葛璞玉，崔貴梅，王耀輝，王景雪，杜春芳，孫毅

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

甘藍(lán)型油菜雄性不育系312A形態(tài)學(xué)及細(xì)胞學(xué)研究

葛璞玉1，崔貴梅2，王耀輝1，王景雪1，杜春芳3，孫毅2

（1.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心，山西太原030031；3.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000）

研究甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）雄性不育系312A及其保持系312B的花器官形態(tài)差異和312A的花藥敗育特點(diǎn)等，為312A的進(jìn)一步利用提供理論根據(jù)。結(jié)果表明，312A與312B的花器官性狀存在著極顯著差異，其中，312A花藥在發(fā)育過(guò)程中體積較小、干癟，成熟后花絲較短，不能釋放有活力的正?；ǚ?；312B花藥體積較大、相對(duì)比較飽滿，最終可以釋放大量鮮黃色的成熟花粉?；ɡ偈炃衅^察發(fā)現(xiàn)，312A的花藥敗育發(fā)生在3個(gè)時(shí)期，即小孢子孢原細(xì)胞期、造孢細(xì)胞分化期和二核花粉期，其中，前2個(gè)時(shí)期敗育屬于無(wú)花粉囊型敗育；二核花粉期敗育則是花藥發(fā)育至二核花粉粒時(shí)期，已接近成熟，但2個(gè)細(xì)胞核的核膜消失，核開(kāi)始解體直至消失，形成無(wú)效的敗育花粉粒。這是迄今為止首次在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)二核期敗育類型。

甘藍(lán)型油菜；細(xì)胞質(zhì)雄性不育系；細(xì)胞學(xué)；花粉敗育

油菜是我國(guó)重要的油料作物，油菜的雜種優(yōu)勢(shì)利用是高產(chǎn)育種的重要途徑[1]。因此，油菜雄性不育系的發(fā)現(xiàn)和研究也頗受育種家重視。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的甘藍(lán)型油菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育（CMS）類型主要有：Ogura CMS，Nap CMS，Polima CMS，Shan2ACMS，Hau CMS，NCa CMS，Nsa CMS，NEACMS等[2]。其中，Polima CMS不育性穩(wěn)定，成功地在甘藍(lán)型油菜中找到了恢復(fù)系，是第1個(gè)實(shí)現(xiàn)三系配套的不育系類型[3]。因此，其在油菜雜種優(yōu)勢(shì)利用中起著重要的作用。目前，我國(guó)甘藍(lán)型油菜生產(chǎn)上使用的油菜雜交種約70%為細(xì)胞質(zhì)雄性不育雜種[4]，且主要來(lái)自Polima CMS和Shan2ACMS[5]。關(guān)于油菜的雄性不育系花粉發(fā)育的細(xì)胞學(xué)特征，前人已有一些研究[6-15]，結(jié)果表明，不育系花藥敗育可能發(fā)生在花粉發(fā)育的每一個(gè)階段，敗育的高峰期是小孢子四分體至單核花粉期；不育系的來(lái)源和類型不同，其花藥敗育發(fā)生的時(shí)期有所不同；不同材料花藥敗育的細(xì)胞學(xué)差異受基因型控制。余鳳群等[6]按照花藥敗育發(fā)生的時(shí)期和方式的不同，將甘藍(lán)型油菜雄性不育類型分為3類：即無(wú)花粉囊型、花粉母細(xì)胞敗育型和單核敗育型。對(duì)Polima CMS不育系的細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果證明，Polima CMS的雄性敗育發(fā)生在孢原細(xì)胞時(shí)期，屬于無(wú)花粉囊敗育型雄性不育系[6，9-10]。

312A的選育是以外引不育系26A（Polima CMS來(lái)源）為母本，與山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所油菜育種課題組自選的優(yōu)良品系20001519測(cè)交并連續(xù)回交5代，定向選育而成。312A不育株率達(dá)100%，不育度在95%以上。低溫早期有輕微死蕾，盛花后花瓣開(kāi)放正常，具有不育性穩(wěn)定、溫度影響較小、配合力高等特點(diǎn)，是山西省甘藍(lán)型油菜雜交種晉油10號(hào)、晉油11號(hào)的主要親本材料。

本研究對(duì)312A雄性不育系進(jìn)行小孢子發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)和細(xì)胞學(xué)觀察，研究其敗育發(fā)生的時(shí)期和類型，旨在為進(jìn)一步開(kāi)展優(yōu)良雜交種的選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為甘藍(lán)型油菜不育系312A和保持系312B。供試材料播種于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所試驗(yàn)田內(nèi)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花冠形態(tài)學(xué)觀察方法在油菜盛花期，采集312A和312B新鮮開(kāi)放的花各30朵，觀察拍照對(duì)比，用游標(biāo)卡尺測(cè)量花冠徑、花瓣長(zhǎng)、花瓣寬、花柄長(zhǎng)、花絲長(zhǎng)、雌蕊長(zhǎng)、四強(qiáng)雄蕊長(zhǎng)、二弱雄蕊長(zhǎng)、四強(qiáng)花藥長(zhǎng)、二弱花藥長(zhǎng)，并記錄數(shù)據(jù)。采用SPSS 18.0軟件分析差異顯著性。

1.2.2 花粉發(fā)育過(guò)程細(xì)胞學(xué)試驗(yàn)方法2015年4月初，參考龍歡等[10]的方法，在油菜開(kāi)花期，分別從不育系312A和保持系312B植株上摘取花蕾長(zhǎng)度＜0.5，≥0.5＜1，≥1＜2，≥2＜3，≥3＜4，≥4＜5，≥5＜6，≥6＜7，≥7 cm等一系列不同大小的花蕾，迅速投入卡諾氏固定液中（V（無(wú)水酒精）∶V（冰醋酸）＝3∶1）固定24 h，然后轉(zhuǎn)到70%乙醇中保存?zhèn)溆??；ǚ郯l(fā)育的細(xì)胞學(xué)觀察采用常規(guī)石蠟切片，埃氏蘇木精整體染色法，Olympus BH2顯微鏡觀察，冷CCD攝影，并統(tǒng)計(jì)敗育率。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜312A花器官性狀特點(diǎn)

由表1可知，從苗期至現(xiàn)蕾期，312A和312B的花器官?zèng)]有明顯的形態(tài)差異，抽薹至開(kāi)花期，312A和312B的花朵在外觀形態(tài)方面開(kāi)始呈現(xiàn)明顯的差異，所檢測(cè)的全部花器官性狀中，312A與312B均有極顯著的差異。與312B相比，312A花瓣的長(zhǎng)度明顯變小，寬度明顯變窄；雄蕊明顯退化，無(wú)論是四強(qiáng)雄蕊還是二弱雄蕊，312A的雄蕊長(zhǎng)度都明顯小于312B。312A的花冠正面看不到雄蕊，從雄蕊外形來(lái)看，花絲長(zhǎng)度明顯變短，無(wú)論是四強(qiáng)花藥還是二弱花藥，312A的花藥長(zhǎng)度都明顯小于312B，而且花藥干癟，呈三角型。由于花絲過(guò)短致使花藥的高度不及柱頭的高度；花藥顏色淡黃發(fā)白，不能產(chǎn)生正常花粉粒。與312B大且飽滿的鮮黃色花藥，形成了明顯的對(duì)比。這與田保明等[16]對(duì)細(xì)胞質(zhì)雄性不育系384A的花器官性狀研究結(jié)果一致。

表1 開(kāi)花期312A和312B的花器性狀比較

2.2 油菜312B花藥發(fā)育過(guò)程

2015年春在油菜初花期，對(duì)雄性不育系312A的保持系312B不同大小的花蕾進(jìn)行了取樣固定和制作石蠟切片，觀察了312B正?；ǚ郯l(fā)育過(guò)程中細(xì)胞學(xué)變化，結(jié)果確定了甘藍(lán)型油菜保持系312B花藥發(fā)育過(guò)程為：在花蕾長(zhǎng)度小于0.5 cm時(shí)，花藥開(kāi)始分化，最初花藥橫切面呈腎形，并且所有的細(xì)胞染色均勻，在花藥表皮下分化出的孢原細(xì)胞清晰可見(jiàn)，即孢原細(xì)胞時(shí)期（圖1-A）；隨后，孢原細(xì)胞平周分裂形成初生壁細(xì)胞和初生造孢細(xì)胞，初生造孢細(xì)胞經(jīng)過(guò)有絲分裂產(chǎn)生次生造孢細(xì)胞，即造孢細(xì)胞時(shí)期（圖1-B），此時(shí)花藥的形狀逐漸變成規(guī)則的蝶形，在蝶形花藥4個(gè)角隅各出現(xiàn)一片染色較深的區(qū)域，可以明顯地分為3層，即表皮層、中層和藥室內(nèi)壁，都是由初生壁細(xì)胞分裂后進(jìn)一步發(fā)育形成的。藥室內(nèi)壁中的細(xì)胞也同樣被染色，且很均勻，次生造孢細(xì)胞經(jīng)多次分裂形成一定數(shù)量的花粉母細(xì)胞。初期花粉囊空間較小，花粉母細(xì)胞緊密連接在一起沒(méi)有明顯間隔，后期隨著花粉囊的空間增大，花粉母細(xì)胞間的胞間層充滿胼胝質(zhì)，光鏡下呈透明物質(zhì)，似花粉母細(xì)胞之間的間隙。

隨著花粉囊進(jìn)一步擴(kuò)大，花粉母細(xì)胞向藥室中央集中，此時(shí)在幼花蕾的橫切面上，可見(jiàn)1個(gè)雌蕊和6個(gè)雄蕊，花藥的橫切面呈現(xiàn)理想規(guī)則的蝶形（圖1-C）；大孢子母細(xì)胞經(jīng)過(guò)短暫的減數(shù)分裂期（圖1-D），形成四分體（圖1-E）；隨著胼胝質(zhì)的消失，四分體相互分離，早期的小孢子花粉依然緊密連接在一起，細(xì)胞壁很薄，細(xì)胞核居于中央（圖1-F），此時(shí)緊貼內(nèi)壁規(guī)則排列的絨氈層細(xì)胞開(kāi)始退化解體，為小孢子花粉的繼續(xù)發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)，促使單核中期花粉體積增大，細(xì)胞質(zhì)中逐漸有大液泡出現(xiàn)；隨即細(xì)胞核被迫移向細(xì)胞一側(cè)，進(jìn)入單核靠邊期（圖1-G），此時(shí)細(xì)胞內(nèi)染色不均一；單核花粉粒因?yàn)橐淮纬Ｒ?guī)的有絲分裂產(chǎn)生2個(gè)核，接著發(fā)生一次不均等的細(xì)胞質(zhì)分裂，進(jìn)入二核花粉粒時(shí)期（圖1-H），絨氈層細(xì)胞進(jìn)一步退化；隨著花粉的進(jìn)一步分化，生殖細(xì)胞再分裂，形成2個(gè)梭型的精核細(xì)胞，進(jìn)入三核花粉粒時(shí)期，此時(shí)，絨氈層完全退化消失，相鄰花粉囊之間的組織解體破裂，為成熟花粉的散出做準(zhǔn)備。這與前人對(duì)油菜花粉發(fā)育的觀察結(jié)果一致[12，15]。

2.3 油菜312A雄性敗育細(xì)胞學(xué)特征

通過(guò)對(duì)312A和312B花粉發(fā)育過(guò)程的對(duì)比觀察發(fā)現(xiàn)，312A不育系花粉敗育類型有以下4種。

第1種，312A花藥發(fā)育的初始階段，花藥周邊有4團(tuán)具有分裂能力的分生細(xì)胞快速分裂，使得花藥變成類似蝶形，在花藥橫切面上出現(xiàn)具有4個(gè)棱角的花藥雛體，類似蝶形花藥的中央部分出現(xiàn)藥室間隔，間隔由維管束和薄壁細(xì)胞共同組成，此時(shí)可以看到雌蕊位于中央，但沒(méi)有子房腔的分化，染色均勻，四強(qiáng)雄蕊位于雌蕊周圍?；ㄋ幹袥](méi)有孢原細(xì)胞的分化，也沒(méi)有造孢細(xì)胞和花粉母細(xì)胞的進(jìn)一步分化形成，整個(gè)花藥的狀態(tài)始終都是薄壁細(xì)胞。這一部分花藥發(fā)育受阻于孢原細(xì)胞時(shí)期，屬于無(wú)花粉囊型敗育（圖2-A）。

第2種，有一部分花藥雖然能發(fā)育造孢細(xì)胞，但發(fā)育過(guò)程與312B花藥發(fā)育明顯不同。藥室內(nèi)壁中的細(xì)胞開(kāi)始由原來(lái)的孢原細(xì)胞平周分裂形成初生壁細(xì)胞和初生造孢細(xì)胞，初生壁細(xì)胞經(jīng)過(guò)平周分裂和重周分裂，產(chǎn)生呈同心排列的數(shù)層細(xì)胞，但花藥出現(xiàn)畸形，沒(méi)有發(fā)育成理想的蝶形，花藥被嚴(yán)重拉伸，導(dǎo)致形態(tài)不對(duì)稱，同時(shí)其中的維管組織也出現(xiàn)異常。此后，一部分花藥的發(fā)育停留在造孢細(xì)胞時(shí)期，導(dǎo)致沒(méi)有花粉囊的出現(xiàn)，這種敗育類型屬于無(wú)花粉囊型敗育（圖2-B）。

第3種，一部分花藥會(huì)繼續(xù)發(fā)育產(chǎn)生表皮層、中層和藥室內(nèi)壁，這3層細(xì)胞和緊貼內(nèi)壁規(guī)則排列的絨氈層細(xì)胞一起構(gòu)成花粉囊壁。同時(shí)，花粉母細(xì)胞也開(kāi)始分化形成。但從花蕾的橫切面來(lái)看，6個(gè)雄蕊的發(fā)育進(jìn)程明顯不同步，四強(qiáng)雄蕊靠近子房發(fā)育相對(duì)較快，體積相對(duì)較大，但花藥依然沒(méi)有發(fā)育成為規(guī)則的蝶形，已經(jīng)發(fā)育好的藥室也出現(xiàn)畸形，并且藥室的發(fā)育不像正常會(huì)出現(xiàn)4個(gè)花粉囊，它最多出現(xiàn)一個(gè)花粉囊（圖2-C），其余的應(yīng)當(dāng)出現(xiàn)花粉囊的細(xì)胞仍然保持薄壁狀態(tài)。發(fā)育出的花粉囊里會(huì)出現(xiàn)少量的花粉母細(xì)胞，形成類似Polima CMS的微粉現(xiàn)象，但是這些花粉母細(xì)胞雖然會(huì)繼續(xù)發(fā)育，但在后期其內(nèi)部會(huì)出現(xiàn)異常（圖2-D）而導(dǎo)致敗育，并不能形成有活力的花粉粒。

第4種，有一部分花藥內(nèi)會(huì)發(fā)育出現(xiàn)單核花粉粒，花粉整體形態(tài)也能發(fā)育為規(guī)則的球形，單核中期時(shí)的花粉細(xì)胞核大，染色較深，位于中央。有的花粉也能經(jīng)過(guò)有絲分裂和一次不均等的細(xì)胞質(zhì)分裂，導(dǎo)致發(fā)育進(jìn)入二核花粉粒時(shí)期（圖2-E）。但隨著花粉粒的進(jìn)一步發(fā)育，2個(gè)細(xì)胞核的核膜消失，核開(kāi)始解體直至消失（圖2-F），形成無(wú)效的花粉粒。

3 討論

本研究所用的材料312A，其測(cè)交轉(zhuǎn)育的母本是26A，屬于Polima CMS雄性不育系。312A的花藥敗育時(shí)期及特點(diǎn)與前人對(duì)Polima CMS研究所得結(jié)論不盡相同。本研究結(jié)果表明，312A的花藥敗育絕大多數(shù)出現(xiàn)在孢原細(xì)胞分化時(shí)期，屬于無(wú)花粉囊型敗育，與前人的研究結(jié)果一致[6，9-10，17]。所不同的是：312A油菜中出現(xiàn)了微粉現(xiàn)象，但是這些微粉在小孢子發(fā)育后期會(huì)敗育。因此，這種現(xiàn)象與Polima CMS雄性不育系在低溫下發(fā)生的微粉現(xiàn)象還不完全相同[9-10]。少部分油菜花粉敗育出現(xiàn)在二核期。盡管LASER等[11]通過(guò)對(duì)CMS的研究，認(rèn)為雄性不育可以發(fā)生在花藥發(fā)育的每一個(gè)時(shí)期，但花藥敗育的高峰期集中在四分體和單核靠邊期之間。二核期敗育這種現(xiàn)象卻是迄今為止首次在甘藍(lán)型油菜中發(fā)現(xiàn)。在甘藍(lán)型油菜的近緣種中，施展等[18]曾在大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系6w-9605A中觀察到了單核靠邊期或者二核期敗育這種不育現(xiàn)象。

本研究觀察發(fā)現(xiàn)，312A在轉(zhuǎn)育的過(guò)程中，雄性敗育的時(shí)期和類型發(fā)生了變化，增加了新的敗育類型。相似的情況前人也曾有報(bào)道，青海省農(nóng)林科學(xué)院春油菜研究所從引進(jìn)的雙低春油菜品種“馬努”與Polima CMS331A測(cè)交，并連續(xù)回交選育出來(lái)的105A，研究發(fā)現(xiàn)，花粉敗育也發(fā)生在2個(gè)時(shí)期，即造孢細(xì)胞時(shí)期和單核晚期[13]。

對(duì)水稻光敏核不育的研究表明，雄性不育與絨氈層的程序化死亡有關(guān)[19]。利用近等基因系對(duì)Polima CMS的轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)分析結(jié)果表明，雄性不育系花粉敗育與花粉發(fā)育過(guò)程中orf224/atp6相互作用引起的一系列能量匱乏有關(guān)[20]。312A的敗育機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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Study on Morphology and Cytology of Male Sterile Line 312A inBrassica napusL.

GE Puyu1，CUI Guimei2，WANGYaohui1，WANGJingxue1，DUChunfang3，SUNYi2
（1.College ofLife Science，Shanxi University，Taiyuan 030006，China；2.Research Center ofBiotechnology，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Taiyuan 030031，China；3.Institute ofCotton，Shanxi AcademyofAgricultural Sciences，Yuncheng044000，China）

This study aims to use cytological means to reveal rapeseed（Brassica napus L.）flower organ morphology and male sterile line 312A anthers abortive characteristics,etc,to provide effective basis for 312A further use.Tested rapeseed varieties are from breeding hybrids out of stable male sterile line 312A and maintainer line 312B.The results show that 312A and 312B during bud development have more obvious differences:312B in the process of the whole anther development,the anther has been relatively full, large size,finally can release a large number ofmature pollen,312A in the process of the whole anther development,the anther has been dry,smaller volume,filaments short after mature,cannot release energetic bright yellowpollen.At the same time,the 312A and 312B of floral organ morphology difference reached significant level.By rapeseed 312A different development stages of bud slice observation,the results show that 312A of anthers abortive is divided into three kinds of situation,a total of two types of abortive.Part of anther development stagnation in spore cell period,lead to no pollen sac,belong to have no the abortive pollen sac type.Part of anther development of stagnation in spore period of cell differentiation,vascular tissue abnormalities,and did not develop into ideal butterfly-like shape,but appear deformity,belong to have no the abortive pollen sac type,some medicine chamber up to one anther, pollen sac will develop in a small amount ofpollen mother cell,the formation oftrace pollen grains ofthe invalid.Another part ofanther is because of a mitotic division of cytoplasm and an unequal,the lead to develop into a period of biuncleate pollen grains.With the further development of the pollen grain,the two nuclei of the nuclear membrane disappear,nuclear began to collapse,until disappear,form the pollen grain is invalid.This is first discoveryoftwonuclear abortion type in Brassia hapus L.

Brassica napus L.;cytoplasmic male sterilityline;cytology;pollen abortion

S565.4

A

1002-2481（2017）04-0510-05

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.04.05

2016-12-08

山西省科技攻關(guān)項(xiàng)目（20140311010-4）

葛璞玉（1991-），女，山西運(yùn)城人，碩士，主要從事油菜不育系細(xì)胞學(xué)研究工作。王景雪為通信作者。