋪墊。

巨噬細(xì)胞在正常機(jī)體的免疫防御過程中扮演著重要的角色，參與機(jī)體抗感染、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等過程[17]，是機(jī)體非特異性免疫防御的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，同時(shí)還是特異性免疫應(yīng)答過程中的重要參與者[18]。TNF-α、NO和IL-1是巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的活性因子，是巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬、抗原提呈作用的重要介質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，COP在終濃度3125～12500μg/mL作用于巨噬細(xì)胞均可影響TNF-α、NO和IL-1的分泌，且呈現(xiàn)較好的量效關(guān)系。

TNF-α主要由激活的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，參與免疫應(yīng)答、促進(jìn)抗炎反應(yīng)、促進(jìn)樹突狀細(xì)胞成熟和T細(xì)胞的增殖和激活，而且TNF-α是迄今為止抗癌活性最強(qiáng)的因子，不僅能增強(qiáng)宿主免疫力還能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[19-23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高劑量組COP刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α明顯升高（P<005），初步推測(cè)COP能夠活化巨噬細(xì)胞分泌TNF-α來增強(qiáng)宿主免疫力，并發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。IL-1是活化巨噬細(xì)胞分泌的重要細(xì)胞因子，能促進(jìn)B淋巴細(xì)胞分泌IL-12和增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能，在體內(nèi)外通過間接或直接的方式產(chǎn)生相關(guān)作用[4，12，20，24-25]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高、中劑量組COP處理巨噬細(xì)胞后，培養(yǎng)上清中的IL-1出現(xiàn)顯著性上升（P<001），所以COP可能是通過激活巨噬細(xì)胞釋放IL-1來加強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答反應(yīng)的。巨噬細(xì)胞受刺激活化后產(chǎn)生的NO具有細(xì)胞毒作用，可殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)也是炎癥反應(yīng)中的重要信使分子，既是炎癥反應(yīng)與免疫調(diào)節(jié)的效應(yīng)因子，也是關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[20，24，26]。高、中劑量組COP處理巨噬細(xì)胞后，培養(yǎng)上清中的NO出現(xiàn)顯著性上升（P<001），依據(jù)結(jié)果推斷，COP可刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生活性物質(zhì)NO來參與免疫調(diào)節(jié)和炎癥反應(yīng)。

[JP+1]本實(shí)驗(yàn)中，COP對(duì)這三種活性因子的促分泌作用存在不同的敏感性，這種差異性可能為其以后臨床應(yīng)用于不同適應(yīng)癥療效提供一定的理論參考基礎(chǔ)，且COP對(duì)巨噬細(xì)胞的調(diào)節(jié)趨勢(shì)與香菇多糖組相似。表明COP可能是通過激活巨噬細(xì)胞并分泌TNF-α、NO和IL-1這三個(gè)活性因子來參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程的。但其具體機(jī)制尚不清楚。

[JP+1]綜上，筆者認(rèn)為COP的這種增強(qiáng)免疫低下小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力和促正常巨噬細(xì)胞TNF-α、NO和IL-1分泌的作用有助于巨噬細(xì)胞吞噬病原微生物或腫瘤凋亡細(xì)胞，也有助于機(jī)體對(duì)抗異物入侵和抗腫瘤。這些作用可能都是現(xiàn)代免疫學(xué)研究中機(jī)體免疫調(diào)節(jié)和防治腫瘤的藥理學(xué)基礎(chǔ)。

[JP]

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