尹全，李憶，宋君，王東，敬媛

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川成都610066；2.四川民族學(xué)院，四川康定626001；3.甘孜州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，四川康定626001）

多重PCR檢測抗除草劑油菜RT73

尹全1，李憶2，宋君1，王東1，敬媛3

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，四川成都610066；2.四川民族學(xué)院，四川康定626001；3.甘孜州農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心，四川康定626001）

為了建立一種抗除草劑油菜RT73多重PCR檢測方法，試驗對抗除草劑油菜RT73分子特征信息進行分析，將外源插入基因P-FMV35S，T-E9 3′，CP4-EPSPS，GOX和油菜內(nèi)源參照基因CruA等5個基因作為多重PCR檢測參數(shù)，通過對多重PCR體系中引物退火溫度和引物濃度配比的優(yōu)化。結(jié)果顯示，獲得的多重PCR適宜的引物終濃度（μmol/L）配比GOX∶CruA∶P-FMV35S∶CP4-EPSPS∶T-E9 3′為0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1以及適宜的引物退火溫度為58℃；采用優(yōu)化后的反應(yīng)體系對多重PCR體系靈敏度進行測試，結(jié)果顯示，方法靈敏度為200個拷貝；最后利用建立的多重PCR方法對已知樣品進行檢測，結(jié)果表明，試驗建立的多重PCR體系具有良好的可靠性。

油菜；RT73；多重PCR；檢測

美國孟山都公司研發(fā)的抗除草劑油菜RT73是全世界種植最為廣泛的轉(zhuǎn)基因油菜品系，占全世界油菜種植面積的近45%[1]。在加拿大、日本、美國和澳大利亞，RT73品系已被批準(zhǔn)環(huán)境釋放，我國、歐盟等9個國家和地區(qū)也批準(zhǔn)進口RT73品系用于食品或飼料加工原料[2]。

隨轉(zhuǎn)基因植物種植面積的不斷增大，我國批準(zhǔn)進口用作食品或飼料加工原料也在不斷增多，輿論大眾愈發(fā)強烈關(guān)注轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的安全性問題，我國已在2002年制定實施了轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度[3]。很顯然，只有相關(guān)檢測轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展才能保證轉(zhuǎn)基因標(biāo)識制度的有效實施。目前，轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)主要分為蛋白和核酸檢測兩大類。由于核酸檢測技術(shù)中的常規(guī)PCR技術(shù)具有快速、敏感、簡便等許多優(yōu)點，而被作為轉(zhuǎn)基因檢測主流技術(shù)廣泛采用，我國轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品相關(guān)檢測國家標(biāo)準(zhǔn)中的方法大多采用常規(guī)PCR檢測技術(shù)。但利用核酸檢測技術(shù)進行檢測時，篩查檢測某個基因時往往不能確定樣品是否含有轉(zhuǎn)基因成分，這時就需對多個外源基因進行篩選以檢測確認(rèn)樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因外源基因成分。盡管常規(guī)PCR在轉(zhuǎn)基因檢測技術(shù)中優(yōu)勢明顯，但若是對多個外源基因分別檢測時，就存在花費時間多、操作繁瑣和成本高等缺點[4]。因此，為了解決常規(guī)PCR技術(shù)在檢測多個基因時存在的缺點，多重PCR應(yīng)運而生，從而被廣大科研工作者作為檢測工具研究建立方法篩查檢測未知樣品。該技術(shù)是將多對特異性引物加入一個PCR反應(yīng)體系中，針對多個DNA模板擴增多個目的片段[5-6]。由于操作簡便、節(jié)省時間、提高效率、降低成本的特點[7]，多重PCR被廣泛用于轉(zhuǎn)基因、病原菌和動物源性等方面的檢測[8-11]。

雖然國家標(biāo)準(zhǔn)中已有抗除草劑油菜RT73轉(zhuǎn)化體特異檢測方法，但為了豐富抗除草劑油菜RT73轉(zhuǎn)化體特異檢測，本研究對抗除草劑油菜RT73的內(nèi)源參照基因及插入的外源基因元件進行分析，預(yù)期建立1種包括外源插入基因P-FMV 35S，T-E9 3′，CP4-EPSPS，GOX和油菜內(nèi)源參照基因CruA的多重PCR檢測體系，旨在為抗除草劑油菜RT73的檢測提供另外一種檢測方法。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗材料均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心保存。

1.2 儀器及試劑

毛細管電泳儀（QIAxcel Advanced德國Qiagen公司），PCR儀（Veritee96-well，美國ABI公司），離心機（5424，德國eppendorf公司），DNA超微量分光光度計（NanoDrop 1000，美國Thermo公司）；引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成；Master Mix購于日本東洋紡績株式會社；植物基因組提取試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 引物序列設(shè)計特異性引物序列參照相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)（表1）。引物用TAE緩沖液稀釋至10μmol/L。

表1 試驗所用引物信息

1.3.2 樣品總DNA提取樣品總DNA提取采用試劑盒方法進行。

1.3.3 多重PCR方法的優(yōu)化建立

1.3.3.1 引物特異性反應(yīng)體系為25 μL，其中，Master Mix（2×）12.5 μL，引物對各1 μL，模板2 μL，ddH2O補足25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共運行35個循環(huán)；72℃延伸3 min。最后將樣品保存于4℃。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳分析，確定各引物對特異性。

1.3.3.2 多重PCR優(yōu)化反應(yīng)體系為25 μL，其中，Master Mix（2×）12.5 μL，5對引物中上下游引物各0.25 μL，模板2 μL，ddH2O補足25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，設(shè)置50，54，56，58，60，64℃共6個退火溫度梯度，退火30 s，72℃延伸30 s，共運行35個循環(huán)；72℃延伸3 min。最后將樣品保存于4℃。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳分析，確定引物退火溫度。

反應(yīng)體系為25 μL，其中，Master Mix（2×）12.5 μL，引物終濃度配比按照表2設(shè)置濃度梯度，模板2 μL，ddH2O補足25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性40 s，按照上一步確定的退火溫度退火30s，72℃延伸30 s，共運行35個循環(huán)；72℃延伸3 min。最后將樣品保存于4℃。PCR反應(yīng)結(jié)束后，將擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳分析，確定引物對終濃度配比。

表2 MPCR引物終濃度配比

1.3.4 多重PCR靈敏度分析基因組DNA用TAE緩沖液進行梯度稀釋至2 000，500，250，100，50，10個拷貝，使用多重PCR優(yōu)化后的反應(yīng)條件進行分析，確定五重PCR靈敏度。同時設(shè)置水空白對照，對檢測體系進行質(zhì)量控制。

1.3.5 多重PCR檢測已知樣品將優(yōu)化獲得的多重PCR檢測體系對已知樣品進行檢測驗證，設(shè)置水空白對照對檢測體系進行質(zhì)量控制。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品總DNA提取

通過超微量紫外分光光度計測定樣品總DNA，經(jīng)測定可知，所有樣品OD260/OD230均大于2.0，OD260/OD280均在1.8～2.0，最后用TAE緩沖液將各樣品總DNA稀釋至25 ng/μL待用。

2.2 多重PCR引物特異性

由圖1可知，在含有相關(guān)基因的樣品中，5對引物均能觀察到特異性條帶，也未出現(xiàn)非特異性條帶擴增，在不含相關(guān)基因的樣品中未見特異性條帶和非特異性條帶擴增；水空白對照未見條帶擴增，說明檢測體系正常。由此可知，本試驗選擇的引物對可用于多重PCR檢測體系研究。

2.3 多重PCR優(yōu)化

從圖2可以看出，水空白對照未見條帶擴增，說明檢測體系正常。在50，54℃條件下，雖然所有目的條帶都得到擴增，但是在其他位置出現(xiàn)有非特異性條帶擴增，因此，退火溫度50，54℃不適宜；在64℃條件下，CP4-EPSPS和T-E9 3′這2個基因的目的條帶都沒有得到有效擴增，因此，退火溫度64℃也不適宜；在56，58，60℃退火溫度條件下的特異性條帶擴增效率相差不大，考慮到單基因擴增的退火溫度，最終選擇多重PCR反應(yīng)的退火溫度為58℃。

由圖3可知，引物終濃度僅按照方案②配比時，各目的基因間的擴增效率相對較高并且也相對一致，而且也沒有出現(xiàn)非特異性條帶擴增；引物終濃度配比按照方案①，③，④，⑤，⑥配比時，目的基因存在無擴增、擴增量小或擴增效率不一致等情況，結(jié)果均不太理想；水空白對照未見條帶擴增，說明檢測體系正常。所以，優(yōu)化后適宜的引物終濃度（μmol/L）配比最終確定為GOX∶CruA∶P-FMV35S∶CP4-EPSPS∶T-E9 3′為0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1。

2.4 多重PCR靈敏度分析

從圖4可以看出，在模板濃度不低于200個拷貝時，5對引物特異性條帶均可得到有效擴增；而當(dāng)模板濃度低至100個拷貝時，雖然5對引物都能得到擴增，但除內(nèi)源參照基因（CruA）外，其他4個外源基因的引物對擴增量太小，特異性條帶模糊，不能準(zhǔn)確判斷；在模板濃度低于100個拷貝時，僅內(nèi)源參照基因引物對得到有效擴增，其他4個外源基因引物對幾乎未見擴增；水空白對照未出現(xiàn)條帶擴增，說明檢測體系正常。試驗結(jié)果表明，體系靈敏度可達200個拷貝。

2.5 已知樣品驗證

選擇7種已知轉(zhuǎn)基因油菜樣品對優(yōu)化后的多重PCR反應(yīng)體系進行驗證，結(jié)果如圖5所示，所有樣品分子特征顯示的外源基因與擴增目的條帶是對應(yīng)的，水空白對照未見條帶擴增，說明檢測體系正常。此結(jié)果再次驗證了試驗所優(yōu)化的多重PCR檢測體系的可靠性。

3 討論

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，抗病、抗蟲、抗除草劑等可利用的基因也被不斷發(fā)現(xiàn)，將這些有用的基因?qū)雱又参镞z傳物質(zhì)中獲得抗病、抗蟲、抗除草劑的生物，這就使得轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的外源基因成分日趨復(fù)雜，多種外源基因種類共同存在于某一生物體內(nèi)，單一PCR檢測多個基因就存在耗時、繁瑣等弊端。因此，尋求一種快速、經(jīng)濟、準(zhǔn)確的檢測方法，將對轉(zhuǎn)基因相關(guān)產(chǎn)品的檢測產(chǎn)生有益效果，多重PCR的出現(xiàn)就很好地解決了多基因檢測出現(xiàn)的問題。多重PCR方法于1988年首次被CHAMBERLAIN等[15]提出，截至目前被廣泛應(yīng)用于檢測中的各個領(lǐng)域，包括定性定量分析、病原微生物檢測及動物源性檢測等。多重PCR技術(shù)只需一個反應(yīng)即可同時對多個目的基因片段進行檢測，可大大節(jié)約人力、物力和財力，可有效減少試驗產(chǎn)生廢液對環(huán)境的污染[16-18]。李會等[19]對多重PCR法快速檢測轉(zhuǎn)基因玉米多種轉(zhuǎn)化體技術(shù)優(yōu)勢進行了比較分析研究，結(jié)果表明，與單一PCR檢測技術(shù)相比，檢測耗時縮短了63%，成本降低了75%，檢測產(chǎn)生的廢液減少了75%，所以，多重PCR在科研、檢測工作中具有很高的實用價值。

在條件優(yōu)化過程中，需要摸索出多重PCR檢測體系中各因素的最適宜條件，由于影響多重PCR反應(yīng)的因素很多，試驗并沒有對所有條件進行逐一優(yōu)化，如Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等，試驗主要考慮選擇的PCR擴增試劑為試劑公司商業(yè)化配制的多重PCR MIX，其中，Taq DNA聚合酶、dNTP和Mg2+等的比例都是固定的，再加上試驗結(jié)果也非常好，所以無需再進行相關(guān)條件的優(yōu)化。本研究僅對引物濃度配比以及引物退火溫度進行了相關(guān)優(yōu)化試驗，在引物濃度配比試驗過程中，考慮到多對引物較易造成引物錯配、產(chǎn)生引物二聚體、出現(xiàn)非特異性條帶等現(xiàn)象，并根據(jù)基因擴增片段大小及基因拷貝數(shù)采用不同引物濃度梯度進行優(yōu)化，在優(yōu)化結(jié)果中根據(jù)各引物對擴增效率相對一致、引物二聚體少、無非特異條帶選擇引物終濃度配比，最終選擇較適宜的引物終濃度配比GOX∶CruA∶P-FMV 35S∶CP4-EPSPS∶T-E9 3′為0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1。試驗對多重PCR反應(yīng)體系中另一個重要條件退火溫度進行摸索，根據(jù)單個引物對之間的退火溫度，適當(dāng)降低退火溫度設(shè)置溫度梯度。根據(jù)各引物對特異性條帶亮度一致、無非特異性條帶和引物二聚體少，最終選擇較適宜的多重PCR體系退火溫度為58℃。

4 結(jié)論

本試驗建立的抗除草劑油菜RT73多重PCR檢測體系，實現(xiàn)了同步快速檢測抗除草劑油菜RT73共4個外源基因成分和內(nèi)源參照基因，此方法在很大程度上提高了相關(guān)產(chǎn)品篩選檢測效率，同時在很大程度上避免了普通PCR反應(yīng)易出現(xiàn)的漏檢現(xiàn)象，為轉(zhuǎn)基因油菜RT73提供了另外一種簡化操作、縮短時間、節(jié)約成本、減少污染的檢測方法。

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Multiplex PCR for Detection of Herbicide-resistant Rapeseed RT73

YINQuan1，LI Yi2，SONGJun1，WANGDong1，JINGYuan3
（1.Analysis and TestingCenter，Sichuan AcademyofAgricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2.Sichuan University for Nationalities，Kangding626001，China；3.Agricultural Product QualitySafetyCenter ofGanzi City in Sichuan Kangding，Kangding626001，China）

To establish a kind of multiplex PCR detection method,according to the molecular characteristics of herbicide-resistant rapeseed RT73,the rapeseed endogenous reference gene CruA,exogenous gene P-FMV 35S,T-E9 3′,CP4-EPSPS and GOX were selected as detection genes for multiplex PCR.The primer concentration ratio and the annealing temperature of the primers were optimized in the multiple PCR system.The experimental results showed that the optimum final concentration of primers（μmol/L）ratio was 0.1∶0.1∶0.1∶0.1∶0.1 for GOX∶CruA∶P-FMV 35S∶CP4-EPSPS∶T-E9 3′,the optimumannealingtemperature ofmultiple PCR was 58℃,the sensitivity of the method was 200 copies.Using the method of multiple PCR to detect the known samples,the result indicated that this systemcould be applied tothe detection ofherbicide-resistant rapeseed RT73.

rapeseed;RT73;multiplexPCR;detection

S565.4

A

1002-2481（2017）04-0552-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.15

2016-11-24

四川省財政現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新與示范專項資金項目（2014CXSF-040）；四川省教育廳自然科學(xué)一般項目（15ZB0331）

尹全（1981-），男，四川金堂人，助理研究員，碩士，主要從事轉(zhuǎn)基因植物安全評價工作。李憶為通信作者。