安國亮 李小麗 王 炎 連西濛 朱鐘慧 郭彩霞 吳惠慧 田 琳

(首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系 首都醫(yī)科大學(xué)環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

·基礎(chǔ)研究 ·

Micro CT對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞拮抗矽肺大鼠肺纖維化的效果評價(jià)

安國亮 李小麗 王 炎 連西濛 朱鐘慧 郭彩霞 吳惠慧 田 琳*

(首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院勞動(dòng)衛(wèi)生與環(huán)境衛(wèi)生學(xué)系 首都醫(yī)科大學(xué)環(huán)境毒理學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100069)

目的 探討Micro CT能否評價(jià)大鼠矽肺纖維化程度并反映骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)拮抗肺纖維化的效果。方法 Wistar雌性大鼠60只，采用數(shù)字表法隨機(jī)分為對照組、石英組和BMSCs處理組，每組20只。石英組和BMSCs處理組氣管內(nèi)滴注石英混懸液(50 mg/mL)。染塵后，BMSCs處理組尾靜脈注射BMSCs，其他組尾靜脈注射0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。染塵后不同時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行大鼠肺部Micro CT平掃，取肺組織觀察病理改變。結(jié)果 石英組與對照組相比，第7、15、30 d病理HE染色分別可見炎細(xì)胞浸潤，散在的矽結(jié)節(jié)和矽結(jié)節(jié)的融合；Masson染色可見在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，石英組的膠原纖維量均高于對照組；CT分別可見肺門斑塊狀密度增高影，點(diǎn)狀和片狀高密度影。BMSCs處理組與石英組相比，第15、30 d病理和CT均顯示矽肺不同程度減輕。結(jié)論 Micro CT能夠評價(jià)15 d和30 d時(shí)矽肺纖維化程度并反映BMSCs對肺纖維化的拮抗作用。

Micro CT；矽肺；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

矽肺是由于長期吸入游離二氧化硅粉塵而引起的以肺組織彌漫性纖維化為主的全身性疾病[1]，由于發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今尚無有效的治療方法。這使得人們亟需找到切實(shí)有效的方法，從而延緩、阻遏石英引起的肺組織纖維化。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種來源于骨髓的具有多項(xiàng)分化潛能的成體干細(xì)胞[2]，已有研究[3-5]表明，給予外源性BMSCs可減輕肝、腎、肺等多種器官的纖維化，Micro CT作為一種非損傷工具，可以動(dòng)態(tài)觀察同一動(dòng)物不同時(shí)間肺組織的病理變化。本研究中本課題組觀察BMSCs對石英致大鼠肺組織纖維化模型的影響，定期進(jìn)行全肺CT掃描和矽肺的病理比較，探討Micro CT能否反映矽肺大鼠肺纖維化程度和BMSCs拮抗纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級Wistar雌性大鼠由首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號：SCXK(京) 2012-0001，體質(zhì)量200 g左右。

1.2 儀器和試劑

Micro CT[Inveon,西門子(中國)有限公司]，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo公司，美國)，光學(xué)顯微鏡(Olympus公司，日本)，熒光倒置相差顯微鏡(Olympus公司，日本)，流式細(xì)胞儀(BD公司，美國)；結(jié)晶型二氧化硅(Sigma公司，美國)，磷酸鹽緩沖液(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(MP公司，美國)，α-MEM培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)，胰蛋白酶、青鏈霉素(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 BMSCs分離、培養(yǎng)與鑒定

采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)BMSCs。將沖洗出的骨髓細(xì)胞混懸液移至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)。通過換液逐漸去除未貼壁細(xì)胞。待細(xì)胞生長至80%至90%底面積后開始傳代，傳至第3代經(jīng)流式鑒定CD抗原表達(dá)情況后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 動(dòng)物分組和處理

采用數(shù)字表法將60只雌性大鼠隨機(jī)分為對照組、石英組和BMSCs處理組(簡稱BMSCs組)，每組20只。采用氣管滴注法建立動(dòng)物模型，無水乙醚進(jìn)行氣體麻醉，石英組和BMSCs組一次性氣管內(nèi)滴注質(zhì)量濃度為50 mg/mL的石英混懸液1 mL，對照組一次性氣管內(nèi)滴注等量0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。分別在24 h和96 h后，BMSCs組尾靜脈注射含有2×106個(gè)BMSCs的細(xì)胞混懸液1 mL，對照組和石英組分別注射等量0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液。于造模后7、15、30 d進(jìn)行CT觀察，而后股動(dòng)脈放血處死大鼠，統(tǒng)一取肺組織做病理HE染色和Masson染色。

1.3.3 肺組織Micro CT觀察

大鼠經(jīng)異氟烷氣體麻醉后，水平固定在Micro CT配套的動(dòng)物支架上，保證肺部處在掃描范圍內(nèi)，分別在3個(gè)時(shí)間點(diǎn)(7、15、30 d)進(jìn)行掃描。具體參數(shù)如下：掃描分辨率78 μm，曝光時(shí)間2 000 ms，電壓80 kV，電流500 μA，掃描角度360°；圖形分辨率78 μm，掃描時(shí)間25 min。掃描后用cobra軟件進(jìn)行三維重建，觀察肺組織。

1.3.4 肺組織病理學(xué)觀察

取每組大鼠左肺，經(jīng)固定、浸蠟、包埋等過程，5μm連續(xù)切片，HE染色和Masson染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織的病理學(xué)變化。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 BMSCs鑒定

原代BMSCs培養(yǎng)，細(xì)胞融合度在80%至90%時(shí)進(jìn)行傳代，傳代后的細(xì)胞生長速度加快，形態(tài)為梭形或紡錘形，旋渦狀生長，如圖1 A(100×)和1 B(200×)。經(jīng)流式鑒定，細(xì)胞CD90陽性率為93.3%，CD45 陽性率為6.8%。符合BMSCs表面標(biāo)志物的特點(diǎn)，表明實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞為BMSCs，如圖2、3。

2.2 肺組織病理學(xué)觀察

在不同時(shí)間點(diǎn)，對照組肺泡結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔大小均勻，清晰可見，支氣管上皮完好，黏膜光滑，無明顯炎性滲出物。與對照組相比，石英組在7 d時(shí)，肺泡間隔增厚，肺泡腔內(nèi)可見矽塵，大量的巨噬細(xì)胞，塵細(xì)胞，肺上皮細(xì)胞及少量的中性粒白細(xì)胞，形成巨噬細(xì)胞肺泡炎，膠原纖維的量增高(P<0.01)。15 d時(shí)，肺泡壁增厚，肺組織可見典型的細(xì)胞結(jié)節(jié)，肺泡腔內(nèi)可見石英顆粒和炎性滲出，膠原纖維的量明顯增多(P<0.01)。30 d時(shí)，可見細(xì)胞結(jié)節(jié)融合，周圍的肺泡結(jié)構(gòu)大部分破壞，殘留肺泡代償性擴(kuò)張，肺泡壁增厚，淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡腔內(nèi)有泡沫細(xì)胞及其崩解物，大量的膠原纖維聚集，形成廣泛的纖維化(P<0.01)。與石英組相比，BMSCs組在第7天時(shí)肺泡間隔稍增厚，肺泡內(nèi)有少量滲出，膠原纖維的量有所下降(P<0.05)。15 d時(shí)，可見結(jié)節(jié)內(nèi)大量的巨噬細(xì)胞空泡化，成纖維細(xì)胞有所減少(P<0.01)；30 d時(shí)，可見松散的細(xì)胞結(jié)節(jié)以及大量的泡沫細(xì)胞，肺纖維化程度有所減輕(P<0.01)。詳見圖4～6。

2.3 肺組織Micro CT觀察

在不同時(shí)間點(diǎn)，對照組雙側(cè)肺實(shí)質(zhì)密度均勻，肺紋理清晰，可見到支氣管和血管所形成的紋理影，走行自然。石英組7 d時(shí)雙肺肺門有斑塊狀密度增高影，出現(xiàn)直徑<5 mm的微結(jié)節(jié)，邊界清晰，部分可見融合，肺紋理不清晰；15 d時(shí)，Micro CT顯示在7 d的基礎(chǔ)上，肺內(nèi)紋理模糊，肺門周圍出現(xiàn)圓形或類圓形密度增高影；30 d時(shí)，Micro CT顯示肺紋理不見，矽結(jié)節(jié)融合，出現(xiàn)片狀高密度影，胸膜增厚，伴有部分淋巴結(jié)鈣化。BMSCs處理組7 d時(shí)與石英組7 d時(shí)大體相同；15 d時(shí)，肺紋理不清晰，可見點(diǎn)狀散在的高密度影；30 d時(shí)，可見網(wǎng)狀高密度影，淋巴結(jié)鈣化不明顯，肺紋理相對可見，詳見圖7。

圖2 PE CD45表面抗原流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

圖3 PE CD90表面抗原流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果

圖4 各組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織的形態(tài)學(xué)觀察(HE染色)

圖5 各組不同時(shí)間點(diǎn)肺組織的形態(tài)學(xué)觀察(Masson染色)

圖6 Masson染色膠原纖維陽性所占百分比

3 討論

矽肺是我國危害最嚴(yán)重的職業(yè)病，作業(yè)工人長期持續(xù)吸入游離二氧化硅粉塵后，在一系列炎性因子和纖維化因子的刺激下，肺內(nèi)發(fā)生慢性炎性反應(yīng)，成纖維細(xì)胞增生，進(jìn)而發(fā)生肺組織纖維化[6]。近年來，矽肺的危害已得到全世界的公認(rèn)，尤其該病呈進(jìn)行性發(fā)展，一旦發(fā)生則很難治愈，嚴(yán)重影響病人身體健康和生活質(zhì)量，同時(shí)給家庭和社會(huì)帶來巨大的負(fù)擔(dān)[7]。充分正確認(rèn)識矽結(jié)節(jié)及纖維化的影像特征，包括CT影像學(xué)表現(xiàn)，可以做到實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測，早發(fā)現(xiàn)、早診斷[8-9]。

圖7 各組不同時(shí)間肺組織點(diǎn)的Micro CT掃描結(jié)果

研究[10]表明，給予外源性BMSCs對急性肺損傷和慢性肺疾病有保護(hù)作用，BMSCs對于博來霉素、野百合堿和脂多糖引起的肺組織纖維化有一定治療作用。進(jìn)一步研究[11]顯示將BMSCs移植到由博萊霉素誘導(dǎo)的肺纖維化大鼠模型中，微環(huán)境的損傷使BMSCs靶向性遷移到受損部位來修復(fù)受損的肺組織，本次研究探討B(tài)MSCs是否對石英所致的大鼠肺纖維化有抑制作用。

盡管病理能夠反映動(dòng)物矽肺纖維化的程度，但不能實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察完整的矽肺纖維化進(jìn)展過程，Micro CT作為一種非損傷工具，可以動(dòng)態(tài)觀察同一動(dòng)物不同時(shí)間肺組織的病理變化，使研究者能夠更全面的掌握矽肺纖維化的動(dòng)態(tài)過程以及藥物拮抗肺纖維化的效果。此外，用Micro CT進(jìn)行矽肺檢查，也顯示出在小陰影、大陰影上檢出的優(yōu)越性[12]。

本研究表明，從染塵后7 d到30 d，石英組的病理結(jié)果分別出現(xiàn)了炎性反應(yīng)，矽肺結(jié)節(jié)和部分矽肺結(jié)節(jié)的融合，Masson染色的結(jié)果呈現(xiàn)出膠原纖維逐漸增高的趨勢，與HE染色結(jié)果一致；Micro CT結(jié)果分別顯示雙肺肺門斑塊狀密度增高影，小圓形結(jié)節(jié)狀高密度影和片狀高密度影。提示Micro CT結(jié)果和病理結(jié)果一致，因此Micro CT可以活體實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)評價(jià)矽肺纖維化程度。BMSCs組與石英組相比，7 d時(shí)，病理結(jié)果表明BMSCs能夠減輕炎性反應(yīng)，膠原纖維含量有所降低，而Micro CT結(jié)果沒有顯現(xiàn)。15 d和30 d時(shí)，病理HE染色結(jié)果分別顯示，矽結(jié)節(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞空泡化和松散的細(xì)胞結(jié)節(jié)，Masson染色結(jié)果也呈現(xiàn)出膠原纖維減少的趨勢；Micro CT結(jié)果分別顯示點(diǎn)狀散在高密度影和網(wǎng)狀高密度影。提示BMSCs減輕了石英所引起的肺組織纖維化，而Micro CT能夠反映BMSCs拮抗大鼠矽肺纖維化的效果。

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編輯 孫超淵

Assessment of antagonistic effect of bone marrow mesenchymal stem cells on pulmonary fibrosis in silicosis rat model by Micro CT

An Guoliang，Li Xiaoli，Wang Yan，Lian Ximeng，Zhu Zhonghui，Guo Caixia，Wu Huihui，Tian Lin*

(DepartmentofOccupationalandEnvironmentalHealth,SchoolofPublicHealth,CapitalMedicalUniversity,BeijingKeyLaboratoryofEnvironmentalToxicology，CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Objective To explore Micro CT is able to evaluate pulmonary fibrosis and reflect antagonistic effect of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) in silicosis rat model.Methods Sixty Wistar female rats were randomly divided into three groups,n=20. Silica group and BMSCs treated group rats were intratracheally given silica suspension (50 mg/mL).After silica instillation, BMSCs treated group rats were injected BMSCs by caudal vein. Other group rats were injected saline, Respectively, rat lung received computed tomography (CT) scan after silica instillation. The rat lung was fixed and stained for pathology observation after rats were sacrificed. Results Compared with the control group, at 7, 15, 30 day, silica group show that inflammatory cell infiltration, scattered silicon nodules and fused silicon nodules,respectively by pathological section HE staining.Masson staining shows that collagen fiber content was higher than those in the control group at each time point.And shadow of heighten patchy density in pulmonary hilar, punctuate with high density and high density patching shadows were observed by CT. Compared with the silica group,BMSCs treated group reveal that silicon nodules decreased pathologically and CT indicate that high density area was smaller at the 15, 30 day. Conclusion At the 15, 30 day, Micro CT is able to evaluate the degree of pulmonary fibrosis in silicosis and reflect antagonistic effect of BMSCs in silicosis rat model.

Micro CT; silicosis; bone marrow mesenchymal stem cells

國家自然科學(xué)基金(81472958)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81472958).

時(shí)間：2017-04-13 20∶04

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.R.20170413.2004.050.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.02.017]

R13

2016-09-23)

*Corresponding author， E-mail：tianlin@ccmu.edu.cn