周珊珊，應圣達，符 杰，金美青(.浙江工業(yè)大學 環(huán)境學院，浙江 杭州3004; .杭州電子科技大學 材料與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 3008)

底泥得克隆污染在斑馬魚胚胎上的積累效應

周珊珊1，應圣達1，符 杰1，金美青2
(1.浙江工業(yè)大學 環(huán)境學院，浙江 杭州310014; 2.杭州電子科技大學 材料與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310018)

得克隆(Dechlorane plus, DP)是一種典型的多氯代阻燃劑，在大氣、水、土壤和生物中都有檢出，但是有關其在生物體中可積累性的研究仍十分匱乏.本實驗以斑馬魚胚胎為模式生物，研究了吸附于底泥中的得克隆在斑馬魚體中的積累效應.結果表明：染毒底泥中斑馬魚胚胎的孵化率與空白樣品均>90%,無顯著性差異.目標化合物在底泥中染毒均勻，斑馬魚胚胎在染毒底泥中暴露192 h，得到的相應生物/底泥累積因子(BSAF)值，與DP高殘留區(qū)所測值相當，但染毒水平對BSAF值的影響明顯.斑馬魚體內(nèi)DP的fanti值低于底泥，說明DP異構體在斑馬魚胚胎/幼魚體內(nèi)發(fā)生選擇性積累或代謝.

底泥；得克??；斑馬魚胚胎；積累效應

阻燃劑作為功能性助劑，它給予易燃物以難燃性，常被用于塑料、紡織品、表面加工和涂層等人造材料，其能夠抑制、降低或延緩火焰燃燒，從而在一定程度上遏止火勢的蔓延.得克隆(Dechlorane plus，DP)是上個世紀70年代開始生產(chǎn)的一種高氯代阻燃劑，與多種POPs(如氯丹、艾氏劑、狄氏劑、異狄氏劑、七氯等)具有類似的結構特征，因此隨著DP產(chǎn)量及使用量的增加，有關其環(huán)境殘留、生物積累能力及生態(tài)毒性的研究逐漸升溫.已有研究表明：DP在大氣、室內(nèi)灰塵、土壤和沉積物等各類環(huán)境介質(zhì)和生物體內(nèi)均有檢出[1-4].鑒于DP極高的疏水性(logKow=9.3)，底泥是該類化合物在水體中的主要分布相.通過水生生物吞食底泥或水生生物擾動導致底泥中的DP二次釋放而積累至水生生物體內(nèi)，是DP進入食物鏈的途徑之一.研究表明：我國各河流流域及沿海地區(qū)的底泥中均檢測到明顯的DP殘留，如松花江[5]，長江水系[6]，珠江水系[7]，黃、渤海海域[8]、珠江口地區(qū)[9]、膠州灣和套子灣[10]等.而部分有顯著DP污染源的地區(qū)，如DP生產(chǎn)商Oxychem公司臨近湖泊[11-12]以及我國的某電子垃圾拆卸地[13]，其底泥中的DP殘留甚至高達1 990 ng/g干重.但是，目前有關底泥中DP生物積累效應的研究非常匱乏.

斑馬魚被廣泛應用于生物積累及毒性實驗，因其實驗可行性高，結果反映準確真實.而魚類早期發(fā)展階段對化學物質(zhì)特別敏感，再加上容易生產(chǎn)、照顧以及體型小的特點，非常適合化學分析.因此，斑馬魚胚胎進行生物積累及毒性試驗已被建議作為進行風險評估時的替代方法.另外，斑馬魚胚胎試驗允許高通量的分子篩選，節(jié)省了可觀的時間和金錢.綜上所述，以斑馬魚胚胎為模式生物，研究底泥中DP在水生生物中的積累效應，并對底泥中DP的生物可利用性以及可能的生態(tài)風險進行初步評價.

1 實驗部分

1.1 實驗試劑與材料

syn-DP(99.8%)和anti-DP(97.5%)標樣購自美國Accustandard公司，DPMA(>98%)，αCl10DP(>98%)和αCl11DP(>98%)購自美國惠靈頓實驗室(Wellington laboratories)，13C-PCB 141，13C-PCB 202和13C-PCB 208由美國劍橋同位素實驗室(Cambridge isotope laboratories)提供.DP工業(yè)品(>95%)由江蘇安邦電化有限公司[12]提供.無水Na2SO4(分析純)、中性Al2O3(50～200 μm)和超純硅膠(70～230目)在使用前分別經(jīng)高溫灼燒活化后置于干燥器中密封保存,其中無水硫酸鈉的活化條件為在450 ℃下活化6 h，氧化鋁在450 ℃活化4 h，超純硅膠在180 ℃下活化12 h，所用有機溶劑均為色譜純.

1.2 染毒底泥的制備

實驗底泥取自安徽六安地區(qū),經(jīng)緯度(116°23′83.46″, 31°61′21.48″)底泥中有機碳的含量按照國標GB 07314，以元素分析儀測定.本實驗所用底泥有機碳1.29%.

干法染毒：以丙酮溶解DP工業(yè)品配制質(zhì)量濃度為500 mg/L的儲備液，取適量儲備液用丙酮稀釋至20 mg/L用于染毒；將10 g石英砂平鋪于500 mL燒杯中，用移液管移取5 mL染毒液緩慢滴于石英砂上使其浸沒，將燒杯敞口置于通風櫥中；待燒杯中丙酮揮發(fā)至約剩0.5 mL時，加入20 g底泥與石英砂混合，繼續(xù)將170 g底泥分次加入燒杯進行攪拌；攪拌30 min后加入適當去離子水至粘稠適宜攪拌狀態(tài)，置于自動攪拌器上攪拌72 h(每日檢查含水狀態(tài))；攪拌完成后，置室溫陰涼處自然風干，避光保存.染毒底泥中目標化合物包括syn-DP，anti-DP及anti-DP的一氯；二氯降解產(chǎn)物αCl11DP和αCl10DP，具體質(zhì)量濃度，經(jīng)方法1.4提取；凈化后，以1.5所述方法測定.

1.3 斑馬魚養(yǎng)殖和暴露實驗

選取中國科學院武漢水生生物研究所的性成熟斑馬魚，在本實驗室條件下養(yǎng)殖、繁育.斑馬魚飼養(yǎng)于水溫為(27±1) ℃，晝夜光照周期比為12 h∶12 h的水循環(huán)系統(tǒng)中.養(yǎng)殖用水需預先經(jīng)過活性炭過濾(pH值7.2～7.6，硬度44～61 mg/L CaCO3).使用豐年蟲飼養(yǎng)斑馬魚，喂食頻率2次/d.

斑馬魚暴露實驗方法主要參考GARCIA等[14]的研究，并加以改進.具體為：斑馬魚放置于產(chǎn)卵玻璃箱中產(chǎn)卵，并在同一天，取10 g染毒底泥均勻平鋪于90 mm玻璃皿中，加入40 mL曝氣充分的去氯水覆蓋，室溫下避光靜置12 h，使底泥、孔隙水和上覆水三方達到平衡狀態(tài)，用滴管吸取35顆胚胎均勻放置于染毒底泥的表層進行暴露實驗.設置3個平行，每5個玻璃皿組成一個平行.玻璃皿置于(27±1) ℃，晝夜光照周期比為12 h∶12 h的環(huán)境中培養(yǎng).暴露實驗設置為靜態(tài)系統(tǒng)，不喂食，不換水.每24 h往培養(yǎng)皿補充一次去氯水來保持水分總量不變.加水時沿培養(yǎng)皿壁逐滴添加，以防止其對培養(yǎng)皿內(nèi)的底泥造成擾動.每天觀察培養(yǎng)皿內(nèi)斑馬魚生長狀況，記錄斑馬魚存活數(shù)量，在受精后192 h為發(fā)育終點.將每個平行組的斑馬魚收集于1.5 mL的離心管中，用移液槍充分吸干水分，記錄濕重，儲存于-20 ℃條件下待后續(xù)分析.用10 g空白土樣代替染毒土樣按上述方法得到空白魚樣.

1.4 樣品的處理與凈化

1) 底泥前處理[15].取2 g底泥于纖維濾筒中，加入示蹤標13C-PCB 141和13C-PCB 208，Cu粉0.5 g，以120 mL二氯甲烷為提取溶劑索式提取48 h，控制提取頻率在3～5次/ h；提取液經(jīng)旋轉蒸發(fā)濃縮、溶劑替換至0.5 mL正己烷；將濃縮后的提取液經(jīng)氧化鋁-硅膠復合層析柱凈化，柱內(nèi)填料從上至下為無水Na2SO4為2 g、活化中性Al2O3為3 g、活化中性硅膠為4 g和無水Na2SO4為2 g[16]，淋洗液為100 mL的V(正己烷)∶V(二氯甲烷)=7∶3的混合溶劑；將淋洗液在旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮至約2 mL，以正己烷替換后再次濃縮至2 mL左右；將濃縮液轉移至2 mL進樣瓶中，氮氣吹掃定容至1 mL，加入13C-PCB 202作內(nèi)標，保存于-20 ℃條件下待GC-MS分析.

2) 魚樣前處理.將冷凍保存的魚樣解凍，加入500 μL超純水，經(jīng)超聲波細胞破碎儀破碎(破碎程序設置：40%頻率，運行4 s，暫停20 s)，暫停期間用冰冷卻魚樣，重復破碎5次；魚樣破碎后轉移至50 mL離心管中，加入示蹤標13C-PCB 141和13C-PCB 208，向試管中加入8 mL混合V(正己烷)∶V(丙酮)=1∶1的混合溶劑，超聲萃取[17]10 min，離心后收集上清液，重復萃取3次，并向萃取液中加入無水Na2SO4，過濾除水；除水后的萃取液經(jīng)過旋轉蒸發(fā)，以正己烷替換溶劑后濃縮至2 mL左右，將濃縮液通過有機濾頭過濾；用柔和的氮氣吹掃定容至1 mL，加入內(nèi)標13C-PCB202，保存于-20 ℃條件下待GC-MS分析.

1.5 儀器分析

樣品的定量分析用氣相色譜-負化學電離-質(zhì)譜聯(lián)用法(Agilent 7890 GC / 5973 MS)測定，所用的氣相色譜柱為DB-5HT(15 m × 0.25 mm，0.25 μm)毛細管柱.

1) 色譜條件.進樣口的溫度設定為280 ℃，進樣方式為不分流，載氣為高純氦氣，載氣流量為1.0 mL/min，進樣量為1 μL；升溫程序：初始溫度為100 ℃，先以10 ℃/min升溫至250 ℃，再以3 ℃/min升至280 ℃，最后以20 ℃/min升至320 ℃并保持5 min.

2) 質(zhì)譜條件.傳輸線、離子源和四級桿的溫度分別設定為280，150，106 ℃；質(zhì)譜離子源選用負化學離子化電離源，以甲烷作為反應氣，在選擇離子模式(SIM)下進行定量分析；DP的兩個同分異構體syn-DP和anti-DP的m/z為653.8/651.8，anti-DP的一氯、二氯降解產(chǎn)物αCl11DP，αCl10DP的m/z分別為619.7/617.7和583.9/581.9，示蹤標13C-PCB141和13C-PCB208的m/z分別為372.0/370.0和475.8/473.8，內(nèi)標物13C-PCB 202的m/z為441.8/439.8.

1.6 質(zhì)量控制與保證

采用內(nèi)標法定量，各目標物標準曲線的相關系數(shù)均>0.999，內(nèi)標物和目標物的儀器信號響應相關系數(shù)均>0.995.以質(zhì)譜響應為10倍信噪比所對應的目標物含量作為實驗的方法檢出限，得到目標物syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP對底泥樣品的方法檢出限分別為0.43，0.49，0.54，0.29 pg/g(以干重計)，對斑馬魚樣品的方法檢出限分別為0.037，0.049，0.024，0.045 ng/g(以濕重計).本研究在測定斑馬魚樣品和底泥樣品前，以等量的無水Na2SO4代替底泥作為空白樣品，每處理6個樣品測定1次實驗室空白值，只測得anti-DP有少量的實驗室空白，均<0.3 ng/g(以干重計).本研究的目標物syn-DP，anti-DP，αCl10DP，αCl11DP和示蹤標13C-PCB 141和13C-PCB 208在底泥樣品中的染毒回收率分別為(98±11)%，(105±8)%，(92±13)%，(95±14)%，(95±8)%，(96±5)%，在斑馬魚樣品中的染毒回收率分別為(82±9)%，(93±6)%，(76±10)%，(79±11)%，(79±8)%，(82±3)%.

2 實驗結果與討論

2.1 得克隆工業(yè)品對斑馬魚胚胎孵化率的影響

表1顯示了斑馬魚胚胎暴露于染毒底泥以及空白底泥中192 h后，三個平行實驗的胚胎孵化情況.空白底泥與染毒底泥對比發(fā)現(xiàn)，斑馬魚胚胎的平均孵化率都在90%左右，說明對胚胎均無明顯急性毒性，實驗濃度設置合理.胚胎的少量死亡可能是魚本身排泄物對溶液的污染造成的[18]，也可能是生物適應環(huán)境的表現(xiàn)[19].

表1 空白及染毒底泥斑馬魚胚胎孵化率比較

Table 1 Comparison of zebrafish embryos hatchabilities in the blank and DP-spiked sediment

參數(shù)實驗組暴露組對照組孵化個數(shù)/胚胎總個數(shù)154/175167/175160/175163/175161/175167/175孵化率1)/%90.47±1.2195.03±1.67

注：1) 3個平行樣品的孵化率均值±標準偏差.

2.2 得克隆工業(yè)品在斑馬魚幼魚體內(nèi)的富集效應

2.2.1 得克隆工業(yè)品組成

圖1為質(zhì)量分數(shù)10-8的得克隆工業(yè)品GC-MS圖.從圖1可以看出：得克隆工業(yè)品中m(syn-DP)∶m(anti-DP)接近1∶4.這與之前報道[15]提及的中國DP生產(chǎn)廠家的DP工業(yè)品m(syn-DP)∶m(anti-DP)=2∶3有所差異.此外，得克隆工業(yè)品還存在一定量的αCl10DP和αCl11DP.αCl10DP和αCl11DP也可能是生產(chǎn)DP的過程中副產(chǎn)物或是DP儲存過程中降解導致的[20].

syn-DP和anti-DP的結構式分別為

圖1 得克隆工業(yè)品GC-MS圖Fig.1 GC -MS for the commercial product of DP

2.2.2 底泥染毒效果檢測

檢測底泥染毒效果，在染毒底泥中syn-DP，anti-DP，αCl10DP，αCl11DP的質(zhì)量分數(shù)分別為(120±3.6)，(500±15.5)，(8±0.16)，(30±0.42) ng/g(以干重計)，fanti=0.80.表2列出了從染毒底泥隨機3個位置，編號為A，B，C點取出的染毒底泥萃取凈化分析后的結果.每個取樣位置設置兩個平行.表2所示結果是在原來質(zhì)量濃度的基礎上稀釋20倍進樣得到的.

表2 染毒底泥染毒效果分析表

Table 2 Distributions of DP and its related compound in the spiked sediment

底泥污染物檢出質(zhì)量濃度/(μg·L-1)αCl10DPsyn-DPαCl11DPanti-DP樣本A11.5012.362.9149.32樣本A21.5413.953.1453.87樣本B11.5113.983.3553.64樣本B21.5913.713.2753.22樣本C11.5113.442.8452.47樣本C21.5312.813.0849.47

2.2.3 斑馬魚對底泥各目標物的積累效應

經(jīng)過192 h的暴露，染毒組斑馬魚幼體體內(nèi)同時檢測到syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP四種化合物，而空白組僅測到syn-DP和anti-DP.各化合物在魚體內(nèi)的質(zhì)量分數(shù)水平和相應的生物/沉積物富集因子(BSAFs)見表3.

經(jīng)過192暴露后，所有染毒組中的斑馬魚體內(nèi)富集的各目標化合物質(zhì)量分數(shù)相差較大，anti-DP富集量最大，達到(36.84±4.28) ng/g(以濕重計)，syn-DP其次，為(11.93±1.61) ng/g (以濕重計)，而αCl11DP和αCl10DP的富集量分別為(2.05±0.23)ng/g(以濕重計)和(0.73±0.04) ng/g(以濕重計).暴露于空白底泥中，幼魚體內(nèi)syn-DP和anti-DP質(zhì)量分數(shù)分別為(1.49±0.25) ng/g(以濕重計)和(3.24±0.18) ng/g(以濕重計).與空白組相比，在染毒底泥暴露后的魚樣中syn-DP和anti-DP分別為前者的8倍及10倍，且αCl10DP和αCl11DP也有相當質(zhì)量分數(shù)的積累，說明這四種化合物可經(jīng)由底泥進入斑馬魚胚胎內(nèi).我組之前的研究[21]用Tenax-TA法測定沉積物中syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP的快解析速率常數(shù)Krap在0.071～0.091 h-1，與BDE-209的Krap值相當0.076 h-1[14]，暗示本實驗所涉及得克隆及相關化合物與BDE-209的生物可利用性相當.

通過計算BSAF值得到：anti-DP(0.013)，syn-DP(0.018)，αCl10DP(0.017)和αCl11DP(0.012).該數(shù)據(jù)與DP高殘留地區(qū)(底泥中syn-DP和anti-DP的有機碳質(zhì)量分數(shù)分別為(13 100±2 880)，(55 300±7 140) ng/g三種底層魚類(鯽魚、鯪魚、黑魚)體內(nèi)所測BSAFs具有可比性(<0.06)[22].據(jù)Wong等[23]研究，在高殘留區(qū)，由于DP異構體在底泥和魚之間未達到分配平衡，可能導致該地區(qū)的BSAF值低估該化合物實際的生物可利用性.另外，空白底泥中也有syn-DP和anti-DP檢出，其殘留質(zhì)量分數(shù)分別為(0.14±0.02)，(0.51±0.09) ng/g(以干重計).因此，我們進一步評價了暴露于空白底泥斑馬魚胚胎對DP異構體的積累效應.計算所得anti-DP和syn-DP的BSAF值均值分別為1.93和1.15.此結果與DP在其較低殘留區(qū)所測BSAFs值相近.比如，Shen等[24]測得，DP在美國安大略湖地區(qū)(底泥中總DP的質(zhì)量分數(shù)均值為110 ng/g，以干重計)底泥-鮭魚間的BSAFs均值約為0.6.Jia等[25]測得采集于中國北方海岸(底泥中syn-DP和anti-DP的質(zhì)量分數(shù)分別為(1.3±1.5)，(1,6±1.4) ng/g，以干重計)的牡蠣樣品中DP的BSAFs均值約為4.6.以上結果表明污染物的質(zhì)量分數(shù)對底泥中DP生物可利用性有一定的影響.

從表3中得出：斑馬魚胚胎在染毒底泥暴露的192 h后，DP的fanti由得克隆工業(yè)品中平均值為0.80變?yōu)榘唏R魚體內(nèi)的平均值0.76.這可能由DP異構體在斑馬魚體內(nèi)的選擇性積累或代謝造成.2007年，Tomy等[26]發(fā)表了關于DP在水生生物中蓄積情況的研究報道，將來自北美五大湖區(qū)域溫尼伯湖和安大略湖的幾種魚類進行檢測分析，發(fā)現(xiàn)DP的兩種異構體在溫尼伯湖魚類中的生物積累具有選擇性，anti-DP主要在高營養(yǎng)級的魚類中積累，而syn-DP則主要在低營養(yǎng)級的魚體內(nèi)積累，也就是說隨著營養(yǎng)級的升高anti-DP更有可能進行生物放大作用，或是syn-DP更容易被生物降解.本研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚幼魚體內(nèi)syn-DP濃度更高，與Tomy等[26]的研究結果一致.但Wu等[27]]的研究則發(fā)現(xiàn)中國南部電子回收垃圾場附近的水庫中，低營養(yǎng)層的生物較易富集anti-DP，而高營養(yǎng)級生物體內(nèi)則更容易富集syn-DP.之前的研究[28]表明了化合物同分異構體生物積累選擇性上的差異可由選定生物的食性、生境和所處營養(yǎng)級有關，同時t檢驗表明了αCl10DP和αCl11DP在各目標物中分別所占比例在暴露前后沒有顯著差異(P>0.05).

表3 各處理組斑馬魚體內(nèi)各目標物含量及BASFsTable 3 Concentrations of DP and its related compounds in zebrafish exposed in the blank and spiked sediments

3 結 論

本實驗所用批次的得克隆工業(yè)品由syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP組成，anti-DP占總DPs的比例接近80%.syn-DP，anti-DP，αCl10DP和αCl11DP在染毒底泥中分布均勻，染毒質(zhì)量分數(shù)分別為(120±3.6)，(500±15.5)，(8±0.16)，(30±0.42) ng/g(以干重計).該濃度與得克隆高污染區(qū)底泥中DP的殘留水平相當，且未明顯影響斑馬魚胚胎的平均孵化率.暴露于染毒底泥的斑馬魚體內(nèi)syn-DP，anti-DP，αCl10DP，αCl11DP的質(zhì)量分數(shù)分別(11.93±1.61)，(36.84±4.28)，(2.05±0.23)，(0.73±0.04) ng/g(以濕重計)，說明底泥中這四種化合物具有一定的生物積累能力.計算所得BSAFs值與環(huán)境高污染區(qū)相當，比較結果表明：污染質(zhì)量分數(shù)是影響底泥中DP及相關化合物的生物可利用性的重要影響因素，DP異構體在斑馬魚胚胎/幼魚體內(nèi)發(fā)生選擇性積累或代謝.

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(責任編輯：劉 巖)

Bioaccumulation of sediment-sounded dechlorane plus in zebrafish embryos

ZHOU Shanshan1, YING Shengda1, FU jie1, JIN Meiqing2
(1.College of Environment, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China；2.College of Material and Environmental Engineering, Hangzhou University of Electronic Scienceand Technology, Hangzhou 310018, China)

Dechlorane plus (DP) is one of typical chlorinated flame retardants, which can be detected in many environmental media such as atmosphere, water, and soil, as well as biological samples. However, the researches about the bioavailability of DP are relatively scarce. In the present manuscript, the bioaccumulation capacity of sediment-bounded DP into zebrafish embryo was studied. The results include: The hatchabilities of zebrafish embryos in the blank and spiked sediment were comparable and both higher than 90%. zebrafish embryos in infected 192 h exposure in the sediment,the results of their biota/sediment (BSAF) in zebrafish embryos we studied were comparable to those reported in high DP-polluted areas. However, the bioaccumulation capacities of DP were significantly influenced by the contaminant levels. Moreover, the varies offantibetween sediment and zebrafish suggested that the bioaccumulation and/or metabolism of DP in zebrafish embryos/juveniles were isomeric selective.

sediment; dechlorane plus; zebrafish embryos; bioavailability

2016-03-19

國家自然科學基金資助項目(21377117，21407038)；浙江省自然科學基金資助項目(LY13B070006,LQ14B070006)

周珊珊(1981—)，女，浙江慈溪人，副教授，研究方向為持久性有機污染物環(huán)境歸趨及生態(tài)毒理，E-mail:sszhou@zjut.edu.cn.

X522

A

1006-4303(2017)02-0200-06