劉長(zhǎng)偉 吳曉艷

(白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 白城 137000)

miRNA-21和磷酸酶-張力蛋白基因的表達(dá)在老年結(jié)直腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用及機(jī)制

劉長(zhǎng)偉 吳曉艷

(白城醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，吉林 白城 137000)

目的 探討miRNA-21和磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)在老年結(jié)直腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。方法 行大腸癌根治術(shù)的老年患者70例，術(shù)中取癌組織標(biāo)本和距癌組織20 cm以上的切緣大腸正常組織。采用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)標(biāo)本中miRNA-21和PTEN 的mRNA表達(dá)水平；免疫組化和Western印跡分析PTEN蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 結(jié)直腸癌組織中miRNA-21表達(dá)水平明顯高于正常切緣組織(P<0.05)，其中伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者miRNA-21表達(dá)水平明顯高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；隨著結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度增加，miRNA-21表達(dá)水平明顯提升(P<0.05)。結(jié)直腸癌組織中PTEN mRNA表達(dá)水平明顯低于正常切緣組織(P<0.05)；結(jié)直腸癌組織中PTEN蛋白中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例明顯低于正常切緣組織(P<0.05)，PTEN蛋白表達(dá)水平明顯低于正常切緣組織(P<0.05)。伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯低于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者；隨著結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度和Dukes分期增加，PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。Pearson相關(guān)性分析顯示，結(jié)直腸癌組織中miRNA-21轉(zhuǎn)錄水平與PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平之間呈明顯負(fù)相關(guān)。結(jié)論 老年結(jié)直腸癌組織中miRNA-21過表達(dá)會(huì)下調(diào)PTEN的表達(dá)，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

結(jié)直腸癌；miRNA-21；磷酸酶-張力蛋白基因

結(jié)直腸癌是我國(guó)最常見的惡性腫瘤之一，約2/3的結(jié)直腸癌發(fā)生在60歲以上〔1〕。miRNA-21在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，在多種癌組織中表達(dá)異常升高〔2〕。磷酸酶-張力蛋白基因(PTEN)可通過編碼磷酸酶調(diào)控AKT信號(hào)通路，維持細(xì)胞間正常生理功能〔3〕。研究顯示，在肝癌細(xì)胞中miRNA-21可對(duì)PTEN蛋白表達(dá)進(jìn)行調(diào)控〔4〕。本次研究選取老年結(jié)直腸癌組織和正常切緣組織，檢測(cè)其中miRNA-21和PTEN的表達(dá)水平，探討其在老年結(jié)直腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2015年12月在白城醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校附屬醫(yī)院行大腸癌根治術(shù)的老年患者70例，術(shù)前均未接受放療、化療或生物治療；均自愿參與本次研究并簽署知情同意書。其中男42例，女28例；年齡62～85歲，平均(68.51±7.93)歲；結(jié)腸癌45例，直腸癌25例。術(shù)中取癌組織標(biāo)本(肉眼觀察壞死組織較少，黏膜較為完整的癌塊組織)，立即分為3份，1份放入RNA存儲(chǔ)液保存用于mRNA檢測(cè)，1份用10%多聚甲醛溶液固定后用于免疫組化染色，1份放入液氮中凍存用于蛋白質(zhì)檢測(cè)。正常標(biāo)本取自距癌組織20 cm以上的切緣大腸組織。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè) 采用Trizol試劑盒抽提總RNA，分光光度法檢測(cè)總RNA含量和質(zhì)量；使用Taka逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，快速實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀行RT-PCR檢測(cè)(擴(kuò)增長(zhǎng)度230 bp，Tm 58℃)。反應(yīng)體系共20 μl，包括通用PCR反應(yīng)混合物10 μl；上、下游引物各1 μl，引物合成由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成；cDNA 4 μl，去離子水4 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性15 s，60℃退火20 s，72℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán)，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，采用2-△△CT法分析基因相對(duì)表達(dá)量，內(nèi)參為GAPDH，校正miRNA-21和PTEN mRNA的表達(dá)量。

1.3 免疫組化檢測(cè) 標(biāo)本經(jīng)10%多聚甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋組織，4 μm連續(xù)切片，烘干脫蠟，高溫修復(fù)抗原5 min，室溫冷卻，行SP法免疫組化染色，鼠抗人PTEN單克隆抗體購(gòu)于上海常斤生物科技有限公司。封片后在光學(xué)顯微鏡下觀察，細(xì)胞質(zhì)中呈黃色或棕黃色片狀物為PTEN蛋白陽(yáng)性染色，高倍鏡下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞比值。

1.4 Western印跡檢測(cè) 用RIPA蛋白裂解液試劑盒提取癌組織標(biāo)本和正常標(biāo)本的總蛋白質(zhì)，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，行SDS-PAGE電泳，目標(biāo)蛋白濕法轉(zhuǎn)至PVDF膜上，TBST溶液封閉60 min，TBST洗膜后加PTEN一抗(1∶500稀釋)，4℃孵育過夜；洗膜后加二抗(1∶500稀釋)室溫下孵育60 min；滴加ECL超敏發(fā)光液，使用凝膠成像儀檢測(cè)標(biāo)本的發(fā)光信號(hào)，用Image J分析蛋白條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

2.1 癌組織中miRNA-21表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中miRNA-21表達(dá)水平為(2.15±0.43)，明顯高于正常切緣組織的(1.05±0.27，P<0.05)。其中miRNA-21表達(dá)與結(jié)直腸癌分化程度、腫瘤部位之間無相關(guān)性(P>0.05)；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者miRNA-21表達(dá)水平(3.95±0.65)明顯高于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(1.16±0.12，P<0.05)；隨著結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度增加，miRNA-21表達(dá)水平明顯提升(浸潤(rùn)<0.5 cm:2.64±0.82,浸潤(rùn)0.5～1.0 cm:3.40±1.13,浸潤(rùn)>1.0 cm：5.36±1.50；P<0.05)。

2.2 癌組織與正常組織中PTEN mRNA及免疫組化染色 結(jié)直腸癌組織中PTEN mRNA表達(dá)水平為(7.71±1.93)，明顯低于正常切緣組織(5.53±1.36，P<0.05)；結(jié)直腸癌組織中PTEN蛋白中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例為(75.30±7.55)%，明顯低于正常切緣組織〔(94.05±2.38)%,P<0.05〕。見圖1。

2.3 Western印跡檢測(cè)PTEN蛋白表達(dá)水平 結(jié)直腸癌組織中PTEN蛋白表達(dá)水平為(0.406±0.019)，明顯低于正常切緣組織(1.952±0.293,P<0.05)。見圖2。

圖1 正常組織與癌組織中PTEN蛋白表達(dá)的免疫組化染色(×200)

圖2 PTEN蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平

2.4 PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系 結(jié)直腸癌組織中PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平與腫瘤分化程度、部位之間無相關(guān)性(P>0.05)；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)直腸癌患者PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平(1.62±0.35)明顯低于不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(3.05±0.61,P<0.05)；直腸癌腫瘤浸潤(rùn)距離<0.5 cm的PTEN RNA表達(dá)水平4.18±0.65，0.5～1.0 cm為3.50±0.82，>1.0 cm為1.43±0.28；改良版DUKES分期，T1期PTEN RNA表達(dá)水平4.81±0.92，T2期為3.82±0.75，T3期為2.16±0.50，T4期為1.48±0.11，隨著結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度和Dukes分期增加，PTEN mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)。

2.5 結(jié)直腸癌組織中miRNA-21與PTEN表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)直腸癌組織中miRNA-21轉(zhuǎn)錄水平與PTEN mRNA和蛋白表達(dá)水平之間呈明顯負(fù)相關(guān)(r=-0.983、-0.916，均P<0.05)。

3 討 論

miRNA-21的編碼基因定位于液泡膜蛋白基因編碼區(qū)，是第10個(gè)內(nèi)含子。相關(guān)研究顯示，多種癌組織標(biāo)本均存在miRNA-21表達(dá)水平異常升高。本研究說明miRNA-21對(duì)結(jié)直腸癌的進(jìn)展、預(yù)后具有重要影響。最新研究顯示，miRNA-21表達(dá)水平升高可影響β-鏈蛋白、PDCD4、促進(jìn)癌變的發(fā)生，消除該基因可有效降低相關(guān)疾病的癌變風(fēng)險(xiǎn)〔5〕。結(jié)合本次研究結(jié)果可推測(cè)，檢測(cè)miRNA-21水平可作為診斷和靶向治療的指標(biāo)，可用于臨床對(duì)結(jié)腸和直腸癌變?cè)缙诘暮Y查。PTEN是近期發(fā)現(xiàn)的首個(gè)具有雙特異性磷酸酶活性的抑癌基因，在調(diào)控細(xì)胞周期，調(diào)節(jié)細(xì)胞正常生長(zhǎng)、發(fā)育方面具有重要作用〔6〕。本研究說明PTEN參與了結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展，表達(dá)水平降低可促進(jìn)結(jié)直腸癌病情惡化和病灶轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究顯示，PTEN受多種ceRNAs調(diào)控，而其中多數(shù)ceRNAs是之前認(rèn)為與PTEN功能無關(guān)聯(lián)的基因〔7〕。本研究顯示，PTEN mRNA表達(dá)水平與PTEN蛋白表達(dá)呈明顯正相關(guān)，該結(jié)論可為多種依靠調(diào)控蛋白表達(dá)來治療結(jié)直腸癌的構(gòu)想提供理論基礎(chǔ)。腫瘤的發(fā)生與發(fā)展受多種基因共同作用，其中癌基因與抑癌基因之間構(gòu)成了復(fù)雜的腫瘤促進(jìn)和抑制網(wǎng)絡(luò)。相關(guān)研究顯示，miRNA-21轉(zhuǎn)錄后可調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路，進(jìn)而影響結(jié)腸癌細(xì)胞的擴(kuò)散〔8〕。結(jié)合本次研究結(jié)果可認(rèn)為，結(jié)直腸癌組織中miRNA-21過表達(dá)會(huì)明顯降低PTEN表達(dá)水平，導(dǎo)致結(jié)直腸癌的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。

1 丁如良.影響老年直腸癌患者術(shù)后生存時(shí)間的風(fēng)險(xiǎn)因素〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志，2013；33(21)：5415-6.

2 Feng YH，Wu CL，Tsao CJ，etal.Deregulated expression of sprouty2 and microRNA-21 in human colon cancer：correlation with the clinical stage of the disease〔J〕.Cancer Biol Ther，2011；11(1)：111-21.

3 Li X，Zhang G，Luo F，etal.Identification of aberrantly expressed miRNAs in rectal cancer〔J〕.Oncol Rep，2012；28(1)：77-84.

4 Okayama H，Schetter AJ，Harris CC，etal.MicroRNAs and inflammation in the pathogenesis and progression of colon cancer〔J〕.Dig Dis，2012；30(S2)：9-15.

5 Lan F，Yue X，Han L，etal.Genome-wide identification of TCF7L2/TCF4 target miRNAs reveals a role for miR-21 in Wnt-driven epithelial cancer〔J〕.Int J Oncol，2012；40(2)：519-26.

7 Kjaer-Frifeldt S，Hansen TF，Nielsen BS，etal.The prognostic importance of miR-21 in stage Ⅱ colon cancer：a population-based study〔J〕.Br J Cancer，2012；107(7)：1169-74.

8 Rathore S，Hussain M，Ali A,etal.A recent survey on colon cancer detection techniques〔J〕.IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform，2013；10(3)：545-63.

〔2016-06-27修回〕

(編輯 滕欣航)

劉長(zhǎng)偉(1980-)，男，講師，主要從事外科學(xué)臨床教學(xué)研究。

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A

1005-9202(2017)07-1659-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.039