龐豐平，霍乃蕊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西晉中 030801）

響應(yīng)面法優(yōu)化瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)條件

龐豐平1，霍乃蕊2＊

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山西晉中 030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山西晉中 030801）

為充分應(yīng)用乳酸菌的產(chǎn)蛋白酶特性，本研究采用響應(yīng)面分析法對(duì)瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化。首先通過Plackett－Burman試驗(yàn)從7種因素中篩選發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、起始pH為影響瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶的重要因素。進(jìn)一步通過響應(yīng)面分析得出最優(yōu)產(chǎn)酶條件：發(fā)酵溫度36℃、發(fā)酵時(shí)間16h、起始pH 6.65，瑞士乳桿菌的產(chǎn)蛋白酶活力為16.81U／mL和22.59U／mL，提高了34.4%，與預(yù)測(cè)結(jié)果接近，表明培養(yǎng)條件的優(yōu)化有效，該發(fā)酵液為瑞士乳桿菌和所產(chǎn)蛋白酶的同步固定化研究提供了原料，也為瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶的應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。

瑞士乳桿菌；培養(yǎng)條件；蛋白酶

乳酸菌是世界公認(rèn)級(jí)和安全級(jí)的益生菌，用于食品加工的歷史久遠(yuǎn)。蛋白酶是一種催化蛋白質(zhì)中肽鍵水解的酶，微生物是蛋白酶的主要來(lái)源之一，多由細(xì)菌和霉菌生產(chǎn)。

不同種屬的乳酸菌菌株所分泌的蛋白酶分子量差異很大，介于30～200kDa，最適溫度范圍一般為40～50℃，最適pH接近中性（pH 5～8）［1，2］。乳酸菌蛋白酶可以分為PrtP（L.lactis和L.paracasei），PrtH（L.helveticus），PrtR（L.rhamnosus），PrtS（St.thermophilus）和PrtB（L.bulgaricus）5種，瑞士乳桿菌蛋白酶屬于PrtH。不同種屬的乳酸菌表達(dá)的細(xì)胞壁蛋白酶的類型不同，通常乳酸菌只分泌一種細(xì)胞壁蛋白酶，而瑞士乳桿菌卻表達(dá)兩種［3］。與傳統(tǒng)發(fā)酵劑相比，瑞士乳桿菌有較強(qiáng)的蛋白水解活性，可用于制備多種活性肽。

目前提高乳酸菌蛋白酶活力的有效途徑之一便是優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)條件。單因素試驗(yàn)或正交試驗(yàn)對(duì)培養(yǎng)條件優(yōu)化時(shí)，得不到整個(gè)區(qū)域各因素的最佳組合和最優(yōu)值［4］，而響應(yīng)面法則可以。嗜酸乳桿菌產(chǎn)細(xì)胞壁蛋白酶的培養(yǎng)條件優(yōu)化時(shí)，將單因素試驗(yàn)結(jié)果、正交試驗(yàn)結(jié)果以及響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行比較，證實(shí)響應(yīng)面法結(jié)果是最優(yōu)的［5］。借助響應(yīng)面分析軟件能快速、可靠地進(jìn)行優(yōu)化實(shí)驗(yàn)安排和統(tǒng)計(jì)分析［6］。本研究利用響應(yīng)面法對(duì)瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，為瑞士乳桿菌蛋白酶的進(jìn)一步利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus） 中國(guó)菌種保藏中心；MRS肉湯 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；乳酸、乳酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、硼酸鈉、無(wú)水碳酸鈉、三氯醋酸、酪素、L－酪氨酸等其他試劑均為分析純。

722可見光分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS－3C型精密pH計(jì) 上海雷磁分析儀器廠；HF160WHeal Force二氧化碳培養(yǎng)箱，臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 香港力康生物醫(yī)療科技控股集團(tuán)；HFsafe－1200LC 上海力申科學(xué)儀器有限公司；Lambda 850紫外可見分光光度計(jì) 美國(guó)Perkin Elmer公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)方法

將瑞士乳桿菌凍干粉接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h，連續(xù)轉(zhuǎn)接活化2代，以1%（V／V）接種量接入三角瓶中進(jìn)行增殖培養(yǎng)，按需將菌體培養(yǎng)液取出。

1.2.2 粗酶液制備

將菌液按3%的接種量接種于新鮮的MRS肉湯培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)36h。取8mL發(fā)酵液于10mL離心管中，4℃，5000r／min離心10min，取上清液作為測(cè)定蛋白酶活力所需粗酶液［7］。

1.2.3 蛋白酶活力的測(cè)定

參照GB／T 23527－2009《蛋白酶制劑》中蛋白酶活力的測(cè)定，采用福林法，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，取平均值［8］。

1.2.4 優(yōu)化方法

采用Plackett－Burman設(shè)計(jì)法從培養(yǎng)時(shí)間、溫度等7個(gè)影響因素中確定3個(gè)最主要因素，然后以響應(yīng)面分析法（Design Expert）對(duì)此3個(gè)因素進(jìn)行優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖1 L－酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 L－tyrosine standard curve

由圖1可得線性回歸方程為：y＝0.01205x－0.0185，R2＝0.99779，可信度較高，可以應(yīng)用。

2.2 Plackett－Burman設(shè)計(jì)法篩選重要因素

結(jié)合瑞士乳桿菌發(fā)酵特性和已有的研究成果［9］，對(duì)影響瑞士乳桿菌產(chǎn)酶的7個(gè)因素X1～X7進(jìn)行兩水平，高水平取低水平的1.25倍，Plackett－Burman試驗(yàn)因素水平表見表1。X1菌齡（h）的－1和1水平分別為16和20；X2培養(yǎng)溫度（℃）的兩水平分別為30和37.5；X3接種量（%）的兩水平分別為2和2.5；X4培養(yǎng)體積（mL）的兩水平分別為40和50；X5培養(yǎng)時(shí)間（h）的兩水平分別為20和25；X6初始pH的兩水平分別為6和7.5；X7生長(zhǎng)因子（%）的兩水平分別為5和6.25。以每毫升酶液的蛋白酶活力作為響應(yīng)值Y，Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表1 Plackett－Burman試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett－Burman experiment

表2 Plackett－Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2Design and test results of Plackett－Burman

對(duì)表2中的結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)，分析各因素的主效應(yīng)，見表3。

表3 各因素影響的主效應(yīng)分析Table 3 Main effect analysis of various influence factors

由表3可知，7種培養(yǎng)條件對(duì)瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶影響的顯著性排列為：培養(yǎng)溫度＞培養(yǎng)時(shí)間＞起始pH＞菌齡＞培養(yǎng)體積＞接種量＞生長(zhǎng)因子。其中，培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、起始pH影響最為顯著，故作為響應(yīng)面優(yōu)化的因素。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)Box－Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理［10］，設(shè)計(jì)三因素三水平共15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，其中12個(gè)是析因點(diǎn)，3個(gè)零點(diǎn)重復(fù)，用以估計(jì)試驗(yàn)誤差，以每毫升酶液的蛋白酶活力為響應(yīng)值Y。培養(yǎng)溫度的3個(gè)水平分別為30，37，45℃；培養(yǎng)時(shí)間的3個(gè)水平分別為12，16，24h；初始pH的3個(gè)水平分別為6，7.5，9，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4。

表4 Box－Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 Experimental design and results of Box－Behnken

根據(jù)表4的試驗(yàn)結(jié)果，通過響應(yīng)面軟件處理確定回歸方程：Y＝28.39＋1.36X1＋2.12X2＋1.23X3＋0.49X1X2＋0.83X1X3＋2.31X2X3－9.74X12－3.78X22－2.61X32。

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Analysis for the variance of regression equation

由表5可知，二次項(xiàng)對(duì)響應(yīng)值的影響極顯著，模型P＜0.05，差異顯著，失擬項(xiàng)反映的是實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型不相符的情況，P＝0.5203＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，因此模型選擇正確。

表6 模型的可信度分析Table 6 Reliability analysis of the model

由表6可知，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2＝0.9460，說明模型可解釋94.60%，即實(shí)驗(yàn)所得的酶活力變化，表明方程擬合較好。Y的變異系數(shù)CV表示實(shí)驗(yàn)的精確度，CV值越高，實(shí)驗(yàn)的可靠性越低，本實(shí)驗(yàn)中CV＝1.9327，較低，說明試驗(yàn)操作可信。

響應(yīng)面分析圖見圖2～圖4。

圖2 x1，x2對(duì)Y值預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface plot and contour plot of Y＝（x1，x2）

圖3 x1，x3對(duì)Y值預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.3 Response surface plot and contour plot of Y＝（x1，x3）

圖4 x2，x3對(duì)Y值預(yù)測(cè)響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface plot and contour plot of Y＝（x2，x3）

由圖2～圖4響應(yīng)面的分析可知，3個(gè)因素均有最優(yōu)值，即培養(yǎng)溫度36℃，發(fā)酵時(shí)間16h，起始pH 6.65，在此點(diǎn)預(yù)測(cè)的酶活力為24.73U／mL。在其余培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件不變的情況下，在初始發(fā)酵條件和優(yōu)化發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)1天后，酶活力分別為16.81U／mL和22.59U／mL，條件優(yōu)化后酶活力提高了34.4%，與預(yù)測(cè)結(jié)果接近，說明培養(yǎng)條件的優(yōu)化有效。

3 討論

本研究通過二水平設(shè)計(jì)的Plackett－Burman試驗(yàn)分析了7種因素對(duì)瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶活力的影響，利用響應(yīng)面法對(duì)瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化，在該優(yōu)化培養(yǎng)條件下，酶活力達(dá)22.59U／mL，較初始培養(yǎng)條件提高了34.4%，增幅較大。張重陽(yáng)等［11］僅對(duì)瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)和提取條件進(jìn)行了研究，并沒有得出較為準(zhǔn)確細(xì)致的培養(yǎng)條件。張瑩等［12］利用正交試驗(yàn)對(duì)瑞士乳桿菌的產(chǎn)蛋白酶發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化研究，優(yōu)化后的產(chǎn)蛋白酶活力特別低，只有62.136U／mL。響應(yīng)面法優(yōu)化瑞士乳桿菌的產(chǎn)蛋白酶培養(yǎng)條件，其產(chǎn)蛋白酶特性進(jìn)一步提高，為瑞士乳桿菌蛋白酶的開發(fā)和研究提供了依據(jù)，此發(fā)酵液也可用于瑞士乳桿菌及其蛋白酶固定化的研究。由于瑞士乳桿菌有較強(qiáng)的蛋白水解活性，也可研究制備多種活性肽。食源性降血壓多肽具有作用溫和、安全性高及生物功能多樣性等特點(diǎn)，這為通過非藥物治療和緩解高血壓提拱了新途徑，滿足了高血壓人群居高不下且難以治愈的客觀需求，也可以將其制品作為功能因子添加劑添加到食品中。

［1］Xing G Y，Pan D D，Tong M，et al.Purification and characterization of cell－envelope proteinase from Lactobacillus casei DI－1［J］.African Journal of Biotechnology，2012，11（84）：15060－15067.

［2］李敏，潘道東.嗜酸乳桿菌細(xì)胞壁蛋白酶的提取優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2011（23）：260－265.

［3］Savijoki K，Ingmer H，Varmanen P.Proteolytic systems of lactic acid bacteria［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2006，71（4）：394－406.

［4］何國(guó)慶.食品酶學(xué)［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

［5］任曉芬，潘道東，曾小群，等.嗜酸乳桿菌產(chǎn)胞壁蛋白酶的培養(yǎng)及發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2014（14）：146－153.

［6］歐宏宇，賈士儒.SAS軟件在微生物培養(yǎng)條件優(yōu)化中的應(yīng)用［J］.天津輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，36（1）：14－17.

［7］李愛芬，孫祖莉，陳敏，等.海產(chǎn)品中蛋白酶產(chǎn)生菌的選育及產(chǎn)酶條件研究［J］.海洋科學(xué)，2003，27（9）：41－43.

［8］張咚咚，安家彥，韓鵬軍，等.傳統(tǒng)發(fā)酵乳中高產(chǎn)蛋白酶乳酸菌的篩選及鑒定［J］.食品科技，2013，38（8）：5－8.

［9］張丹丹，郭宇星，周慧敏，等.瑞士乳桿菌的益生特性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2014，40（5）：32－36.

［10］徐夢(mèng)辰，丁軻，呂瑩，等.山藥蛋白酶解條件及其響應(yīng)面法的優(yōu)化［J］.中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2015（12）：27－32.

［11］張重陽(yáng)，潘道東.瑞士乳桿菌產(chǎn)蛋白酶的培養(yǎng)和提取條件的研究［J］.食品科學(xué)，2006，27（10）：416－418.

［12］張瑩，陳慶森.瑞士乳桿菌高活力蛋白酶發(fā)酵條件的優(yōu)化［J］.食品科學(xué)，2007，28（9）：356－359.

Optimization of Culture Conditions of Protease Produced by Lactobacillus helveticus Using Response Surface Methodology

PANG Feng－ping1，HUO Nai－rui2＊
（1.College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，China；2.College of Animal Science and Technology，Shanxi Agricultural University，Jinzhong 030801，China）

In order to make full application of protease properties of lactic acid bacteria，optimize the culture conditions of Lactobacillus helveticus produced protease using response surface methodology.Firstly，screen seven factors by Plackett－Burman experiment.The fermentation temperature，fermentation time，initial pH are important factors affecting the yield of Lactobacillus helveticus produced protease.Use response surface methodology to obtain the optimum conditions for enzyme production：fermentation temperature of 36℃，fermentation time of 16h，initial pH of 6.65，the protease activity produced by Lactobacillus helveticus is 16.81U／mL and 22.59U／mL，improved by 34.4%，and it is close to the forecasted results，indicating that the optimization of culture conditions is effective，the fermentation broth has provided materials for Lactobacillus helveticus and immobilized and simultaneous research of protease，it has also laid a foundation for the applicaticn of Lactobacillus helveticus produced protease production.

Lactobacillus helveticus；culture conditions；protease

TS201.56

A

10.3969／j.issn.1000－9973.2017.04.002

1000－9973（2017）04－0004－05

2016－10－16 ＊通訊作者

山西省人社廳留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目（2014年度）；山西省回國(guó)留學(xué)人員項(xiàng)目（2014－042）

龐豐平（1991－），男，山西臨汾人，碩士，研究方向：食品生物技術(shù)；霍乃蕊（1972－），女，山西平遙人，教授，博士，主要從事生物技術(shù)與食品安全方面的教學(xué)與科研工作。