楊雪芳，張洋洋，張瓊姝，王斌，郭海利，張小民

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

不同月份中國(guó)沙棘葉蘆丁含量比較

楊雪芳1，張洋洋1，張瓊姝1，王斌1，郭海利2，張小民1

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西金科海生物科技有限公司，山西太原030006）

試驗(yàn)利用高效液相色譜法測(cè)定不同月份中國(guó)沙棘葉中蘆丁含量，所用色譜柱為Diamonsil C18柱（150 mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸（33∶67），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，柱溫是30℃。結(jié)果表明，中國(guó)沙棘（♂）葉中蘆丁含量在4—10月依次為0.317 2，0.492 2，0.424 1，0.896 9，0.980 6，0.386 9，1.461 6 mg/g；中國(guó)沙棘（♀）葉中蘆丁含量在4—10月依次為0.441 5，0.531 9，0.730 0，0.933 9，1.361 1，0.877 9 mg/g。由于蘆丁藥用價(jià)值較高，故可為沙棘葉的進(jìn)一步有效開(kāi)發(fā)和利用提供依據(jù)。

高效液相色譜法；沙棘葉；蘆??；含量測(cè)定

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）又名醋柳、酸刺，是胡頹子科沙棘屬植物，我國(guó)主要分布于山西、西藏、青海、內(nèi)蒙古、陜西等地，具有非常重要的生態(tài)價(jià)值、經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值[1]。山西省是沙棘資源大省之一，現(xiàn)有面積29萬(wàn)hm2，占全國(guó)沙棘面積的21%，而天然分布的沙棘林類群只有中國(guó)沙棘亞種[2-3]。

沙棘具有特殊的生理生態(tài)和形態(tài)解剖學(xué)特性，也具有較高的水分利用效率，因此在半干旱的黃土區(qū)荒山種植，它能有效地利用水、土資源[3]。沙棘含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和大量生物活性物質(zhì)，如維生素類、黃酮類、甾醇類、多糖類和有機(jī)酸類等[4-5]。沙棘是果葉兩用植物，目前對(duì)沙棘葉的研究主要是沙棘黃酮含量的測(cè)定，王岳[6]測(cè)定了沙棘中異鼠李素的含量；劉娟等[7]利用HPLC法測(cè)定了沙棘不同部位槲皮素和異鼠李素的含量；杜蕾蕾等[8]對(duì)不同沙棘葉中槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量進(jìn)行了比較。目前對(duì)黃酮中蘆丁含量的測(cè)定鮮有報(bào)道。

蘆丁（Rutin）是一種具有代表性的黃酮類化合物，它廣泛分布于自然界植物中，有降低毛細(xì)血管通透性和脆性的作用，保持及恢復(fù)毛細(xì)血管的正常彈性，具有消炎、抗氧化、延緩衰老、抗癌等多重生理功效[9-11]。其用于防治高血壓腦溢血、糖尿病視網(wǎng)膜出血和出血性紫癜等，也用作食品抗氧劑和色素。

本試驗(yàn)用高效液相色譜法測(cè)定不同月份中國(guó)沙棘葉中蘆丁的含量，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用沙棘以及對(duì)其質(zhì)量評(píng)價(jià)提供了理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

材料：供試材料為2016年4—10月中旬在山西省祁縣來(lái)遠(yuǎn)鎮(zhèn)唐河底村灘地采集的中國(guó)沙棘葉片，經(jīng)干燥后備用。

儀器：島津SPD-15C高效液相色譜儀；N-3000色譜工作站（浙江大學(xué)）；BG-01超聲波清洗機(jī)（廣州邦潔超聲波設(shè)備有限公司）；FA1604N電子分析天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；Heal Force SMART-N超純水機(jī)（上?？道追治鰞x器有限公司）。

試劑：蘆丁對(duì)照品（購(gòu)買(mǎi)自國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)）；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件色譜柱DiamonsilC18柱（150mm× 4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.5%磷酸（33∶67），流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，柱溫是30℃。進(jìn)樣量20 μL，進(jìn)樣前經(jīng)0.22 μm的針頭過(guò)濾器過(guò)濾。

1.2.2 溶液的配制

1.2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品31.25 mg，置于25 mL容量瓶中，加入甲醇至刻度線，待標(biāo)準(zhǔn)品溶解后，搖勻，即得標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.2.2 供試樣品的配制稱取沙棘葉干葉粉末5g，置50 mL帶塞錐形瓶?jī)?nèi)，精密加入甲醇50 mL，稱質(zhì)量，超聲波輔助提取40 min（功率80 W，頻率40 kHz），待其冷卻至室溫，再稱其質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過(guò)濾，再經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾，取濾液，即得供試樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁對(duì)照品的HPLC分析

在1.2.1色譜條件下得到蘆丁對(duì)照品的HPLC圖，如圖1所示。

2.2 線性關(guān)系的考察

分別精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液1，5，10，15，20 μL。在1.2.1色譜條件下，分別注入液相色譜儀測(cè)定。以蘆丁的進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得回歸方程：Y＝1.0×106X，r＝0.996 2（n＝5）。結(jié)果表明，對(duì)照品進(jìn)樣量在0.25～5 μg，蘆丁進(jìn)樣量與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)

分別精密吸取1.25 μg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液各20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，結(jié)果蘆丁峰面積的RSD為1.37%（n＝5），精密度較好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取中國(guó)沙棘（♀）9月的供試樣品，分別于0，2，4，6，8，12 h進(jìn)樣，在1.2.1色譜條件下測(cè)定，蘆丁峰面積的RSD為1.12%（n＝6），表明中國(guó)沙棘葉供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取中國(guó)沙棘（♀）9月的供試樣品5份，每份約5 g，精密稱定，按1.2.2.2中方法制備樣品溶液，在1.2.1色譜條件下分別進(jìn)樣測(cè)定，RSD分別為1.28%。表明重現(xiàn)性良好。

2.6 加樣回收試驗(yàn)

精密稱定已知含量的供試品5份，每份約5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入1 mL質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL的蘆丁對(duì)照品溶液，按照1.2.2.2供試品溶液的制備方案制備成5份供試品溶液，在1.2.1色譜條件下進(jìn)行測(cè)定（表1）。

表1 沙棘葉蘆丁回收率測(cè)定結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)中測(cè)定的中國(guó)沙棘葉蘆丁含量的加樣回收率符合要求。

2.7 樣品含量測(cè)定

取不同月份的中國(guó)沙棘葉在1.2.2.2的方法下制備好的供試樣品，在1.2.1色譜條件下，分別進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積，計(jì)算樣品中蘆丁的含量。

表2 不同月份沙棘葉蘆丁含量

從表2可以看出，中國(guó)沙棘葉中蘆丁含量為0.317 2～1.461 6 mg/g，含量差異較大。中國(guó)沙棘（♀）中的蘆丁含量在4—8月呈逐月增長(zhǎng)的趨勢(shì)，8月份達(dá)到最大值，9月份驟降，10月份又升高。中國(guó)沙棘（♂）中的蘆丁含量在4—5月逐漸升高，6月份有所降低，但不明顯，在7—8月蘆丁含量逐漸升高，9月份降低，10月份又升高。在4—10月中，中國(guó)沙棘葉8月份的蘆丁含量都比較高。

從圖2，3可以看出，中國(guó)沙棘（♀）8月的蘆丁含量高于中國(guó)沙棘（♂）8月的蘆丁含量。

3 討論與結(jié)論

試驗(yàn)建立了液相色譜法測(cè)定沙棘葉中蘆丁含量的方法。用50%甲醇在超聲波輔助提取下提取沙棘葉，濾液經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后，利用反向液相色譜法測(cè)定沙棘葉中蘆丁的含量。結(jié)果表明，沙棘葉中蘆丁進(jìn)樣量在0.25～5 μg，蘆丁進(jìn)樣量與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率為97.56%。該方法快速簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于測(cè)量沙棘葉中蘆丁含量。

通過(guò)測(cè)量4—10月中國(guó)沙棘葉中蘆丁的含量，可以發(fā)現(xiàn)，中國(guó)沙棘葉在8月份蘆丁含量相對(duì)較高。在4—9月，中國(guó)沙棘（♀）每月的蘆丁含量均比相對(duì)應(yīng)的中國(guó)沙棘（♂）含量高，只有在10月份，中國(guó)沙棘（♂）中蘆丁的含量高于中國(guó)沙棘（♀）中蘆丁的含量。李教社等[12]以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，采用分光光度法對(duì)不同時(shí)間的沙棘葉中蘆丁含量進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)中國(guó)沙棘葉中蘆丁含量在6—8月較高，5，9月份含量較低，而且中國(guó)沙棘（♀）所含蘆丁含量普遍比中國(guó)沙棘（♂）所含蘆丁含量要高。這與本研究結(jié)果基本一致。侯霄等[13]的研究結(jié)果顯示，沙棘雌株葉總黃酮含量高于雄株葉，這一點(diǎn)與本研究結(jié)果相一致，但其得出，5—7月的沙棘葉總黃酮含量相對(duì)較高，6月份的總黃酮含量最高，這與本研究結(jié)果不一致，可能是由于測(cè)定黃酮含量的方法、沙棘品種和采摘沙棘的地理位置等因素不一致所導(dǎo)致的。

本研究結(jié)果表明，要想充分、有效利用中國(guó)沙棘葉資源，最好選擇在8月份采摘中國(guó)沙棘（♀）的葉子。中國(guó)沙棘葉中含有一定量的蘆丁，且具有產(chǎn)量豐富、易于采集的優(yōu)勢(shì)，因此，可以作為提取沙棘蘆丁的原料。

［1］林赫杰，陳鈺.沙棘研究現(xiàn)狀、開(kāi)發(fā)利用及發(fā)展前景[J].天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，16（2）：128-130.

［2］郭改芝.山西省沙棘資源現(xiàn)狀及開(kāi)發(fā)利用前景[J].山西林業(yè)科技，2010，39（2）：51-53.

［3］孟晶巖，王賢萍，巫東堂，等.山西省沙棘資源利用現(xiàn)狀及發(fā)展對(duì)策[J].山西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004，32（4）：64-67.

［3］李代瓊，梁一民，侯喜祿，等.沙棘改善環(huán)境的生態(tài)功能及效益試驗(yàn)研究[J].國(guó)際沙棘研究與開(kāi)發(fā)，2004，2（2）：6-11.

［4］包圖雅，烏仁圖雅，寶音倉(cāng)，等.沙棘的化學(xué)成分研究概況[J].中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2014，20（8）：72-73.

［5］中華人民共和國(guó)國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：171-172.

［6］王岳.高效液相色譜法測(cè)定沙棘異鼠李素含量的研究[J].沙棘，2005，18（1）：38-39.

［7］劉娟，楊艷麗.HPLC法測(cè)定沙棘不同部位槲皮素和異鼠李素的含量[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12（6）：16-17.

［8］杜蕾蕾，陳雛.不同沙棘葉中槲皮素、山柰酚和異鼠李素的含量比較[J].成都醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2015，10（1）：28-34.

［9］AGUSTIN SALAZAR S，MEDINA JUDREZ L A，SOTO VALDEZ H，et al.Influence of the solvent system on the composition of phenolic substances and antioxidant capacity of extracts of grape（Vitis vinifera L.）marc[J].Australian Journal of Grape&Wine Research， 2014，20（2）：208-213.

［10］ARAUJOME MBD，F(xiàn)RANCOYE M，ALBERTOTG，et al.Enzymatic deglycosylation of rutin improves its antioxidant and antiproliferative activities[J].FoodChemistry，2013，141（1）：266-273.

［11］ROHNS，BUCHNER N，DRIEMELG，et al.Thermal degra-dation ofonion quercetin glucosides under roastingcondi-tions[J].Journal ofAgricultural&Food Chemistry，2007，55（4）：1568-1573.

［12］李教社，鞏寶星，楊云，等.不同時(shí)期中國(guó)沙棘雌雄株葉中總黃酮含量的測(cè)定[J].沙棘，2000，13（1）：39-40.

［13］侯霄，萬(wàn)強(qiáng)，付永峰，等.山西各類沙棘葉總黃酮的含量測(cè)定[J].國(guó)際沙棘研究與開(kāi)發(fā)，2014，12（1）：6-9.

Comparison of Rutin Content of Chinese Seabuckthorn in Different Months

YANGXuefang1，ZHANGYangyang1，ZHANGQiongshu1，WANGBin1，GUOHaili2，ZHANGXiaomin1
（1.College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Shanxi Jinkehai Biological TechnologyCo.，Ltd.，Taiyuan 030006，China）

The content of rutin in Chinese seabuckthorn leaves of different month was determined by high performance liquid chromatography（HPLC）.Thechromatographiccolumn wasDiamonsilC18column（150 mm×4.6 mm,5 μm）.The mobile phase consisted ofmethanol-0.5%phosphoric acid（33∶67）,and the flowrate was 1.0 mL/min,the detection wavelength was 254 nm and the column temperature was 30℃.The results showed that the content ofrutin in the leaves ofChinese seabuckthorn（♂）was in the order of（mg/g）from April to October:0.317 2,0.492 2,0.424 1,0.896 9,0.980 6,0.386 9,1.461 6,respectively.The rutin content in the leaves of Chineseseabuckthorn（♀）wasintheorderof（mg/g）fromApriltoOctober:0.4415,0.5319,0.7300,0.9339,1.3611,0.8779,respectively. As the medicinal value ofrutin is higher,it can provide the basis for the further development and utilization ofsea buckthorn leaves.

HPLC;Hippophae rhamnoides leaves;rutin;content determination

S793.6

A

1002-2481（2017）04-0544-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.13

2016-11-15

楊雪芳（1992-），女，山西大同人，在讀碩士，研究方向：植物化學(xué)與藥理。張小民為通信作者。