陳 彤 楊小龍 楊智玲

(甘肅省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

微小RNA-140-5p在老年下咽癌組織中的表達及對下咽癌細胞株FaDu遷移、侵襲力的影響

陳 彤 楊小龍 楊智玲

(甘肅省人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討微小RNA-140-5p(MiR-140-5p)影響去整合素金屬蛋白酶(ADAM)10表達對老年下咽癌組織和細胞的作用。方法 實時熒光定量RCR檢測MiR-140-5p和ADAM10在41例老年下咽癌患者腫瘤組織及癌旁組織中的表達；利用轉染技術分別上調MiR-140-5p表達，下調MiR-140-5p和ADAM10表達；采用Transwell細胞侵襲/遷移實驗檢測MiR-140-5p上調、MiR-140-5p下調、ADAM10下調對FaDu細胞遷移、侵襲的影響；Western印跡檢測41對組織標本和FaDu細胞的ADAM10蛋白表達。結果 MiR-140-5p在下咽癌組織中明顯下調，ADAM10 mRNA和蛋白在下咽癌組織中均明顯上調。實驗組FaDu細胞干擾ADAM10表達后，ADAM10表達水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)。Transwell實驗顯示，遷移和侵襲實驗中MiR-140-5p上調組每視野下平均遷移細胞數均明顯低于對照組，MiR-140-5p下調組均明顯高于對照組(P<0.05)；ADAM10干擾實驗組遷移和侵襲細胞數明顯低于對照組(P<0.05)。ADAM10下調可逆轉MiR-140-5p下調對細胞遷移和侵襲能力的促進作用。Western印跡顯示，MiR-140-5p表達上調后，實驗組ADAM10蛋白表達水平明顯低于陰性對照組；MiR-140-5p表達下調后，實驗組ADAM10蛋白表達水平明顯高于陰性對照組。結論 MiR-140-5p在老年下咽癌組織中低表達，ADAM10高表達。MiR-140-5p抑制下咽癌細胞遷移、侵襲力可通過下調ADAM10蛋白表達實現，MiR-140-5p可作為下咽癌治療的新靶點。

下咽癌；微小RNAs；去整合素金屬蛋白酶10

目前高齡下咽癌患者逐漸增多，作為頭頸部鱗狀細胞癌中預后最差的惡性腫瘤，患者5年生存率僅為25%～30%〔1〕。高齡患者多合并循環(huán)、呼吸系統(tǒng)疾病，治療較為困難。因此，深入研究下咽癌轉移的分子機制，探索相關作用靶點，對下咽癌的防治具有重要意義。微小RNA(miRNA)可在腫瘤轉移、侵襲過程中發(fā)揮致癌或抑癌基因的作用。MiR-140-5p是miRNA家族中一員，相關研究發(fā)現，MiR-140-5p在肝癌、舌癌組織中表達下調，扮演抑癌基因的角色〔2〕，但其在下咽癌中的作用機制仍未明確。去整合素金屬蛋白酶(ADAM)10作為一種跨膜蛋白，在多個腫瘤組織中存在高表達，且與腫瘤的增殖、遷移明顯相關。研究顯示，MiR-140-5p可通過靶向抑制ADAM10的表達發(fā)揮抑制腫瘤轉移的作用〔3〕，但在下咽癌中的可能調控機制鮮有報道。本次研究檢測MiR-140-5p和ADAM10在老年下咽癌組織中的表達情況，并進一步以下咽癌細胞株FaDu為材料，探究MiR-140-5p對FaDu細胞遷移、侵襲力的影響，并分析其與預測靶點ADAM10的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2014年6月至2015年12月在本院耳鼻喉頭頸外科行手術治療的老年原發(fā)性下咽鱗狀細胞癌患者41例，均未接受放化療，病灶無遠處轉移；本次研究經醫(yī)院倫理委員會批準，患者或家屬簽署知情同意書。男38例，女3例，年齡60～75歲；原發(fā)部位梨狀窩癌27例，環(huán)后癌10例，下咽后壁癌4例。每位患者均取下咽原發(fā)腫瘤組織和對應的癌旁組織(與腫瘤切緣距離>0.5 cm，病理檢查顯示無殘余癌細胞)。人下咽癌細胞株FaDu購于南京科佰生物科技有限公司。

1.2 主要試劑與儀器 轉染試劑Lipofectamine?3000(南京森貝伽生物科技有限公司)；MiR-140-5p過表達載體、si-ADAM10構建與測序(南京科維思生物科技有限公司)；MiR-140-5p引物、qRT-PCR試劑盒、Transwell小室(美國Genecopoeia公司)；兔抗人ADAM10抗體、小鼠抗人β-actin抗體(北京寰宇科創(chuàng)生物科技發(fā)展有限公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。熒光顯微鏡CKX41(日本OLYMPUS)；全自動細胞計數儀(美國Nexcelom)；Mx3005P熒光定量PCR儀(美國Agilent)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及轉染 人下咽癌細胞株FaDu用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中每2～3 d傳代一次，取對數期細胞進行實驗。細胞計數后按每孔5×105接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞覆蓋率≥70%時開始轉染。

MiR-140-5p上調實驗分組：①空白對照組：僅加入Lipofectamine?3000；②陰性對照組：加入過表達載體陰性對照組miRNA和Lipofectamine?3000；③MiR-140-5p上調組：加入has-MiR-140-5p過表達載體和Lipofectamine?3000。

MiR-140-5p下調分組：①空白對照組同上；②陰性對照組：加入陰性對照miRNA和Lipofectamine?3000；③MiR-140-5p下調實驗組：加入MiR-140-5p inhibitor和Lipofectamine?3000；④MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染組：加入MiR-140-5p inhibitor、si-ADAM10 RNA、Lipofectamine?3000。

ADAM10干擾實驗分組：①空白對照組同上；②陰性對照組：加入陰性對照siRNA和Lipofectamine?3000；③ADAM10干擾實驗組：加入si-ADAM10 RNA和Lipofectamine?3000。

1.3.2 實時熒光定量RCR Trizol法提取標本組織和FaDu細胞中RNA，測定RNA純度，使用All-in-OneTMqPCR檢測試劑盒及Revert Aid First Strand cDNA試劑盒進行MiR-140-5p和ADAM10的反轉錄，均在常規(guī)PCR反應條件下進行40個循環(huán)，MiR-140-5p以U6為內參，ADAM10以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參。每個標本均檢測3次，2-△△CT法計算相對表達量。

1.3.3 Western印跡 RIPA蛋白裂解試劑盒提取標本組織和FaDu細胞中的總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。95℃變性5 min，取30 μg行PAGE，濕法轉移到聚偏氟丙烯(PVDF)膜，奶粉封閉后加入兔抗人ADAM10一抗(1∶1 000稀釋)和小鼠抗人β-actin一抗(1∶3 000稀釋)，4℃孵化過夜，加入二抗(1∶3 000稀釋)，化學增強發(fā)光法(ECL)顯色，熒光圖像分析儀采集圖像。

1.3.4 Transwell細胞侵襲/遷移實驗 Matrigel膠與無血清DMEM培養(yǎng)基按1∶3比例配制基質膠，取20 μl抹于Transwell小室，細胞培養(yǎng)箱中孵育3 h，消化各組細胞，使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，上室加入100 μl含5×104個細胞的懸液，下室加入500 μl含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，小室放入培養(yǎng)箱中孵育24 h，用無菌棉簽去除上室中的基質膠和殘余細胞，光學顯微鏡下選取5個視野計數并拍照。遷移實驗中小室不鋪基質膠，其余步驟同侵襲實驗。

2 結 果

2.1 MiR-140-5p、ADAM10 mRNA及蛋白在標本組織中表達 PCR檢測顯示，MiR-140-5p在下咽癌組織中表達水平為0.091±0.045，明顯低于癌旁組織中0.155±0.097，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.01)。以檢測結果的中位數為臨界值將41例下咽癌患者分為MiR-140-5p低表達組21例和高表達組20例。分析MiR-140-5p表達與臨床病理特征關系顯示，MiR-140-5p表達與性別無明顯相關性，與腫瘤T分期和淋巴結轉移N分期明顯關聯(lián)(P<0.05)，見表1。PCR檢測顯示，ADAM10 mRNA在下咽癌組織中表達水平為0.088±0.051，明顯高于癌旁組織中0.046±0.023(P<0.01)。Western印跡檢測顯示，ADAM10蛋白在下咽癌組織中表達水平為0.992±0.263，明顯高于癌旁組織中0.506±0.229(P<0.01)，見圖1。

表1 臨床病理參數與MiR-140-5p表達的關系(n)

圖1 ADAM10蛋白在癌旁組織和下咽癌組織中表達情況

2.2 轉染MiR-140-5p上調、MiR-140-5p下調與ADAM10干擾后檢測has-MiR-140-5p和ADAM10的表達情況 PCR檢測顯示，MiR-140-5p上調組MiR-140-5p表達水平為0.145±0.025，明顯高于陰性對照組的0.051±0.013(P<0.05)。MiR-140-5p下調組MiR-140-5p表達水平為0.011±0.003，明顯低于陰性對照組的0.036±0.009(P<0.05)?？瞻讓φ战M與陰性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。ADAM10干擾實驗組ADAM10 mRNA表達水平為0.020±0.005，明顯低于陰性對照組的0.691±0.018(P<0.05)；進一步行Western印跡檢測顯示，ADAM10干擾實驗組蛋白表達水平為0.422±0.056，明顯低于空白對照組1.016±0.321和陰性對照組1.150±0.406(P<0.01)，見圖2。

圖2 ADAM10干擾實驗中各組ADAM10蛋白表達情況

A.遷移實驗陰性對照組；B.遷移實驗MiR-140-5p上調組；C.侵襲實驗陰性對照組；D.侵襲實驗MiR-140-5p上調組圖3 Transwell實驗觀察MiR-140-5p上調對FaDu細胞遷移和侵襲力的影響(×100)

2.3 MiR-140-5p上調對FaDu細胞的影響 圖3可見，遷移實驗中，MiR-140-5p上調組每視野下平均遷移細胞數分別為95.444±18.159，明顯低于陰性對照組的160.451±16.005(P<0.05)。侵襲實驗中，MiR-140-5p上調組每視野下平均遷移細胞數分別為75.000±6.726，明顯低于陰性對照組的103.557±10.747(P<0.05)?？梢娚险{MiR-140-5p表達后腫瘤細胞遷移和侵襲力明顯降低，其在下咽癌中起到抑癌基因作用。

2.4 MiR-140-5p對FaDu細胞中ADAM10蛋白表達的影響和MiR-140-5p下調對FaDu細胞的影響及與ADAM10蛋白表達的關系 MiR-140-5p表達上調后，實驗組的ADAM10蛋白表達水平明顯低于陰性對照組；MiR-140-5p表達下調后，實驗組的ADAM10蛋白表達水平明顯高于陰性對照組。提示MiR-140-5p可抑制ADAM10蛋白表達。使用FaDu細胞同時轉染MiR-140-5p inhibitor和si-ADAM10 RNA時，發(fā)現si-ADAM10 RNA可在一定程度上逆轉MiR-140-5p下調對ADAM10蛋白的升高作用。遷移實驗中，對照組、ADAM10干擾實驗組、MiR-140-5p下調組以及MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染組的遷移細胞數分別為：158.442±12.585、100.005±18.458、285.441±13.775、227.795±30.259，MiR-140-5p下調實驗組遷移細胞數明顯增加，ADAM10干擾實驗組遷移細胞數明顯降低(P<0.05)。侵襲實驗中，對照組、ADAM10干擾實驗組、MiR-140-5p下調組以及MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染組的遷移細胞數分別為：105.910±9.446、85.444±5.139、185.561±19.569、139.665±7.139，MiR-140-5p下調實驗組遷移細胞數明顯增加，ADAM10干擾實驗組遷移細胞數明顯降低(P<0.05)。而MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染實驗組發(fā)現，ADAM10下調可逆轉MiR-140-5p對FaDu細胞遷移和侵襲的促進作用。見圖4～圖6。

圖4 上調MiR-140-5p對ADAM10表達的影響

1.對照組；2.MiR-140-5p下調組；3.ADAM10干擾組；4.MiR-140-5p下調和si-ADAM10共轉染組圖5 下調MiR-140-5p對ADAM10表達的影響

圖6 Transwell實驗觀察下調MiR-140-5p表達和下調ADAM10對FaDu細胞遷移和侵襲力的影響(×100)

3 討 論

異常表達的miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用，其中MiR-140-5p在多種腫瘤中發(fā)揮抑癌基因的角色，例如：MiR-140-5p在肝癌組織中明顯下調，上調其表達，可明顯降低腫瘤的轉移和侵襲力〔4〕。但目前關于MiR-140-5p對下咽癌發(fā)生、發(fā)展的調控機制仍未見系統(tǒng)報道。本次研究顯示，MiR-140-5p在下咽癌組織中表達水平明顯低于癌旁組織，并與腫瘤T分期和淋巴結轉移分期之間存在明顯相關性。通過轉染技術上調MiR-140-5p在FaDu細胞中表達后，細胞的遷移、侵襲力明顯降低；而上調其表達，細胞遷移、侵襲力明顯增加。

ADAMs家族是Ⅰ型跨膜蛋白家族，廣泛參與腫瘤的額病理過程〔5〕。ADAM10作為ADAMs家族一員，在多種腫瘤組織中高表達。研究顯示，ADAM10在非小細胞肺癌組織中高表達，干擾ADAM10表達可降低其遷移和侵襲能力〔6〕。說明ADAM10在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。本次研究顯示，ADAM10在下咽癌組織中高表達，但其表達水平與臨床病理特征無明顯關聯(lián)，可能與本次研究樣本量較少有關，需進一步探討。下調FaDu細胞中ADAM10表達水平可明顯降低FaDu細胞的遷移、侵襲力，提示ADAM10作為致癌基因可影響下咽癌的發(fā)生、發(fā)展。

miRNA可調控40%以上的蛋白編碼基因，探尋靶基因有助于明確miRNA在腫瘤轉移、侵襲中的作用機制。依據miRNA配對原則使用靶基因數據庫預測MiR-140-5p的靶基因，發(fā)現ADAM10與腫瘤組織惡性程度明顯相關?；谏鲜鲅芯拷Y論，本次研究中將ADAM10作為MiR-140-5p的靶基因進一步探討對老年咽癌的作用。結果顯示，上調FaDu細胞中的MiR-140-5p表達，ADAM10蛋白表達明顯降低；下調MiR-140-5p表達后ADAM10蛋白表達明顯增加；同時下調ADAM10表達可有效逆轉MiR-140-5p下調對下咽癌細胞遷移、侵襲能力的增強作用。提示MiR-140-5p可通過下調致癌基因ADAM10來抑制下咽癌細胞的遷移、侵襲力。

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〔2016-05-11修回〕

(編輯 袁左鳴)

陳 彤(1986-)，男，副主任醫(yī)師，主要從事耳鼻咽喉頭頸外科臨床研究。

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A

1005-9202(2017)07-1588-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.010