鐘 玲

(中航工業(yè)成都363醫(yī)院，四川 成都 610041)

miR-34b在老年鼻咽癌組織中表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲的影響

鐘 玲

(中航工業(yè)成都363醫(yī)院，四川 成都 610041)

目的 探討miR-34b在老年鼻咽癌組織中表達(dá)及對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲的影響。方法 選取初治原發(fā)性老年鼻咽癌患者83例，正常鼻咽黏膜組織40例作為對(duì)照組，培養(yǎng)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株，根據(jù)轉(zhuǎn)染物不同將細(xì)胞分為miR-34b轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)老年鼻咽癌及對(duì)照組組織中miR-34b表達(dá)以及不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-34b表達(dá)，MTT比色法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力，檢測(cè)細(xì)胞黏附能力，Transwell法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力。結(jié)果 老年鼻咽癌組織中miR-34b相對(duì)表達(dá)量為(0.64±0.09)，顯著低于對(duì)照組的(0.94±0.12)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.410，P<0.001)；miR-34b在老年鼻咽癌組織中相對(duì)表達(dá)量與臨床分期、T分期、N分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.001)；miR-34b轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-34b相對(duì)表達(dá)量為(0.85±0.10)，顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別為(0.52±0.08)和(0.50±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=243.329，P<0.001)；與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，miR-34b轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)；miR-34b轉(zhuǎn)染組黏附細(xì)胞數(shù)顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P<0.001)。結(jié)論 miR-34b在老年鼻咽癌組織中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-34b表達(dá)可減少細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞黏附能力，抑制細(xì)胞侵襲能力，有望成為提高鼻咽癌對(duì)放射治療敏感性的目的基因。

鼻咽癌；miR-34b；細(xì)胞增殖；侵襲能力

鼻咽癌作為我國(guó)頭頸部常見(jiàn)惡性腫瘤，好發(fā)于中老年人群，隨著我國(guó)人口老齡化加劇，老年鼻咽癌患病率不斷上升〔1〕。由于鼻咽癌發(fā)病位置隱匿、早期缺乏典型臨床癥狀，加之老年人群各項(xiàng)機(jī)體功能下降，往往合并多種慢性病，多數(shù)患者確診時(shí)已處于晚期，嚴(yán)重影響患者預(yù)后〔2〕。關(guān)于鼻咽癌發(fā)生機(jī)制尚未完全清楚，飲食、環(huán)境和EB病毒感染等多種因素都可能誘發(fā)鼻咽癌〔3〕。微小RNA(miRNA)作為廣泛存在于生物體內(nèi)的高度保守的短小RNA，在調(diào)控多項(xiàng)生理和病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，miRNA表達(dá)異常與人類(lèi)多種腫瘤發(fā)生密切相關(guān)〔4〕。miR-34b作為miR-34家族重要成員，在多種惡性腫瘤發(fā)生及進(jìn)展中發(fā)揮重要作用〔5〕。本研究擬對(duì)miR-34b在老年鼻咽癌患者組織中表達(dá)進(jìn)行分析，并通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-34b處理，觀察其對(duì)人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株增殖、黏附及侵襲能力的影響。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2011年3月至2015年4月在成都363醫(yī)院治療的初治原發(fā)性老年鼻咽癌患者83例，其中，男61例，女22例，年齡65～85〔平均(71.3±7.6)〕歲，均經(jīng)病理學(xué)檢查確診，均為非角化未分化癌，均未接受放化療治療。臨床分期：Ⅰ期1例，Ⅱ期26例，Ⅲ期29例，Ⅳ期27例；T分期：T1+T2期44例，T3+T4期39例；N分期：N0+N1期57例，N2+N3期26例。選取正常鼻咽黏膜組織40例作為對(duì)照組，年齡65～86〔平均(70.4±7.2)〕歲，男27例，女13例，兩組患者性別、年齡等一般情況差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均知情同意。

1.2 主要試劑和設(shè)備 Trizol總RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biomiga公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒和LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，miR-34b、內(nèi)參U6、miR-34b模擬物及陰性對(duì)照序列均由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株由美國(guó)ATCC提供，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(BSA)和G418試劑均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，噻唑藍(lán)法(MTT)細(xì)胞增殖/毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物公司，Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司，人源纖維連接蛋白(Fn)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3 方法

1.3.1 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)老年鼻咽癌及對(duì)照組組織中miR-34b表達(dá) 取老年鼻咽癌及對(duì)照組組織，研磨后，加入細(xì)胞裂解液裂解，用Trizol總RNA提取試劑盒對(duì)組織中總RNA進(jìn)行提取，利用紫外分光光度計(jì)對(duì)總RNA純度進(jìn)行檢測(cè)，取A260/A280≥1.80作為合格樣品。將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為模板單鏈cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR。引物序列分別為：miR-34b：上游：5′-CAATCACTAACTCCACTGCC-3′；U6：上游：5′-ACGCAAATTCGTGAAGCGTT-3′，二者通用下游引物序列為：5′-AACATGTACAGTCCATGGATG-3′。PCR反應(yīng)條件：95℃ 60 s，95℃ 15 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，連續(xù)進(jìn)行38個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣品均設(shè)三個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔。以U6為參照，用2-△△Ct法獲得老年鼻咽癌及對(duì)照組組織中miR-34b相對(duì)表達(dá)量。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將人鼻咽癌CNE-2細(xì)胞株培養(yǎng)于含10% BSA的RPMI 1640培養(yǎng)基中，于37℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)，穩(wěn)定傳代后，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按5×104/孔接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%。將細(xì)胞分為三組，利用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒對(duì)各組進(jìn)行轉(zhuǎn)染：miR-34b轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染miR-34b模擬序列：正義鏈：5′-CAAUCACUAACUCCACUGCCAU-3′，反義鏈：5′-GGCAGUGGAGUUAGUG AUUGUU-3′；陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列：正義鏈：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUC GGAGAATT-3′；空白對(duì)照組：不做任何處理。轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-34b表達(dá) 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解，其余方法同1.3.1。

1.3.4 MTT比色法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力 取各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞，接種于96孔板中，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/孔，每組均設(shè)置6個(gè)平行反應(yīng)復(fù)孔，分別于轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h和96 h，將MTT液20 μl加入各孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，將二甲基亞砜150 μl加入各孔，振蕩15 min，結(jié)晶充分溶解后，利用酶標(biāo)儀對(duì)570 nm處光密度值(OD值)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.5 細(xì)胞黏附能力檢測(cè) 將Fn稀釋液50 μl包被96孔板，于培養(yǎng)箱中處理120 min。將1% BSA 100 μl加入各孔，封閉120 min。取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，加入各孔，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60 min。將96孔板取出后，用甲醛固定15 min，用吉姆薩進(jìn)行染色15 min。顯微鏡下觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野，對(duì)黏附細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.6 Transwell法檢測(cè)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力 取各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h細(xì)胞，胰酶消化后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×104/ml。將50 μl Matrigel膠鋪于24孔板Transwell小室，培養(yǎng)箱中過(guò)夜。去200 μl細(xì)胞懸液加入小室上室，將培養(yǎng)液加入小室下室，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，取出小室，將上室中的細(xì)胞輕輕擦去，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次后，用結(jié)晶紫染色15 min。用顯微鏡進(jìn)行觀察，隨機(jī)取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 老年鼻咽癌及對(duì)照組組織中miR-34b表達(dá)比較 老年鼻咽癌組織中miR-34b相對(duì)表達(dá)量為(0.64±0.09)，顯著低于對(duì)照組的(0.94±0.12，t=14.410，P<0.001)。

2.2 miR-34b在老年鼻咽癌組織中表達(dá)與臨床病理特征之間的關(guān)系 miR-34b在老年鼻咽癌組織中相對(duì)表達(dá)量與年齡、性別無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與臨床分期、T分期、N分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.001)。見(jiàn)表1。

2.3 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-34b表達(dá)比較 miR-34b轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中miR-34b相對(duì)表達(dá)量為(0.85±0.10)，顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別為(0.52±0.08)和(0.50±0.07)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=243.329，P<0.001)。

2.4 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力比較 根據(jù)不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)OD值，繪制細(xì)胞不同時(shí)點(diǎn)生長(zhǎng)曲線(xiàn)，分析發(fā)現(xiàn)，與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比，miR-34b轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

2.5 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞黏附能力和侵襲能力比較 miR-34b轉(zhuǎn)染組黏附細(xì)胞數(shù)顯著高于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，而侵襲細(xì)胞數(shù)顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(均P<0.001)。見(jiàn)表2，圖2，圖3。

指標(biāo)nmiR-34b相對(duì)表達(dá)量t值P值年齡(歲)1.0070.158≥72500.62±0.07<72330.65±0.10性別0.0730.471男610.63±0.08女220.66±0.11臨床分期14.280<0.001Ⅰ+Ⅱ期270.71±0.08Ⅲ+Ⅳ期560.49±0.06T分期17.113<0.001T1+T2期440.81±0.14T3+T4期390.39±0.06N分期15.846<0.001N0+N1期570.77±0.10N2+N3期260.43±0.09淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移16.101<0.001是470.41±0.07否360.78±0.12

圖1 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力比較

組別黏附細(xì)胞數(shù)侵襲細(xì)胞數(shù)miR-34b轉(zhuǎn)染組183.5±21.71)2)135.4±29.51)2)陰性對(duì)照組102.3±15.9218.6±33.9空白對(duì)照組107.6±16.8223.4±38.2F值350.063114.816P值<0.001<0.001

與空白對(duì)照組比較，1)P<0.05；與陰性對(duì)照組比較：2)P<0.05

圖2 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞黏附能力比較

圖3 不同轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力比較

3 討 論

老年鼻咽癌發(fā)病率不斷增加，且受老年人機(jī)體生理功能下降的影響，多數(shù)患者確診時(shí)已處于中晚期，放療成為主要的治療手段，而放療近遠(yuǎn)期效果與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲力等密切相關(guān)〔6〕。miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，可通過(guò)結(jié)合于靶基因mRNA的3′非翻譯區(qū)而降解mRNA或抑制蛋白翻譯，從而實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平上對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控，與細(xì)胞增殖、分化及凋亡、器官形成、免疫反應(yīng)等多種生物學(xué)過(guò)程密切相關(guān)〔7〕。研究表明，腫瘤發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程涉及多種miRNA表達(dá)異常。miR-34b作為miR-34家族重要成員，受P53直接轉(zhuǎn)錄調(diào)控，在抑制腫瘤增殖、分化中發(fā)揮重要作用〔8〕。在對(duì)多種惡性腫瘤研究時(shí)發(fā)現(xiàn)〔9〕，miR-34基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化導(dǎo)致miR-34表達(dá)下調(diào)甚至缺失，可使細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡失調(diào)，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。曹嵐等〔10〕研究發(fā)現(xiàn)，miR-34b啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化使白血病細(xì)胞株中miR-34b表達(dá)降低，而外源性導(dǎo)入miR-34b可抑制細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及侵襲能力。本研究顯示，miR-34b可能參與了老年鼻咽癌發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程，且在該過(guò)程中可能發(fā)揮抑癌基因的功能。

該研究結(jié)果說(shuō)明，利用轉(zhuǎn)染miR-34b模擬物的方式可以上調(diào)CNE-2細(xì)胞中miR-34b表達(dá)，抑制CNE-2細(xì)胞增殖，進(jìn)一步提示miR-34b可能在鼻咽癌發(fā)生中發(fā)揮抑癌基因功能〔11〕；上調(diào)miR-34b還可增加細(xì)胞黏附能力，而降低細(xì)胞侵襲能力，提示miR-34b可能在鼻咽癌發(fā)生、進(jìn)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

綜上，miR-34b在老年鼻咽癌組織中呈低表達(dá)，上調(diào)miR-34b表達(dá)可減少細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞黏附能力，抑制細(xì)胞侵襲能力，有望成為提高鼻咽癌對(duì)放射治療敏感性的目的基因。

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〔2016-12-09修回〕

(編輯 袁左鳴)

四川省衛(wèi)計(jì)委基本醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目(No.110103)

鐘 玲(1983-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事耳鼻喉疾病診斷與治療研究。

R73

A

1005-9202(2017)07-1668-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.043