焦克平 趙玉梅 張曉敏

(甘肅省人民醫(yī)院干部病房神經(jīng)內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000)

miR-425對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移與侵襲的影響

焦克平 趙玉梅 張曉敏1

(甘肅省人民醫(yī)院干部病房神經(jīng)內(nèi)科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討miR-425對(duì)人膠質(zhì)細(xì)胞瘤U87細(xì)胞遷移與侵襲能力的影響。方法 利用Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人膠質(zhì)細(xì)胞瘤U87，將細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-425 mimics)、抑制組(轉(zhuǎn)染miR-425 inhibitors)、空白組(無(wú)轉(zhuǎn)染)。Real-time PCR檢測(cè)細(xì)胞中miR-425表達(dá)；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移距離，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的遷移以及侵襲能力，Western印跡檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白(MMP)2、MMP9的表達(dá)水平。結(jié)果 與空白組相比，miR-425 mimics組miR-425表達(dá)明顯上調(diào)，約為空白組的8倍，細(xì)胞侵襲與遷移能力下降，MMP2、MMP9表達(dá)下降，miR-425 inhibitors組miR-425表達(dá)明顯下調(diào)，約為空白組的0.14倍，細(xì)胞侵襲與遷移能力顯著增強(qiáng)，MMP2、MMP9表達(dá)增強(qiáng)。結(jié)論 miR-425的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞的遷移與侵襲能力密切相關(guān)。

膠質(zhì)瘤；miR-425；侵襲；遷移

膠質(zhì)瘤具有發(fā)病率高、易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)〔1〕。標(biāo)準(zhǔn)治療方案是手術(shù)切除聯(lián)合放療、化療，但膠質(zhì)瘤的侵襲性生長(zhǎng)已成為膠質(zhì)瘤治療的一大障礙〔2〕。

Micro RNAs(miRNAs)廣泛存在于真核生物中，是一類具有調(diào)節(jié)功能，但不能被編碼的單鏈RNA，不僅是癌癥形成的促進(jìn)子，還是其抑制子；還能通過(guò)多種分子機(jī)制調(diào)控腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力，在調(diào)節(jié)腫瘤的形成和發(fā)展中發(fā)揮作用〔3〕。前期研究發(fā)現(xiàn)，miR-425的表達(dá)可能與膠質(zhì)瘤的生物學(xué)功能有關(guān)，然而目前關(guān)于miR-425在膠質(zhì)瘤方面的作用研究還很少。本研究擬探討在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染miR-425模擬物以及抑制物對(duì)細(xì)胞侵襲遷移的影響及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞研究所。miR-425模擬物和miR-425抑制物購(gòu)自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司。DMEM高糖細(xì)胞培養(yǎng)液，DMEM-FBS培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，Taqman MicroRNA Real-time PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Gene Copoeia公司，胰蛋白酶購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec公司，紫外分光光度計(jì)購(gòu)自上海美譜達(dá)儀器有限公司、實(shí)時(shí)定量PCR儀購(gòu)自西安天隆科技有限公司。

1.2 膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的培養(yǎng) U87細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM在5% CO2，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～4 d。細(xì)胞粘連后，用0.25%胰蛋白酶消化。然后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，按照鋪滿的要求3倍稀釋細(xì)胞，把細(xì)胞接種于不同的培養(yǎng)板中。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞接種于6孔板中。將Lipo 2000轉(zhuǎn)染試劑分別與20 μmol/L的miR-425 mimics和miR-425 inhibitors等體積混合后，室溫孵育15 min，加入6孔板，使用無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)6 h，之后換用10% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)2 d。

1.4 Real-time PCR檢測(cè)miR-425的表達(dá) 使用miRNA抽提試劑盒的使用方法提取U87細(xì)胞的總RNA，并檢測(cè)RNA濃度。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA加入到Taqman MicroRNA Real-time PCR試劑盒，在實(shí)時(shí)PCR儀上進(jìn)行定量檢測(cè)。并采用2-△△Ct方法分析miR-425在不同細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 將轉(zhuǎn)染過(guò)24 h的細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，取200 μl懸液加入Transwell小室的上室，向小室的下室加入600 μl含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，將小室置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，2 h后取出，進(jìn)行固定、染色，放置在倒置顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。

1.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 當(dāng)轉(zhuǎn)染24 h后取出6孔板，使用事先消毒處理過(guò)的加樣槍頭垂直在培養(yǎng)板中部及兩側(cè)劃3條平行直線。加入新鮮培養(yǎng)基后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。劃痕后分別在24 h后進(jìn)行觀察，并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞的遷移距離。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 Transwell小室上室側(cè)鋪一層基質(zhì)膠后，接種不含F(xiàn)BS的經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染24 h的細(xì)胞懸液，下室加入含F(xiàn)BS的完全培養(yǎng)基，將Transwell小室置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)12 h，并進(jìn)行固定、染色，隨后放置于倒置顯微鏡下拍照并計(jì)數(shù)。每組細(xì)胞使用3個(gè)Transwell小室，在倒置顯微鏡下每個(gè)小室隨機(jī)選取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.8 Western印跡檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、9活性 使用蛋白提取試劑盒提取轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的總蛋白，并采用二喹啉甲酸(BCA)法測(cè)定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液后，100℃煮沸制備蛋白樣品。配置8%的蛋白膠，蛋白膠凝固后進(jìn)行上樣，上樣時(shí)應(yīng)保證每孔蛋白量一致，恒壓80 V電泳，待Marker跑出濃縮膠時(shí)，換用120 V電壓繼續(xù)電泳，直至溴酚藍(lán)跑出玻璃板。冰浴100 V進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉6 h，以MMP2、9抗體作為一抗，4℃孵育過(guò)夜，Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，5 min/次，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗之后常溫孵育1 h，TBST清洗纖維素膜3次，5 min/次。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光劑顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism 5軟件行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Real-time PCR檢測(cè)miR-425的相對(duì)表達(dá) 轉(zhuǎn)染miR-425 mimics的U87膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-425的表達(dá)水平(8.00±0.189)較空白組(1.00)顯著上升(P<0.01)，miR-425 inhibitors中miR-425的表達(dá)水平(0.14±0.162)顯著下降(P<0.01)。說(shuō)明在U87細(xì)胞中成功轉(zhuǎn)染miR-425的mimics及inhibitors。

2.2 miR-425表達(dá)水平對(duì)U87細(xì)胞侵襲的影響 相對(duì)于對(duì)照組遷移細(xì)胞〔(150.90±5.83)個(gè)〕，miR-425 mimics組細(xì)胞侵襲能力顯著下降〔(76.87±5.42)個(gè)〕，miR-425 inhibitors組顯著上升〔(255.58±7.42)個(gè)〕(P<0.05)。說(shuō)明高表達(dá)miR-425可以有效抑制U87細(xì)胞的侵襲。

2.3 miR-425表達(dá)水平對(duì)U87細(xì)胞遷移的影響 轉(zhuǎn)染miR-425 mimics后，與對(duì)照組〔(660.12±5.62)個(gè)，(0.67±0.02)cm〕相比，miR-425 mimics組細(xì)胞遷移率及遷移距離〔(30.60±4.32)個(gè)，(0.52±0.03)cm〕顯著下降，miR-425 inhibitors組〔(89.68±5.92)個(gè)，(0.95±0.02)cm〕顯著上升(P<0.05)。

2.4 miR-425表達(dá)水平對(duì)MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的影響 轉(zhuǎn)染miR-425 mimics后，與對(duì)照組相比，miR-425 mimics組MMP2和MMP9蛋白表達(dá)下降，miR-425 inhibitors組表達(dá)上升。見(jiàn)圖1。

圖1 miR-425表達(dá)對(duì)MMP2和MMP9蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

膠質(zhì)瘤的難治愈性主要取決于它的侵襲與遷移〔4〕，膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)周圍腦組織的侵襲性嚴(yán)重限制著治療的有效性，目前對(duì)膠質(zhì)瘤的治療手段受到諸多限制〔5〕。

miRNAs是一類內(nèi)源性非編碼的小分子RNA，長(zhǎng)度約為18～25個(gè)核苷酸，能與特定的mRNA分子的3′UTR結(jié)合，阻礙mRNA的翻譯，甚至?xí)?dǎo)致mRNA降解。研究表明，miRNAs參與多種病理過(guò)程，還參與胚胎形成與發(fā)育過(guò)程〔6，7〕。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)miRNAs的異常表達(dá)與特定腫瘤之間也存在相關(guān)性，部分miRNAs對(duì)腫瘤的形成發(fā)育有抑制作用〔8〕。本研究侵襲與遷移實(shí)驗(yàn)顯示，U87中miR-425的表達(dá)量提高后穿過(guò)Transwell濾膜的細(xì)胞數(shù)明顯減少，且腫瘤細(xì)胞的遷移距離明顯變短，表明細(xì)胞侵襲與遷移能力均下降；相反下調(diào)miR-425表達(dá)后，穿膜細(xì)胞數(shù)目顯著增加，腫瘤細(xì)胞的遷移距離增加，表明細(xì)胞的侵襲與遷移能力增長(zhǎng)。MMPs是一類鋅離子依賴蛋白酶〔9〕，在腫瘤的侵襲與遷移過(guò)程中起重要作用。研究發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP9與膠質(zhì)瘤的侵襲能力高度相關(guān)〔10，11〕。本研究表明miR-425的表達(dá)水平能調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的侵襲、遷移能力，這種調(diào)節(jié)與腫瘤細(xì)胞中MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)密切相關(guān)。

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〔2016-12-13修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

1 云南省第二人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

張曉敏(1977-)，女，主治醫(yī)師，主要從事腦血管疾病研究。

焦克平(1977-)，女，主治醫(yī)師，碩士，主要從事神經(jīng)免疫性疾病研究。

R739.4

A

1005-9202(2017)07-1615-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.020