張慧慧，張曉燕，李妍妍，孫子龍，王俊東

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

氟對(duì)大鼠睪丸支持細(xì)胞骨架蛋白mRNA的影響

張慧慧，張曉燕，李妍妍，孫子龍，王俊東

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西太谷030801）

試驗(yàn)以原代睪丸支持細(xì)胞為對(duì)象，通過(guò)膠原酶和胰酶的消化分離支持細(xì)胞，用HE染色及GATA-4免疫熒光對(duì)分離的支持細(xì)胞進(jìn)行鑒定；利用qRT-PCR法檢測(cè)不同濃度（0，0.1，1，10 mg/L）NaF對(duì)支持細(xì)胞骨架ARP2，ARPC3和ARPC4處理24 h后mRNA相對(duì)表達(dá)量，旨在研究氟對(duì)雄性生殖功能的影響。結(jié)果顯示，ARP2在0.1 mg/L NaF組mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），在10 mg/L NaF組mRNA相對(duì)表達(dá)量極顯著降低（P＜0.01）；ARPC4在10 mg/LNaF組mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；ARPC3的mRNA表達(dá)量沒(méi)有顯著變化。表明氟化鈉通過(guò)引起支持細(xì)胞骨架相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的下降，影響睪丸支持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而損傷睪丸的生精功能。

氟化鈉；雄性；生殖功能；支持細(xì)胞；骨架基因

氟是動(dòng)物體內(nèi)一種微量的必需的安全范圍較窄的元素，其攝入量過(guò)多或過(guò)少都會(huì)引起動(dòng)物的全身性不良反應(yīng)。研究表明，環(huán)境氟（包括地質(zhì)性高氟與工業(yè)氟污染）不僅影響人類(lèi)和動(dòng)物機(jī)體的健康，甚至對(duì)其生殖功能也會(huì)產(chǎn)生較大的毒副作用[1]。氟對(duì)雄性動(dòng)物方面的影響尤為突出，主要表現(xiàn)在精子損傷、精子數(shù)量減少和生育力降低[2-3]。

睪丸是一種雄性生殖器官，是生產(chǎn)性毒素主要的靶向器官。已有研究發(fā)現(xiàn)，銅中毒對(duì)雄性生殖的影響主要體現(xiàn)在對(duì)睪丸曲細(xì)精管內(nèi)的各級(jí)精元細(xì)胞造成破壞，導(dǎo)致精子形態(tài)異常，數(shù)量減少[4]。支持細(xì)胞位于睪丸的精細(xì)胞管內(nèi)，在精子發(fā)生期間為生殖細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和結(jié)構(gòu)支持[5]。形態(tài)學(xué)分析表明，睪丸中每個(gè)成熟的支持細(xì)胞對(duì)約30～50個(gè)發(fā)育的生殖細(xì)胞提供結(jié)構(gòu)和營(yíng)養(yǎng)支持[6]。支持細(xì)胞擁有一個(gè)組織有序、功能十分活躍的細(xì)胞骨架，支持細(xì)胞骨架由微絲、微管和中間纖維組成[7]。大量資料表明，生精過(guò)程的破壞伴隨著支持細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和功能的變化，ARP2，ARPC3和ARPC4都是屬于ARP2/3復(fù)合物的一部分，是細(xì)胞骨架組成的關(guān)鍵蛋白。ARP2/3復(fù)合物是含有ARP2，ARP3和ARPC1-5的7亞基蛋白復(fù)合物[8]。氟對(duì)雄性生殖器官的研究有很多，但對(duì)細(xì)胞骨架的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以大鼠睪丸支持細(xì)胞為研究對(duì)象，研究氟化鈉對(duì)支持細(xì)胞骨架蛋白ARP2，ARPC3和ARPC4的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響，旨在為進(jìn)一步探討氟對(duì)雄性動(dòng)物生殖功能的損傷機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物出生18～21 d的清潔級(jí)昆明種雄性大鼠（由山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中學(xué)提供）。

1.1.2 主要試劑氟化鈉（Sigma公司）；DMEM/F12培養(yǎng)基（Gibico公司）；胎牛血清FBS（Gibico公司）；胰蛋白酶（Sigma公司）；青鏈霉素混合液（Hyclone公司）；Ⅳ型膠原酶（Sigma公司）；TritonX-100（Amresco公司）；Trizol Reagent（Invitrogen公司）；Prime-ScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒（TaKaRa公司）；GATA-4（碧云天）；Goat Anti-Rabbit IgG（博士德生物技術(shù)公司）。

1.1.3 主要儀器倒置相差顯微鏡（Leica公司）；Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)Stratagene公司）；D-3752高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱（ThermoForma公司）。

1.2 方法

1.2.1 支持細(xì)胞的原代分離和培養(yǎng)取出生18～21 d雄性大鼠的雙側(cè)睪丸，分別用Ⅳ型膠原酶和0.25%的胰蛋白酶對(duì)睪丸組織進(jìn)行消化，待消化完全后，加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，用0.074 mm篩網(wǎng)過(guò)濾收集細(xì)胞，離心棄上清，用DMEM/F12完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，鋪板接種，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

支持細(xì)胞的低滲處理：48 h后，在倒置相差顯微鏡下觀察支持細(xì)胞。棄掉培養(yǎng)液，用PBS沖洗2次，加入20 mmol/mL，pH值7.4 Tris-HCl低滲2 min，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)液，即可得到純化的支持細(xì)胞。

1.2.2 HE染色選用第2代支持細(xì)胞進(jìn)行HE染色，用PBS沖洗貼壁細(xì)胞3次，每次5 min，用4%多聚甲醛固定后，依次加入蘇木精、伊紅進(jìn)行染色，經(jīng)梯度酒精脫水、透明及封片后，使用電子顯微鏡對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行拍照。

1.2.3 GATA-4免疫熒光鑒定選用接種于6孔板的支持細(xì)胞，經(jīng)4%的多聚甲醛固定、0.3%的Tritonx-100破膜、10%的山羊血清室溫封閉后，用抗體稀釋液對(duì)一抗進(jìn)行稀釋?zhuān)≧abbit Anti-GATA4抗體稀釋比例為1∶100，Rabbit Anti-BRG1抗體稀釋比例為1∶50），用含有FITC的抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4 cDNA的合成使用Trizol Reagent RNA試劑盒提取支持細(xì)胞各個(gè)濃度梯度組的總RNA，用PrimeScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于-80℃冰箱中保存。

1.2.5 引物設(shè)計(jì)在Genebank中查到相應(yīng)的RNA序列，利用Premier 3.0軟件設(shè)計(jì)引物，再將軟件設(shè)計(jì)的引物放回Genebank中對(duì)比，確定不會(huì)擴(kuò)增出其他的序列即可。引物序列列于表1。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物

1.2.6 qRT-PCR的反應(yīng)體系與反應(yīng)程序使用SYBRRPremix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄出的cDNA按照2×稀釋4個(gè)梯度，同時(shí)使用不添加模板的空白作陰性對(duì)照，反應(yīng)體系為10 μL：SYBRRPremixExTaqTMⅡ（2×）5 μL，F(xiàn)orward Primer 0.4 μL，Reverse Primer 0.4 μL，ROXRefe-rence DyeⅡ（50×）0.2 μL，cDNA模板2 μL，加已滅菌雙蒸水至10 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60℃30 s，72℃30 s，共45個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GraPHpad Prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，利用one-way analysis of variance（ANOVA）方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Dunnett's多重比較進(jìn)行檢驗(yàn)。*表示P＜0.05差異顯著，**表示P＜0.01差異極顯著，***表示P＜0.001差異非常顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 睪丸支持細(xì)胞的HE染色

由圖1可知，倒置顯微鏡觀察，支持細(xì)胞呈不規(guī)則的三角形和星形，胞體有3～4個(gè)突起，細(xì)胞質(zhì)完全鋪開(kāi)，有較大的表面積，染色淡，細(xì)胞核多位于基底，呈卵圓形，深染，核的長(zhǎng)軸與細(xì)胞的長(zhǎng)軸方向平行。

2.2 GATA-4免疫組化鑒定結(jié)果

通過(guò)免疫熒光的方法對(duì)GATA-4進(jìn)行染色，睪丸支持細(xì)胞是睪丸中唯一高表達(dá)GATA-4的細(xì)胞，并可在顯微鏡下觀察（圖2）。

2.3 目的基因mRNA表達(dá)的結(jié)果

由圖3可知，與對(duì)照組相比，ARP2的mRNA相對(duì)表達(dá)量有所降低，0.1 mg/L NaF組與對(duì)照組間差異顯著（P＜0.05），10 mg/LNaF組與對(duì)照組間差異極顯著（P＜0.01）；與對(duì)照組相比，ARPC4的表達(dá)量有所降低，且在10 mg/LNaF組與對(duì)照組間差異顯著（P＜0.05）；與對(duì)照組相比，不同質(zhì)量濃度的NaF組ARPC3 mRNA的表達(dá)量均無(wú)顯著性差異。

3 結(jié)論與討論

睪丸支持細(xì)胞是處于生精上皮的體細(xì)胞，它呈凸起的柱狀，整個(gè)細(xì)胞由基底膜延伸至管腔內(nèi)部[9]。各級(jí)生精細(xì)胞沿著支持細(xì)胞，完成自精原細(xì)胞至成熟精子所有形態(tài)和生理變化[10-11]。支持細(xì)胞是環(huán)境毒物對(duì)雄性生殖器官影響的主要靶細(xì)胞[12]。本試驗(yàn)選擇19～21日齡的雄性大鼠，是因?yàn)榇笫箅S著青春期的到來(lái)，支持細(xì)胞喪失了增殖能力，數(shù)量達(dá)到穩(wěn)定，而各級(jí)的精原細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較少，這個(gè)時(shí)期培養(yǎng)的細(xì)胞純度較高。支持細(xì)胞的培養(yǎng)在方法上運(yùn)用組合酶消化，先將睪丸組織制成單細(xì)胞懸液后，利用差速貼壁法來(lái)分離純化支持細(xì)胞。

支持細(xì)胞鑒定的方法有HE染色、吖啶橙熒光染色、富爾根染色、免疫熒光染色等[13-14]。本試驗(yàn)采用HE染色法進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的鑒定，支持細(xì)胞在倒置顯微鏡下觀察具有典型的形態(tài)特征；隨后用支持細(xì)胞特異性表達(dá)因子GATA-4通過(guò)免疫熒光的方法來(lái)鑒定。GATA-4是支持細(xì)胞中表達(dá)的一種轉(zhuǎn)錄因子，在間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)量很少，在生殖細(xì)胞中幾乎不表達(dá)[15]。對(duì)于雄性生殖系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，GATA-4可作為支持細(xì)胞的特異性標(biāo)記分子。

YANG等[16]研究表明，支持細(xì)胞的骨架形態(tài)和分布發(fā)生變化，直接影響著該細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，進(jìn)而影響生殖細(xì)胞的數(shù)量和質(zhì)量，最終導(dǎo)致精子發(fā)生障礙。成熟精子的生成包括精原細(xì)胞的增殖、精母細(xì)胞的減數(shù)分裂和精子細(xì)胞成熟[17]。在精子生成過(guò)程中，支持細(xì)胞為精子的發(fā)生提供了結(jié)構(gòu)支撐和發(fā)育所需的各種細(xì)胞因子[18]。正常情況下，生精細(xì)胞的各個(gè)發(fā)育階段在生精上皮都有特定的位置，而當(dāng)支持細(xì)胞骨架發(fā)生紊亂或者破壞時(shí)，就會(huì)引起精子在曲細(xì)精管內(nèi)的異常分布。支持細(xì)胞骨架的功能實(shí)現(xiàn)需要精確調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白聚合和解聚所引發(fā)的各種微絲的變化，肌動(dòng)蛋白相關(guān)蛋白ARP2/3復(fù)合物是本調(diào)節(jié)的中心參與者[19]。其中，ARP2與ARPC3一起，賦予支鏈肌動(dòng)蛋白聚合，將“束”肌動(dòng)蛋白絲改變?yōu)榉种?去捆綁的網(wǎng)絡(luò)，以促進(jìn)精子形成過(guò)程中精子細(xì)胞跨精細(xì)胞上皮的轉(zhuǎn)運(yùn)[20]。ARPC4作為ARP2/3蛋白復(fù)合物的7個(gè)亞基之一，在控制支持細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白起關(guān)鍵作用，是誘導(dǎo)肌動(dòng)蛋白成核所必需的。本研究結(jié)果表明，ARP2，ARPC4的mRNA相對(duì)表達(dá)量的降低，對(duì)細(xì)胞骨架的整體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞的同時(shí)，有可能導(dǎo)致精子細(xì)胞在形成過(guò)程中的錯(cuò)誤定位，精子細(xì)胞生成減少。

綜述所述，肌動(dòng)蛋白微絲的破壞會(huì)阻礙支持細(xì)胞的功能，進(jìn)而影響正常的生精過(guò)程，不過(guò)這并不能全面概述細(xì)胞骨架對(duì)雄性生殖系統(tǒng)研究的具體機(jī)制，這一問(wèn)題需要在今后研究中進(jìn)一步探討。

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Effects of Fluoride on mRNA Expression of Cytoskeleton Proteins in Rat Sertoli Cells

ZHANGHuihui，ZHANGXiaoyan，LI Yanyan，SUNZilong，WANGJundong
（College ofAnimal Science and VeterinaryMedicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China）

To explore the effect of fluoride on male reproductive,primary sertoli cells were isolated by means of the enzyme digestion method with trypsin and collagenase.The survival rate and the purity of cells were detected with the HE and the immunohistochemical analysis ofGATA-4.Then the cells were exposed to increasing NaF concentrations（0,0.1,1,10 mg/L）for 24 h. The expression level and distribution ofcytoskeletal gene ARP2,ARPC3 and ARPC4 were detected byquantitative real-time-polymerase chain reaction（qRT-PCR）.The results showed that the relative expression of ARP2 mRNA in 0.1 mg/L NaF group decreased significantly（P＜0.05）,and the relative expression of mRNA in 10 mg/L NaF group significantly decreased（P＜0.01）,the relative expression ofARPC4 mRNA in 10 mg/LNaF group decreased significantly（P＜0.05）.The expression of ARPC3 mRNA did not change significantly.In conclusion,sodium fluoride can decrease the relative expression of cytoskeleton-related genes,affect the structure and function oftesticular support cells,and then damage the testicular spermatogenic function.

NaF;male;reproductive function;sertoli cell;cytoskeletal gene

R114

A

1002-2481（2017）04-0557-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.16

2017-01-09

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31540061）

張慧慧（1991-），女，山西長(zhǎng)治人，在讀碩士，研究方向：環(huán)境獸醫(yī)學(xué)。王俊東、孫子龍為通信作者。