甘佳樂(lè) 劉敬霞 黑長(zhǎng)春 劉 超 劉抒雯

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004)

回藥扎里奴思方對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞模型大鼠白細(xì)胞介素-6、-2含量的影響

甘佳樂(lè) 劉敬霞 黑長(zhǎng)春 劉 超 劉抒雯

(寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004)

目的 探討回藥扎里奴思方對(duì)腦缺血急性期再灌注損傷后大鼠腦內(nèi)白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-2含量的影響。方法 將SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、尼莫地平組、扎里奴思方組，除假手術(shù)組外其余各組均采用線栓法大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)復(fù)制腦缺血再灌注模型，用HE染色觀察腦組織形態(tài)學(xué)改變，用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)及免疫組化法測(cè)定各組大鼠腦組織中IL-6和IL-2的表達(dá)，并對(duì)各組進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。結(jié)果 假手術(shù)組腦內(nèi)有少量IL-6和IL-2；腦缺血再灌注后IL-6和IL-2的表達(dá)開(kāi)始上升，IL-6在3 d時(shí)達(dá)到高峰；與模型組比較，尼莫地平組與扎里奴思方組均能顯著降低大鼠神經(jīng)功能評(píng)分，改善再灌注損傷后大鼠腦組織病理形態(tài)，減少IL-6和IL-2的表達(dá)(P<0.05)；在7 d時(shí)，扎里奴思方的作用較尼莫地平顯著(P<0.05)。結(jié)論 扎里奴思方可明顯抑制大鼠急性期腦缺血再灌注損傷后腦組織中IL-6和IL-2的含量，且與用藥時(shí)間呈正相關(guān)，這可能是其腦保護(hù)作用機(jī)制之一。

腦缺血；白細(xì)胞介素-6；白細(xì)胞介素-2

回族醫(yī)藥在防治腦系疾病方面具有完善的理論體系和獨(dú)特的治療方藥。扎里奴思方出自《回回藥方》殘卷12“眾風(fēng)門”〔1〕，原文記載其具有“取腦中濁物風(fēng)痰和開(kāi)中風(fēng)神昏竅閉”的作用，用于治療中風(fēng)“半身不遂、口眼歪斜”〔2〕等癥。團(tuán)隊(duì)前期的研究表明，扎里奴思方可改善缺血半暗帶血流，下調(diào)神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)水平，調(diào)節(jié)血腦屏障，抑制血小板黏附和聚集，調(diào)節(jié)血脂代謝及氧自由基〔3～7〕。本實(shí)驗(yàn)以大鼠大腦中動(dòng)脈閉塞(MCAO)的方法建立局灶性腦缺血再灌注損傷模型，檢測(cè)再灌注損傷后大鼠腦內(nèi)的白細(xì)胞介素(IL)-6和IL-2含量，以期進(jìn)一步探討扎里奴思方治療腦缺血疾病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 雄性Sprague Dawley(SD)大鼠150只，SPF級(jí)，3～4月齡，體重約(300±50)g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)2013-0001。所有大鼠在同一房間中飼養(yǎng)，房間溫度控制在(25±1)℃，濕度(50±10)%，光暗周期12 h/12 h，自由進(jìn)食和飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及主要儀器 扎里奴思方(出自《回回藥方》)組成：安息香3 g，干祖伐即懷牛膝24 g，法里公即茴香12 g，兀沙吉即乳香12 g，法忒刺撒里榮即當(dāng)歸12 g，木里葉即沒(méi)藥12 g，撒法郎即番紅花12 g，蘆薈12 g，伯思八牙即水龍骨12 g，膃肭臍即海狗腎12 g，阿夫忒蒙即菟絲子12 g，石菖蒲12 g，肉桂12 g，牡丹皮12 g，由寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬回醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院制劑室提供，方中所用生藥材按組方劑量配比，煎煮過(guò)濾后濃縮至含生藥3.0 g/ml，4℃保存?zhèn)溆?，用前稀釋至生藥材含?.5 g/ml；尼莫地平片(拜耳醫(yī)藥保健有限公司提供，30 mg/片，批號(hào)：H20003010)，用蒸餾水配成(1.08 g/L)混懸液。兔抗鼠IL-6抗體，兔抗鼠IL-2抗體，羊抗兔IgG及免疫組化試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購(gòu)自北京誠(chéng)林生物技術(shù)有限公司，水合氯醛、多聚甲醛購(gòu)自天津市元立化工有限公司，雙氧水購(gòu)自蘭州潤(rùn)康愛(ài)醫(yī)療保健品有限公司。顯微鏡：日本奧林巴斯；石蠟切片機(jī)：德國(guó)萊卡RM2015。

1.3 分組與給藥 SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組10只，模型組、尼莫地平組、扎里奴思方組1、3、7 d每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各15只。所有動(dòng)物于造模清醒后2 h按相應(yīng)分組灌胃給藥，給藥劑量按動(dòng)物與人體表面積折算：扎里奴思方1.5 g/ml、尼莫地平1.08 mg/ml，模型組和假手術(shù)組以生理鹽水代替，1次/d。

1.4 動(dòng)物模型的制備 采用改進(jìn)的線栓法制備MCAO模型。用10%的水合氯醛腹腔注射麻醉后大鼠仰臥固定于手術(shù)板，頸前正中切開(kāi)，分離左側(cè)頸總、頸內(nèi)及頸外動(dòng)脈，頸總近端及遠(yuǎn)心端掛線，于頸總動(dòng)脈分叉處剪一約0.2 mm小口，緩慢將栓線穿入經(jīng)小口由頸總進(jìn)入頸內(nèi)，直到感覺(jué)輕微阻力，進(jìn)線長(zhǎng)度18～20 mm，確定無(wú)出血后縫合皮膚。2 h后稍抽出栓線使局部血流恢復(fù)。MCAO模型制作成功的標(biāo)準(zhǔn)為大鼠蘇醒后表現(xiàn)為提尾離地時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲；在地板爬行時(shí)向右側(cè)劃圈；站立時(shí)向右側(cè)傾倒。假手術(shù)組只分離頸總、頸內(nèi)外動(dòng)脈，不穿入栓線。手術(shù)過(guò)程中保持大鼠肛溫(37.0±0.5)℃，室溫(26.0±1)℃。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分 大鼠清醒后進(jìn)行Zea-Longa評(píng)分。0分為無(wú)神經(jīng)功能缺損癥狀，正常進(jìn)食、飲水；1分為將尾巴提起后右前肢屈曲；2分為向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分為向右側(cè)傾倒；4分為右側(cè)偏癱，不能自發(fā)行走，意識(shí)喪失。評(píng)分≥2分表明模型成功，<2分則予以排除。各組動(dòng)物于處死前2 h進(jìn)行評(píng)分。

1.6 取材及標(biāo)本處理 造模成功的大鼠按不同時(shí)間點(diǎn)用10%水合氯醛麻醉后，于冰盤(pán)上迅速斷頭取腦，取左側(cè)大腦，用電子秤稱重后放入玻璃勻漿器，加入10倍于腦組織重量的生理鹽水勻漿，將勻漿3 000 r/min，15 min離心后取上清置4℃冰箱待測(cè)。另一半大鼠用4%多聚甲醛于心尖灌注固定，取出大腦常規(guī)脫水，石蠟包埋后用冰凍切片機(jī)冠狀連續(xù)切片，片厚5 μm，分別進(jìn)行HE染色病理觀察及免疫組化檢測(cè)。

1.7 指標(biāo)檢測(cè) 采用雙抗體夾心ELISA檢測(cè)大腦勻漿中IL-6與IL-2含量。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。免疫組化采用SABC法，AEC顯色，切片脫蠟后放入1%甲醇雙氧水，室溫10 min，蒸餾水洗1次，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液在微波爐內(nèi)微波輻射10 min；待修復(fù)液降至室溫后，PBS洗3次×5 min；切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體，不洗。切片上滴加一抗IL-6濃度為1∶150，IL-2濃度為1∶300，4℃過(guò)夜，PBS洗3次×5 min。滴加生物素化二抗(IgG)，37℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(S-A/HRP)，37℃20 min，0.1 mol/L PBS洗3次×5 min；DAB顯色，充分水洗；蘇木素復(fù)染，常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。PBS代替一抗作為對(duì)照。顯微鏡下觀察，陽(yáng)性細(xì)胞呈棕黃色，每只大鼠取海馬部位切片5張，置于400倍物鏡下，每張切片隨機(jī)選5個(gè)不同視野，用多功能真彩色細(xì)胞圖像分析管理系統(tǒng)計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞，取平均值。HE染色后，光鏡下觀察大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)變化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 扎里奴思方對(duì)腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能評(píng)分的影響 用藥后1、3、7 d，扎里奴思方組與尼莫地平組神經(jīng)功能評(píng)分均顯著低于模型組(P<0.05)。扎里奴思方組與尼莫地平組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。各組3 d、7 d與1 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

組別1d3d7d假手術(shù)組-0.00±0.00-模型組2.67±1.213.00±0.891.83±0.75尼莫地平組1.67±0.511)1.50±0.541)2)1.33±0.511)2)扎里奴思方組1.5±0.541)1.17±0.401)2)1.05±0.331)2)

與模型組比較：1)P<0.05；與1 d組比較：2)P<0.05

圖1 扎里奴思方對(duì)大鼠缺血腦組織病理學(xué)改變的影響(HE，×400)

2.2 扎里奴思方對(duì)腦缺血再灌注大鼠腦組織形態(tài)學(xué)的影響 見(jiàn)圖1。HE染色結(jié)果顯示，術(shù)后7 d假手術(shù)組海馬組織結(jié)構(gòu)排列整齊，胞體、核仁清晰，染色均勻，神經(jīng)元細(xì)胞排列緊密。模型組海馬組織細(xì)胞排列紊亂，結(jié)構(gòu)松散，間質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大小不等的空泡，部分神經(jīng)細(xì)胞核固縮、深染，無(wú)核仁，神經(jīng)元細(xì)胞減少，呈現(xiàn)凋亡特征，細(xì)胞皺縮，界限不清；大部分細(xì)胞有退行性改變，神經(jīng)細(xì)胞呈嗜酸性。扎里奴思方組和尼莫地平組神經(jīng)細(xì)胞排列略紊亂，仍可見(jiàn)細(xì)胞固縮，其周邊可見(jiàn)神經(jīng)細(xì)胞輕度腫脹，胞質(zhì)、胞膜、胞核尚能分清，程度較模型組明顯減輕，扎里奴思方組較尼莫地平組改善明顯。

2.3 扎里奴思方對(duì)腦缺血再灌注大鼠IL-6及IL-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的影響 腦缺血1 d，IL-6及IL-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)即開(kāi)始增加，IL-6在3 d達(dá)高峰，7 d有所下降。模型組IL-6及IL-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與假手術(shù)組比較差異顯著(P<0.05)；扎里奴思方組各時(shí)間點(diǎn)與模型組比較差異顯著(P<0.05)，IL-6陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與尼莫地平組比較在1、3 d差異顯著，IL-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)扎里奴思方組明顯低于尼莫地平組(P<0.05)。見(jiàn)表2，圖2，圖3。

組別IL-61d3d7dIL-21d3d7d假手術(shù)組8.6±0.56.2±1.15.3±0.69.7±1.58.3±1.27.4±1.8模型組29.6±1.51)36.3±3.81)28.3±4.11)37.6±1.41)34.3±1.51)32.6±2.51)尼莫地平組26.0±3.01)2)23.7±1.51)2)18.3±2.51)2)33.8±2.61)2)27.6±1.41)2)24.4±2.61)2)扎里奴思方組18.0±2.01)2)3)15.8±2.31)2)3)14.3±1.51)2)22.7±2.51)2)3)21.8±3.31)2)3)17.6±2.51)2)3)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05；與尼莫地平組比較：3)P<0.05

圖2 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元IL-2表達(dá)(DAB，×400)

圖3 各組大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元IL-6表達(dá)(DAB，×400)

2.4 扎里奴思方對(duì)缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織中IL-6含量的影響 與假手術(shù)組比較，模型組1、3、7 d后腦組織中IL-6含量顯著升高(P<0.01)。與模型組比較，尼莫地平組和扎里奴思方可降低缺血再灌注1、3、7 d IL-6的水平(P<0.01)。尼莫地平組和扎里奴思方組IL-6含量隨著缺血再灌注后時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，扎里奴思方組下降更為明顯(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.5 扎里奴思方對(duì)缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織中IL-2含量的影響 IL-2在假手術(shù)組中含量最低(P<0.01)；與模型組比較，尼莫地平組、扎里奴思方組可顯著降低缺血再灌注1、3、7 d組IL-2水平(P<0.01)；與尼莫地平組比較，扎里奴思方組的IL-2含量均降低(P<0.05)，其中7 d組降低更為明顯(P<0.01)，見(jiàn)表3。

組別IL-61d3d7dIL-21d3d7d假手術(shù)組66.48±6.4973.23±2.3370.51±3.36149.82±15.68150.02±6.09135.62±2.32模型組200.65±3.811)215.47±4.581)212.40±6.591)448.06±4.451)485.46±7.921)486.84±9.471)尼莫地平組174.5±14.132)172.62±4.392)163.45±2.092)399.5±11.321)2)368.80±7.681)2)357.1±11.481)2)扎里奴思方組108.76±7.432)3)103.43±6.542)3)85.87±5.592)3)252.7±10.631)2)3)200.52±9.981)2)3)175.18±9.151)2)3)4)

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01；與尼莫地平組比較：3)P<0.05，4)P<0.01

3 討 論

腦缺血再灌注損傷后大腦會(huì)產(chǎn)生一系列病理變化包括自由基生成增多，神經(jīng)細(xì)胞凋亡，Ca2+失衡，炎癥反應(yīng)等。IL-6是一種雙糖蛋白鏈組成的多肽，具有廣泛的生物活性，參與人體多種重要病理生理活動(dòng)，在機(jī)體的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。正常情況下，IL-6在腦組織的表達(dá)量較少，腦缺血后IL-6可通過(guò)A2b受體的作用使其表達(dá)量顯著增加。研究發(fā)現(xiàn)IL-6在炎癥反應(yīng)的早期能誘導(dǎo)大量白細(xì)胞聚集和其他炎性因子的釋放，從而引起“炎癥瀑布”樣反應(yīng)，加重腦損傷〔8〕。Loddick等〔9〕和Legos等〔10〕在對(duì)腦缺血大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)IL-6在病側(cè)腦缺血組織中含量增加，明顯多于對(duì)側(cè)正常腦組織，缺血后24 h達(dá)到高峰。Wilan等〔11〕研究表明，腦脊液與血清中的IL-6是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因子，且腦梗死體積越大，血清中IL-6水平越高。IL-2是CD+T淋巴細(xì)胞中的Th1細(xì)胞產(chǎn)生的一種淋巴因子，IL-2不僅可以刺激活化T細(xì)胞分泌淋巴因子，參與機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用，而且可以增強(qiáng)T淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞的細(xì)胞毒性。研究發(fā)現(xiàn)IL-2可抑制降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)的合成和釋放，而CGRP能拮抗ET 從而引起腦血流量的減少〔12〕。因此，IL-2是缺血性腦卒中發(fā)生發(fā)展過(guò)程的關(guān)鍵因素之一。朱士文等〔13〕的研究也表明腦血管病急性期IL-2與血腦屏障的損傷有關(guān)。李琪〔14〕在研究中也發(fā)現(xiàn)腦梗死急性期外周血中IL-6、IL-2的含量比正常人明顯升高，這也與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。所以，減少或抑制IL-6、IL-2的生成對(duì)減輕腦缺血再灌注損傷具有重要的研究意義。

扎里奴思方由具有芳香開(kāi)竅的安息香、茴香、乳香、沒(méi)藥、石菖蒲，具有補(bǔ)腎益髓的海狗腎、懷牛膝、菟絲子，具有活血化痰的紅花、當(dāng)歸、蘆薈等藥物組成，與中風(fēng)急性期風(fēng)、痰、瘀的病理特點(diǎn)正好相符，且對(duì)于恢復(fù)期及后遺癥期氣虛血瘀、肝腎陰虛的本虛標(biāo)實(shí)之證亦有一定的功效。本研究表明，扎里奴思方可抑制但不能阻斷IL-6、IL-2的產(chǎn)生，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。扎里奴思方在缺血再灌注過(guò)程中的腦保護(hù)作用可能是通過(guò)降低腦組織中IL-6及IL-2的含量來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

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〔2016-10-13修回〕

(編輯 李相軍)

Effect of Hui medicine Zhali Nusi Fang on IL-6 and IL-2 in MCAO rats

GAN Jia-Le, LIU Jing-Xia, HEI Chang-Chun,etal.

Ningxia Medical University, Yinchuan 750004, Ningxia, China

Objective To investigate the Hui medicine Zhali Nusi Fang on acute cerebral ischemia reperfusion of rat brain IL-6 and IL-2 after injury.Methods SD rats were randomized into sham, model, nimodipine, Zhali Nusi Fang groups.Except the sham group, rats in the other groups were used thread occlusion (MCAO) to duplicate the cerebral ischemia reperfusion model.Morphological changes of brain tissue were observed by HE staining, enzyme linked immuno-labeling assay (ELISA) and immunohistochemistry were used to determine the expressions of IL-6 and IL-2 in the brain tissue of rats, neurological score of rat was detected.Results In sham group, there were few expressions of IL-2 and IL-6 in the brain, the expressions of IL-2 and IL-6 began to rise after cerebral ischemia reperfusion, IL-6 reached the peak at day 3.Compared with model group, nimodipine and Zhali Nusi Fang could significantly reduce rat neural function score, improve brain tissue pathological changes after ischemia reperfusion injury, reduce the expressions of IL-2 and IL-6(P<0.05); at day 7, the effect of Zhali Nusi Fang was significantly more obvious than that of nimodipine(P<0.05).Conclusions IL-6 and IL-2 in the brain of rats with acute cerebral ischemia reperfusion injury could be obviously inhibited by Zhali Nusi Fang and it is positively correlated with the time of administration, which may be one of the mechanisms of cerebral protection.

Cerebral ischemia;IL-6;IL-2

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃“病證結(jié)合”(SQ2013SF12E02181)

劉敬霞(1970-)，女，博士后，教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究。

甘佳樂(lè)(1990-)，女，在讀碩士，主要從事中醫(yī)藥防治老年病研究

R743

A

1005-9202(2017)07-1576-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.07.006