張海燕 李鐵軍 陳 亮 姜 偉

抑癌基因ARHI在三陰性乳腺癌中的表達(dá)及臨床意義

張海燕①李鐵軍②陳 亮③*姜 偉②

目的：探討抑癌基因ARHI在三陰性乳腺癌(TNBC)中的表達(dá)及臨床意義。方法：選擇150例TNBC患者及135例非TNBC患者，用免疫組織化學(xué)SP法檢測癌組織中ARHI的表達(dá)，觀察ARHI在兩種乳腺癌中表達(dá)的差異。結(jié)果：抑癌基因ARHI蛋白在TNBC組織中的表達(dá)率為32.0%，在非TNBC組織中的表達(dá)率為47.4%，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.444，P＜0.05)。抑癌基因ARHI在TNBC中的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期及腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)，其表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.326，x2=9.382，x2=5.259；P＜0.05)；ARHI的表達(dá)與乳腺癌家族史及組織學(xué)分級無顯著相關(guān)性，其表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.172，x2=4.584；P＞0.05)。ARHI在非TNBC中的表達(dá)與臨床分期相關(guān)，其表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.155，P＜0.05)；ARHI在非TNBC的表達(dá)與年齡、腫瘤大小、乳腺癌家族史、腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級無顯著相關(guān)性，其表達(dá)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.002，x2=0.946，x2=0.653，x2=0.031，x2=0.991；P＞0.05)。結(jié)論：抑癌基因ARHI在TNBC中的表達(dá)缺失更為顯著，提示ARHI的表達(dá)可能成為判斷TNBC浸潤進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo)之一。

三陰性乳腺癌；非三陰性乳腺癌；抑癌基因；ARHI；免疫組織化學(xué)

張海燕,女,(1980- ),碩士，副教授、副主任護(hù)師。滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校護(hù)理系，研究方向：護(hù)理教育及臨床護(hù)理。

三陰性乳腺癌 (triple-negative breast cancer，TNBC)屬于乳腺癌中惡性程度最高的類型，即雌激素受體、孕激素受體和人表皮生長因子受體2(human epidermalgrowth factor recepto，Her-2)均不表達(dá)[1]。TNBC對于內(nèi)分泌治療和Her-2的靶向治療無效，化療是目前唯一有效的治療手段。TNBC與非TNBC比較尚無更好的治療手段，因此預(yù)后差，且易轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。近年來，新型的靶向藥物層出不窮，針對乳腺癌的新型靶向藥物的研究成為目前研究的熱點(diǎn)。一種新的腫瘤抑制基因ARHI(aplasia ras homologue member I)/NOEY2參與細(xì)胞周期調(diào)控和信號通路的傳導(dǎo)，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，誘發(fā)自噬及促進(jìn)細(xì)胞休眠和凋亡。有研究發(fā)現(xiàn)，其在乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝細(xì)胞癌及胃癌等多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)或缺失，提示抑癌基因ARHI可能參與了上述腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[2]。本研究將非TNBC作為對照，探討ARHI蛋白在TNBC中的表達(dá)，分析兩者之間表達(dá)的差異，并探討ARHI蛋白與TNBC臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年10月至2016年8月于河北省滄州市中心醫(yī)院住院治療的150例TNBC患者及135例非TNBC患者的細(xì)胞蠟塊。TNBC患者均為女性；年齡29～76歲，平均年齡44.6歲；組織學(xué)分級為Ⅰ級48例，Ⅱ級50例，Ⅲ級52例；臨床腫瘤TNM分期為Ⅰ期40例，Ⅱ期53例，Ⅲ期57例；乳腺癌家族史44例；腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者64例。非TNBC患者均為女性；年齡25～70歲，平均年齡45.2歲；組織學(xué)分級為Ⅰ級35例，Ⅱ級54例，Ⅲ級46例；臨床腫瘤TNM分期為Ⅰ期38例，Ⅱ期60例，Ⅲ期37例；腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者58例；乳腺癌家族史48例。所有患者均接受規(guī)范的治療。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(1)納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢測雌激素受體(estrogen receptor，ER)、孕激素受體(progesterone receptor，PR)及Her-2均為陰性的TNBC女性患者。

(2)排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理檢測ER、PR及Her-2其中任意一項(xiàng)為陽性的非TNBC女性患者。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測

標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)10﹪甲醛固定、常規(guī)脫水、浸蠟、包埋及切片。切片厚度為4 μm。采用免疫組織化學(xué)SP法進(jìn)行檢測，依據(jù)說明書操作。ARHI兔多克隆單克隆抗體試劑盒購自美國SANTA CRUZ公司。

1.4 ARHI的判斷指標(biāo)

采用每一切片中隨機(jī)選取10個(gè)高倍鏡視野、每個(gè)高倍鏡視野計(jì)數(shù)為100個(gè)細(xì)胞的方法判定。染色強(qiáng)度等級：淺黃染為1分，中度黃染為2分，強(qiáng)度黃染為3分；陽性細(xì)胞的百分率：陽性細(xì)胞≤5﹪為0分，5﹪～25﹪為1分，26﹪～50﹪為2分，＞50﹪為3分；將兩者的結(jié)果綜合分析：0分計(jì)為陰性(-)，1～2分計(jì)為弱陽性(+)，3～4分計(jì)為中度陽性(++)，5～6分計(jì)為強(qiáng)陽性(+++)；將CD55蛋白的(-)、(+)組計(jì)為低表達(dá)組，將CD55蛋白的(++)、(+++)組計(jì)為高表達(dá)組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)數(shù)資料應(yīng)用x2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ARHI蛋白在TNBC與非TNBC中的表達(dá)比較

ARHI蛋白在TNBC組織中的表達(dá)率為32.0﹪，在非TNBC組織中的表達(dá)率為47.4﹪，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=4.444，P＜0.05)，見表1。

表1 ARHI蛋白在不同乳腺癌組織類型中的表達(dá)比較

2.2 ARHI蛋白表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系

在TNBC患者的臨床病理特征中，ARHI的表達(dá)與腫瘤大小、臨床分期及腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均顯著相關(guān)，其表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=8.326，x2=9.382，x2=5.259；P＜0.05)；ARHI的表達(dá)與患者的乳腺癌家族史及組織學(xué)分級無顯著相關(guān)性，其表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.172，x2=4.584；P＞0.05)，見表2。

2.3 ARHI蛋白表達(dá)與非TNBC臨床病理特征的關(guān)系

在非TNBC患者的臨床病理特征中，ARHI的表達(dá)與臨床分期相關(guān)性，其表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=6.155；P＜0.05)；ARHI的表達(dá)與年齡、腫瘤大小、乳腺癌家族史、腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及組織學(xué)分級無顯著相關(guān)性，其表達(dá)率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=0.002，x2=0.946，x2=0.653，x2=0.031，x2=0.991；P＞0.05)，見表3。

3 討論

TNBC是乳腺癌的特殊類型，侵襲性強(qiáng)，預(yù)后較差，且缺乏針對性的有效治療策略，內(nèi)分泌治療及針對Her-2基因的分子靶向治療無效。近年來對TNBC的基礎(chǔ)與臨床等方面的研究越來越多，已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點(diǎn)。因此，針對ARHI基因的研究有助于惡性腫瘤的預(yù)防和治療。無論是在TNBC還是在非TNBC中均存在ARHI的表達(dá)缺失，而有關(guān)ARHI在TNBC與非TNBC中表達(dá)的差異以及與臨床病理特征的區(qū)別，未見臨床報(bào)道。

表2 ARHI蛋白表達(dá)與TNBC臨床病理特征的關(guān)系

表3 ARHI蛋白表達(dá)與非TNBC臨床病理特征的關(guān)系

Yu等[1]利用差異顯示PCR，確定了ARHI在正常卵巢和乳腺上皮細(xì)胞持續(xù)表達(dá)，而在卵巢癌和乳腺癌表達(dá)缺失，通過轉(zhuǎn)染重新表達(dá)ARHI后能抑制乳腺癌和卵巢癌細(xì)胞的生長。41﹪的卵巢癌和乳腺癌被發(fā)現(xiàn)存在雜合性喪失的基因。Bao等[2]使用雙腺病毒的系統(tǒng)，在已經(jīng)失去ARHI表達(dá)的卵巢癌和乳腺癌細(xì)胞中重新表達(dá)ARHI，ARHI的再表達(dá)癌細(xì)胞的抑制生長，侵襲力下降，并誘導(dǎo)其凋亡。Hisatomi等[3]通過實(shí)時(shí)PCR分析發(fā)現(xiàn)，所有非癌乳腺組織中均檢測到ARHI/NOEY2，而在26例乳腺癌組織中，其中有2例沒有檢測到，10例乳腺癌組織ARHI/NOEY2 mRNA的顯著減少，12例ARHI/ NOEY2表達(dá)丟失或明顯減少。提示ARHI/NOEY2 mRNA表達(dá)的減少可能在乳腺癌的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。白雪等[4]收集臨床80例乳腺癌患者癌組織、40例癌旁乳腺組織和20例正常乳腺組織，采用免疫組織化學(xué)法和RT-PCR法檢測ARHI基因在乳腺癌組織、癌旁乳腺組織及正常組織中的表達(dá)，顯示與正常組織和癌旁組織相比較，ARHI蛋白和ARHImRNA水平在乳腺癌組織中的表達(dá)均明顯降低，并且兩者隨組織病理分級的升高而降低，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，但在不同組織學(xué)類型中的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Wang等[5]采用免疫組織化學(xué)法和原位雜交ARHI在乳腺導(dǎo)管原位癌，浸潤性乳腺癌和鄰近的正常乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)，得出ARHI mRNA和蛋白在所有的正常乳腺上皮細(xì)胞中檢測到，ARHI的表達(dá)主要是在細(xì)胞質(zhì)和很少存在于細(xì)胞核。通過組織化學(xué)分析，DCIS中ARHI表達(dá)下調(diào)41%，浸潤性癌下調(diào)70%，表明ARHI表達(dá)在DCIS中是顯著下調(diào)，并且ARHI的表達(dá)進(jìn)一步降低與乳腺癌進(jìn)展相關(guān)。本研究顯示，ARHI蛋白在TNBC組織中的陽性表達(dá)率明顯高于非TNBC組織，提示無論TNBC還是非TNBC中均存在著ARHI蛋白的表達(dá)缺失；并且TNBC中ARHI的表達(dá)缺失明顯高于非TNBC，說明ARHI的表達(dá)缺失在參與TNBC的發(fā)生發(fā)展過程中較非TNBC發(fā)揮著更加重要的作用。本組還顯示：無論是在TNBC還是在非TNBC中，ARHI的蛋白表達(dá)均與年齡、腫瘤大小、乳腺癌家族史及組織學(xué)分級無顯著相關(guān)，而與腋下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有相關(guān)性，表明隨著惡性度的增加，ARHI的蛋白表達(dá)逐漸下降，并且在TNBC中，ARHI蛋白表達(dá)缺失又與臨床分期有相關(guān)性，提示ARHI的表達(dá)缺失可能在TNBC的惡性演變過程中較非TNBC扮演著更為重要的角色。此外，在其他惡性腫瘤中同樣見到ARHI的異常表達(dá)。陳若琨等[6]腦組織切片的免疫組織化學(xué)染色顯示，高級別膠質(zhì)瘤ARHI陽性表達(dá)率(35.34%和30.16%)明顯低于正常腦組織(94.07%)及低級別膠質(zhì)瘤(93.08%和82.11%，P＜0.01)，提示ARHI蛋白的陽性率與腦膠質(zhì)瘤的惡性程度成反比。彭麗等[7]采用免疫組織化學(xué)檢測72例甲狀腺癌組織和癌旁組織以及40例正常組織中ARHI蛋白表達(dá)水平，并比較其表達(dá)水平和甲狀腺癌分級、預(yù)后等病理參數(shù)關(guān)系。結(jié)果顯示甲狀腺癌組織中ARHI陽性率為48.6%，顯著低于癌旁組織中的69.4%和正常組織中的95.0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。路新卿等[8]分別應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫印跡法證實(shí)ARHI可明顯的誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡，ARHI表達(dá)下調(diào)可能在胰腺癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要的作用。毛沖沖等[9]采用免疫組織化學(xué)SP法檢測10例正常腦組織、30例低級別膠質(zhì)瘤(Ⅰ級、Ⅱ級)和39例高級別膠質(zhì)瘤(Ⅲ級、Ⅳ級) ARHI的表達(dá)情況，證實(shí) ARHI可能成為判斷星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤惡性程度、侵襲性及預(yù)后的有效指標(biāo)。

張?jiān)倥d等[10]研究得出喉鱗癌組織ARHI蛋白陽性表達(dá)率低于癌旁組織，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達(dá)率高于Ⅲ～Ⅳ期者，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達(dá)率低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，病理分級高中分化喉鱗癌患者ARHI蛋白陽性表達(dá)率高于低分化者。李黎博等[11]通過構(gòu)建pEGFP-ARHI表達(dá)載體，實(shí)驗(yàn)表明在ARHI低表達(dá)的胃癌細(xì)胞系MKN-28中表達(dá)重組質(zhì)粒pEGFPARHI能夠抑制細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力。Chen等[12]試驗(yàn)表明，ARHI在膠質(zhì)瘤組織以及在4種惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系被顯著下調(diào)。Lu等[13]通過免疫組化和原位雜交法檢測57例細(xì)胞石蠟包埋手術(shù)切除腫瘤標(biāo)本和患者相應(yīng)正常胰腺組織中ARHI的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ARHI mRNA在正常對照胰腺組織中的陽性率和蛋白表達(dá)率分別為84.2%和82.5%，而在癌組織中均為52.6%；mRNA在腫瘤組織中的陽性率和蛋白表達(dá)率顯著降低。胡珊珊等[14]研究表明，ARHI在78.3﹪胰腺癌組織中表達(dá)缺失或下調(diào)，ARHI基因抑制胰腺癌細(xì)胞株增殖，抑制胰腺癌裸鼠荷瘤的生長，抑制胰腺癌裸鼠荷瘤中血管生成和相關(guān)蛋白VEGF和CXCL8的表達(dá)。Huang等[15]通過實(shí)時(shí)RT-PCR分析HCC樣本ARHI的基因表達(dá)，與癌旁非癌組織比較，HCC中ARHI的基因表達(dá)下調(diào)78.6%。上述研究均表明ARHI在喉鱗癌、胃癌、膠質(zhì)瘤、胰腺癌以及肝癌也存在明顯缺失，腫瘤可能與乳腺癌有著類似的發(fā)病機(jī)制，ARHI蛋白可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。

ARHI的表達(dá)缺失可能與TNBC及非TNBC的發(fā)生及發(fā)展均有相關(guān)性，而與TNBC的相關(guān)性更強(qiáng)；ARHI可能是影響TNBC及非TNBC預(yù)后的因素，而影響TNBC的作用更加明顯。因此，ARHI有可能成為判斷TNBC浸潤進(jìn)展及預(yù)后的指標(biāo)之一，在乳腺癌中發(fā)揮著重要的作用。對于ARHI的研究會進(jìn)一步深入，為腫瘤的診斷和治療提供新思路和方法。

[1]Yu Y,Xu F,Peng H,et al.NOEY2(ARHI),an imprinted putative tumor suppressor gene in ovarian and breast carcinomas[J].Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(1):214-219.

[2]Bao JJ,Le XF,Wang RY,et al.Reexpression of the tumor suppressor gene ARHI induces apoptosis in ovarian and breast cancer cells through a caspase-independent calpaindependent pathway[J].Cancer Res,2002,62(24): 7264-7272.

[3]Hisatomi H,Nagao K,Wakita K,et al.ARHI/ NOEY2 inactivation may be important in breast tumor pathogenesis[J].Oncology,2002, 62(2):136-140.

[4]白雪,李冬梅,李銳,等.ARHI基因在乳腺癌組織中的表達(dá)及其意義[J].中國婦幼保健,2013,28(25): 4233-4235.

[5]Wang L,Hoque A,Luo RZ,et al.Loss of the expression of the tumor suppressor gene ARHI is associated with progression of breast cancer[J].Clin Cancer Res,2003,9(10):3660-3666.

[6]陳若琨,薛亞軻,楊鳳東,等.抑癌基因ARHI與膠質(zhì)瘤病理級別相關(guān)性及促凋亡功能研究[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2016,33(8):2047-2049.

[7]彭麗,張華.ARHI與Beclin1表達(dá)水平對甲狀腺癌的分期和分化的影響分析[J].中華普外科手術(shù)學(xué)雜志(電子版),2016,10(3):259-261.

[8]路新卿,李桂英,王德峰,等.ARHI基因?qū)σ认侔┘?xì)胞凋亡的影響[J].臨床薈萃,2011,26(24):2145-2148.

[9]毛沖沖,辛艷超,翟廣,等.ARHI和突變型P53在人腦星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤中的表達(dá)及與惡性程度的相關(guān)性[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2013,35(20):2240-2242.

[10]張?jiān)倥d.ARHI蛋白在喉鱗癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].中國全科醫(yī)學(xué),2013,16(33):3205-3207.

[11]李黎博,唐秋琳,李明星,等.ARHI真核表達(dá)質(zhì)粒對胃癌惡性表型的影響[J].四川大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2013,44(1):10-14,20.

[12]Chen J,Shi S,Yang W,et al.Over-expression of ARHI decreases tumor growth,migration, and invasion in human glioma[J].Med Oncol,2014,31(3):846.

[13]Lu ZH,Chen J,Gu LJ,et al.[ARHI mRNA and protein expression in pancreatic cancers][J].Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao,2001,23(4):324-327.

[14]胡珊珊.ARHI基因?qū)σ认侔┪h(huán)境血管生成的影響及相關(guān)分子機(jī)制的研究[D].北京:北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院,2014.

[15]Huang J,Lin Y,Li L,et al.ARHI,as a novel suppressor of cell growth and downregulated in human hepatocellular carcinoma,could contribute to hepatocarcinogenesis[J].Mol Carcinog,2009,48(2):130-140.

Expressions and clinical significances of tumor suppressor gene ARHI in triple-negative breast cancer(TNBC)

ZHANG Hai-yan, LI Tie-jun, CHEN Liang, et al//
China Medical Equipment,2017,14(4):120-123.

Objective: To investigate the expressions and significances of tumor suppressor gene aplasia ras homologue member I (ARHI) in triple-negative breast cancer (TNBC). Methods: To select 150 patients with triple-negative breast cancer and 135 patients with non-triple-negative breast cancer as the research cases. The expressions of ARHI was detected by immunohistochemistry Streptavidin-Peroxidase (SP) method for 150 cases TNBC and 135 cases non-TNBC, and the different expressions of ARHI in two types of breast cancer were observed and compared. Results: The positive expression of ARHI was 32.0% in the TNBC tissues and was 47.4% in non-TNBC tissues, and the difference between them indicated statistical significance (x2=4.444, P<0.05). The expression of ARHI in TNBC was significantly related with tumor size, clinical stage and axillary lymph node metastasis (x2=8.326, x2=9.382, x2=5.259; P<0.05), while its expression did not show significant correlation with family history of breast cancer and histologic grade (x2=0.172, x2=4.584; P>0.05). The expression of ARHI was significantly related with clinical stage of non-TNBC (x2=6.155, P<0.05), while it did not show correlation with age, tumor size, family history of breast cancer, axillary lymph node metastases and histologic grade (x2=0.002, x2=0.946, x2=0.653, x2=0.031, x2=0.991; P>0.05). Conclusion: The expression deletion of ARHI has more significant in triplenegative breast cancer, and this result suggests that expression of ARHI may be used as one of the indicators in determining the invasive progress and prognosis of TNBC.

Triple-negative breast cancer; Non-triple-negative breast cancer; ARHI; Immunohistochemistry

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2017.04.032

1672-8270(2017)04-0120-04

R737.9

A

2016-12-02

①滄州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校護(hù)理系 河北 滄州 061001

②滄州市中心醫(yī)院教學(xué)處 河北 滄州 061001

③滄州市中心醫(yī)院腫瘤外二科 河北 滄州 061001

*通訊作者：chenliangsy@sina.com

[First-author’s address] The Department of Nursing, Cangzhou Medical College, Cangzhou 061001, China.