于洋洋 梁明輝

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

丹皮酚對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡及JAK-STAT信號(hào)通路的影響

于洋洋 梁明輝

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 探究丹皮酚(Pae)對(duì)肝癌細(xì)胞增殖凋亡及JAK-STAT信號(hào)通路的影響。方法 采用MTT法檢測(cè)7.5、15、22.5、30、60 mg/L Pae 對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用；采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)60 mg/L Pae作用HepG2細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡情況；qRT-PCR法檢測(cè)Pae處理對(duì)HepG2細(xì)胞Stat3、Stat5 mRNA的影響；Western印跡檢測(cè)Pae處理JAK-STAT信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果 Pae對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用與培養(yǎng)時(shí)間和藥物劑量呈依賴性，當(dāng)Pae濃度為60 mg/L，處理細(xì)胞72 h時(shí)抑制效果最佳;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示對(duì)照組細(xì)胞未出現(xiàn)大量凋亡，經(jīng)60 mg/L Pae處理72 h后的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，處理組凋亡率明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與對(duì)照組相比，不同濃度Pae作用HepG2細(xì)胞 48 h后，STAT3、STAT5基因表達(dá)量逐漸降低(P<0.05)，且與Pae劑量呈依懶性；Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示60 mg/L Pae 處理HepG2細(xì)胞48 h后，JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。結(jié)論 Pae能夠抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖、誘導(dǎo)其凋亡，其機(jī)制可能與抑制JAK-STAT信號(hào)通路STAT3、STAT5基因和蛋白表達(dá)相關(guān)。

丹皮酚；HepG2細(xì)胞；凋亡；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白

目前臨床上治療肝癌主要以手術(shù)和化療為主，95%的患者在確診時(shí)已為晚期，化療藥物雖然對(duì)患者病情具有一定控制作用，但其毒副作用較大〔1，2〕。丹皮酚(Pae)是從牡丹根部提取的化合物，具有消炎、解熱、鎮(zhèn)痛的療效，研究表明Pae對(duì)肝癌細(xì)胞具有一定的抑制作用〔3〕。本研究旨在探討Pae對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2抑制凋亡及Janus蛋白酪氨酸激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化蛋白(JAK/STAT)信號(hào)通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞購(gòu)于上海生物細(xì)胞研究所，本院凍存。丹皮酚注射液購(gòu)于北京雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)：Z31020399，規(guī)格：2 ml/10 mg；胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)于杭州四季青有限公司，MTT、DMSO購(gòu)于Sigma公司；鏈霉素和青霉素購(gòu)于華北制藥有限公司；2×SYBR Green Mix 訂購(gòu)于Takara公司；兔抗人JAK1、JAK2單克隆抗體購(gòu)于Cell Signaling Technoloy 公司，鼠抗人STAT3單抗購(gòu)于Origene 公司；鼠抗人β-actin單克隆抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗山羊抗兔IgG購(gòu)于中杉金橋公司。二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)于Thermo公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于美國(guó)Thermo Scientific公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀購(gòu)于Nano Drop公司；熒光定量PCR儀器購(gòu)于Bio-Red公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 從超低溫冰箱中取出凍存細(xì)胞，置于30℃水浴中使細(xì)胞解凍，加入5 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，添加0.2%胰蛋白酶進(jìn)行消化后于DMEM培養(yǎng)基中終止消化，加入10%FBS的DEME培養(yǎng)液，移液槍吹打培養(yǎng)液使細(xì)胞密度為106個(gè)/m3，置于5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)達(dá)到80%時(shí)加入胰蛋白酶消化，用DMEM培養(yǎng)基洗滌3次，800 r/min離心3 min，收集細(xì)胞。按照1∶3比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，第三代細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.2.2 MTT法檢測(cè)Pae對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用 將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HepG2細(xì)胞接種于96孔板中加入100 μl DEME培養(yǎng)液，將Pae用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋使?jié)舛葹?.5、15、22.5、30、60 mg/L，將稀釋后的藥物100 μl加入培養(yǎng)板，上述5組每組設(shè)置4個(gè)重復(fù)，同時(shí)以未加入Pae處理的孔作為對(duì)照組，分別培養(yǎng)24、48、72 h，培養(yǎng)結(jié)束后加入20 μl MTT，37℃反應(yīng)4 h，去除細(xì)胞上清液后加入200 μl DMSO，37℃孵育20 min，于波長(zhǎng)570 nm下測(cè)定各組的濃度，細(xì)胞存活率=OD實(shí)驗(yàn)組/OD空白組×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)Pae對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡的影響 以未進(jìn)行Pae處理的細(xì)胞為對(duì)照組，以60 mg/L Pae 處理后的HepG2細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，培養(yǎng)使細(xì)胞液密度為103個(gè)/m3，37℃反應(yīng)48 h后收集細(xì)胞，加入PBS溶液洗滌。對(duì)照組添加200 μl DMSO溶液，實(shí)驗(yàn)組加入100 μl DMSO和20 μl PI，避光反應(yīng)20 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.4 qRT-PCR法檢測(cè)Pae處理對(duì)HepG2細(xì)胞STAT3、STAT5 mRNA的影響 收集處理后的HepG2細(xì)胞，參照細(xì)胞總RNA提取試劑盒進(jìn)行細(xì)胞RNA提取，采用mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA翻轉(zhuǎn)為cDNA，STAT3熒光定量引物序列：正義：5′-TTGGAGGCAGGAATAGG-3′ 反義：5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′，STAT5引物序列：正義：5′-TTTGGAGGCAGGAATAGG-3′反義：5′-TGGCTTGACGGGTTGAT-3′，以β-actin 為內(nèi)參，序列：正義5′-TCCACCGCAAATGCTTCTAG-3′，反義：5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3′。20 μl反應(yīng)體系：10 μl 2×SYBR Green Mix，正義、反義引物各1 μl，H2O 7 μl，10×cDNA模板1 μl，反應(yīng)程序95℃ 3 min，94℃ 10 s、56℃ 20 s，72℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min，95℃ 10 s。利用CFX manager 3.0軟件進(jìn)行CQ值分析，以β-actin作為內(nèi)參基因，按照2-ΔΔCQ算法進(jìn)行基因相對(duì)定量分析。

1.2.5 Western印跡檢測(cè)JAK-STAT信號(hào)通路蛋白的表達(dá) 收集處理后的細(xì)胞液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定提取后蛋白的濃度，配制8%、12%的分離膠與濃縮膠，取30 μg蛋白上樣，蛋白Marker 5 μl，濃縮膠電壓設(shè)置為80 V，分離膠電壓為120 V，反應(yīng)結(jié)束將蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜上(JAK1和JAK2：200 mA，100 min；STAT3：90 V，120 min)加入脫脂牛奶封閉4 h，加入一抗(兔抗人JAK1、JAK2，鼠抗人STAT3單抗)4℃震蕩過夜，加入PBS溶液清洗3次，10 min/次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫下反應(yīng)2 h，加入PBS溶液清洗3次，10 min/次。將蛋白凝膠用EXL發(fā)光后，在暗室中曝光，利用凝膠成像儀對(duì)Western印跡產(chǎn)生的條帶進(jìn)行定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS17.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 Western印跡檢測(cè)JAK-STAT信號(hào)通路蛋白的表達(dá) 用60 mg/L Pae 處理HepG2細(xì)胞48 h后，JAK1、JAK2、STAT3、STAT5蛋白表達(dá)量均顯著低于對(duì)照組。見圖1。

A.未經(jīng)Pae處理； B：60 mg/L Pae 處理48 h圖1 Western印跡檢測(cè)結(jié)果

2.2 MTT法檢測(cè)Pae對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用 不同濃度Pae對(duì)HepG2細(xì)胞均有一定抑制作用，Pae對(duì)HepG2細(xì)胞的抑制作用與培養(yǎng)時(shí)間和藥物劑量呈依賴性，在相同濃度下，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的抑制率逐漸增加，相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，隨著劑量的增加，細(xì)胞的抑制作用逐漸增強(qiáng)。當(dāng)Pae濃度為60 mg/L，處理細(xì)胞72 h時(shí)，抑制效果最佳。見圖2。

圖2 HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HepG2細(xì)胞的凋亡 對(duì)照組細(xì)胞未出現(xiàn)大量凋亡，經(jīng)60 mg/L Pae處理72 h后的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，處理組凋亡率(80%)明顯高于對(duì)照組(10%)(P<0.05)。

2.4 qRT-PCR法檢測(cè)Pae處理對(duì)HepG2細(xì)胞STAT3、STAT5 mRNA的影響 選取7.5、15、22.5、30 mg/L Pae 作用HepG2細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組(0.90，0.81)相比，隨著處理濃度的增加，STAT3、STAT5基因表達(dá)量逐漸降低(7.5、15、22.5、30 mg/L Pae處理后細(xì)胞STAT3、STAT5 mRNA表達(dá)量分別為0.80，0.75；0.70，0.60；0.60，0.48；0.50，0.41；P<0.05)，與Pae劑量呈依懶性。

3 討 論

肝癌的發(fā)生發(fā)展是由多因素、多基因、多步驟共同參與而導(dǎo)致的結(jié)果，探究其發(fā)生原因主要與以下幾方面相關(guān)：(1)癌基因的激活或抑癌基因的失活；(2)肝細(xì)胞抗原結(jié)構(gòu)發(fā)生變化；(3)信號(hào)通路被激活使凋亡機(jī)制的失活；(4)細(xì)胞增殖異常、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受到外源刺激〔4～6〕。

牡丹皮性寒、味苦有清熱解毒、活血化瘀的功效，具有保肝、消炎、抗癌、保護(hù)神經(jīng)、抗過敏性哮喘等作用，Pea是從牡丹皮中提取的有效化學(xué)成分〔7〕，近期有較多文獻(xiàn)報(bào)道Pae能夠通過多種途徑抑制控制腫瘤細(xì)胞的增殖，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明Pae能夠通過升高血清中SOD、GSH-Px抑制脂質(zhì)過氧化進(jìn)而抑制癌細(xì)胞增殖〔8〕，體外實(shí)驗(yàn)表明Pea能夠抑制乳腺癌細(xì)胞以及宮頸癌細(xì)胞增殖〔9〕。此外，Pae與姜黃素聯(lián)合使用后抗腫瘤活性得到進(jìn)一步提高，在Pae對(duì)肝癌MHCC97的抑制機(jī)制實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示Pae通過降低AKT表達(dá)、升高PTNE基因表達(dá)而抑制癌細(xì)胞增殖〔10，11〕。本研究結(jié)果表明Pae能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞增殖，隨著PAE處理濃度的增加以及培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制作用逐漸增強(qiáng)，而且進(jìn)一步流式細(xì)胞檢測(cè)也顯示經(jīng)Pae處理后細(xì)胞出現(xiàn)大量凋亡，表明Pae具有誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用。

JAK-STAT信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，在正常情況下JAK和STAT通過反饋調(diào)節(jié)模式維持相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，機(jī)體產(chǎn)生病變后激活JAK蛋白磷酸化，激活信號(hào)傳導(dǎo)途徑，使STAT蛋白中的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，活化后形成同源二聚體進(jìn)入細(xì)胞核中與相應(yīng)靶基因結(jié)合從而調(diào)控其進(jìn)行表達(dá)。相關(guān)研究表明STATS蛋白家族中的大部分成員對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡以及細(xì)胞免疫方面產(chǎn)生一定影響。研究表明STAT3、STAT5被異常激活后，能夠引起下游靶基因如Survivin、Bcl-2、caspases、c-myc、Cyclin D1等的異常表達(dá)，這些基因均與細(xì)胞增殖凋亡等病理過程相關(guān)〔12〕。有研究表明STAT3在乳腺癌、肝癌、淋巴癌、肺癌中均大量表達(dá)，而正常組織中表達(dá)量較低〔13〕。在研究JAK-STAT信號(hào)通路與肝癌患者預(yù)后關(guān)系中結(jié)果顯示JAK-STAT途徑中JAK、STAT蛋白過度表達(dá)不利于患者預(yù)后〔14〕。有文獻(xiàn)報(bào)道JAK化學(xué)阻斷劑能夠誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，而不影響正常細(xì)胞〔15〕。本研究結(jié)果顯示使用Pae處理后HepG2細(xì)胞中STAT3、STAT5基因表達(dá)量降低，提示這兩者基因的表達(dá)與肝癌細(xì)胞抑制相關(guān)，進(jìn)一步從蛋白水平上研究結(jié)果顯示JAK1、JAK2、STAT3蛋白表達(dá)量下降，這與相關(guān)文獻(xiàn)〔13〕報(bào)道Pae能誘導(dǎo)BEL-7402細(xì)胞凋亡相符，提示JAK-STAT信號(hào)通路在肝癌發(fā)展中占有重要作用，Pae處理后能夠通過影響JAK-STAT信號(hào)通路蛋白表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞增殖。

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〔2016-11-30修回〕

(編輯 郭 菁)

齊齊哈爾市科技計(jì)劃指令性項(xiàng)目(XCP-201401)

梁明輝(1975-)，男，碩士，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，主要從事醫(yī)學(xué)影像學(xué)研究。

于洋洋(1989-)，男，主要從事臨床醫(yī)學(xué)研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)07-1591-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.011