袁長春，莫健新，袁柳嬌，余如鳳，劉 倩，鐘軍弟，劉鍇棟

(1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048； 2.廣州基迪奧生物科技有限公司，廣東 廣州 510006)

重金屬脅迫下白骨壤數(shù)字基因表達(dá)譜分析

袁長春1*，莫健新1，袁柳嬌1，余如鳳1，劉 倩2，鐘軍弟1，劉鍇棟1*

(1.嶺南師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣東 湛江 524048； 2.廣州基迪奧生物科技有限公司，廣東 廣州 510006)

[目的]從轉(zhuǎn)錄組水平研究重金屬污水脅迫處理下白骨壤的基因表達(dá)變化，以揭示白骨壤響應(yīng)重金屬污染脅迫的機(jī)制。[方法]采用基于高通量測序的數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)技術(shù)對重金屬污水脅迫處理組和對照組白骨壤材料進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析。[結(jié)果]與對照組相比，重金屬處理下白骨壤共有10 459個差異表達(dá)基因，其中，8 685個表達(dá)量上升，1 774個表達(dá)量下降。MeV聚類表明：大部分基因在重金屬處理樣本中的表達(dá)量受到極大的誘導(dǎo)。GO功能注釋發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)基因主要定位于葉綠體以及細(xì)胞內(nèi)各種膜結(jié)構(gòu)，參與“細(xì)胞代謝”、“細(xì)胞組分的組合和生物合成”、“對刺激的響應(yīng)”等過程。KEGG 代謝通路分析顯示，差異表達(dá)基因分布于126條Pathways，涉及“核糖體”、“光合作用”、“乙醛酸鹽代謝”、“丙酮酸代謝”等途徑。重金屬脅迫還促進(jìn)萜類、黃酮類化合物生物合成的關(guān)鍵酶基因(牻牛兒基焦磷酸合酶(0009238)、黃酮醇合成酶(0001833))的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)白骨壤有效成分的積累；顯著誘導(dǎo)細(xì)胞分裂素水解酶編碼基因CKX7(0057124)、油菜素內(nèi)脂信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分基因BSK(0043741)等的表達(dá)，進(jìn)而提高白骨壤對重金屬脅迫的適應(yīng)能力。此外，轉(zhuǎn)錄因子分析發(fā)現(xiàn)，bHLH、NAC、MYB-related和WRKY在重金屬脅迫中發(fā)揮重要作用。實驗選取8個與環(huán)境刺激響應(yīng)密切相關(guān)的基因，通過qRT-PCR驗證了它們在重金屬污水脅迫處理下的表達(dá)差異，結(jié)果與數(shù)字基因表達(dá)譜分析的結(jié)果較一致，證實了差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)的有效性。[結(jié)論]重金屬處理影響了白骨壤大量的新陳代謝、光合作用、小分子酸合成、激素合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的表達(dá)。

白骨壤；重金屬脅迫；數(shù)字基因表達(dá)譜(DEG)；差異表達(dá)基因；機(jī)制

隨著我國沿海地區(qū)工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展以及城市化區(qū)域的不斷擴(kuò)大，工農(nóng)廢水和生活污水的排放量越來越大。大量污水涌入江河海灣造成了很大的環(huán)境壓力[1]。紅樹濕地系統(tǒng)處在陸地向海洋的過度帶，對各種污染物有很強(qiáng)的吸附能力，具有凈化污水、沉積污染物的能力[2-4];然而，污水排放對紅樹植物的正反影響效應(yīng)存在較大的爭議。一方面，污水排放能為紅樹植物帶來豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)紅樹的生長；另一方面，污水中重金屬污染物的脅迫作用對紅樹植物存在一定的不利影響，減緩紅樹植物的生長發(fā)育。因此，探究紅樹植物響應(yīng)污染脅迫的機(jī)制是當(dāng)前研究的熱點[5]。有研究表明，紅樹植物能夠通過多種途徑應(yīng)對重金屬脅迫,如：根部發(fā)達(dá)的凱氏帶可以防止重金屬離子向地上部分轉(zhuǎn)運；植物體內(nèi)的小分子有機(jī)酸等物質(zhì)可以將重金屬沉淀于細(xì)胞壁或局限于液泡等細(xì)胞器；通過增強(qiáng)植物體自身抗氧化系統(tǒng)活性或促進(jìn)各種抗氧化物質(zhì)合成來清除重金屬脅迫下產(chǎn)生的大量活性氧自由基[6-8];然而，這些研究大多停留在生理層面，從分子層面分析重金屬脅迫處理對紅樹植物生長影響的研究鮮有報道[9-10]。

數(shù)字基因表達(dá)譜(DGE)是一種高效的高通量測序技術(shù)，DEG能用于分析某一物種特定組織在特定條件下基因的表達(dá)情況。通過對差異基因涉及到的生物學(xué)過程進(jìn)行搜索、比較和分析，可預(yù)測基因的表達(dá)模式和蛋白質(zhì)的功能等信息。目前，已有學(xué)者利用該技術(shù)在轉(zhuǎn)錄水平分析了美洲黑楊(PopulusdeltoidesMarsh)、泡泡刺(NitrariasphaerocarpaMaxim.)、花生(ArachishypogaeaLinn.)等植物基因表達(dá)譜[11-13]。如，賴曉娟等[14]通過分析壇紫菜(PyropiahaitanensisRhodophyta)的數(shù)字基因表達(dá)譜，篩選出了256個上調(diào)表達(dá)基因和3 820個下調(diào)表達(dá)基因，證明了高溫脅迫對壇紫菜的生長發(fā)育有一定的抑制作用，但同時也誘導(dǎo)了補救途徑。

作為常見的紅樹林優(yōu)勢樹種白骨壤(Avicenniamarina(Forssk?l) Vierhapper)廣泛分布于陸地向海洋過渡的潮間帶，在我國分布于海南、廣東、廣西等省的濱海地區(qū)。白骨壤能耐受一定濃度的污染脅迫，可在污水污染的潮間帶生長[15]。有研究表明，白骨壤模擬濕地系統(tǒng)可對污水起到很好的凈化效應(yīng)，在栽種白骨壤植物的土壤子系統(tǒng)中，重金屬積累含量顯著降低[16]。進(jìn)一步研究表明，白骨壤正是通過調(diào)控濕地系統(tǒng)中氮、磷的分配、循環(huán)達(dá)到凈化作用[17-18]。周涵韜等[19]通過mRNA差異顯示技術(shù)，分離得到了白骨壤耐鹽相關(guān)cDNA，為揭示白骨壤鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制打下了基礎(chǔ)。本文采用基于高通量測序的數(shù)字基因表達(dá)譜技術(shù)研究污水脅迫處理下白骨壤的基因表達(dá)變化，從分子層面分析白骨壤對重金屬污染脅迫的耐受機(jī)制，為深入研究重金屬污水脅迫對紅樹植物生長的影響機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

Hoagland營養(yǎng)液；人工污水；Trizol試劑盒(TaKaRa, 大連，中國)；瓊脂糖；寡聚(dT)-纖維素；片段化緩沖液(fragmentation buffer)；dNTPs；六堿基隨機(jī)引物；RNase H；DNA polymerase I；QiaQuick PCR試劑盒；EB緩沖液；PrimeScriptTMRT Master Mix (TaKaRa，大連，中國)；SYBR Green supermix；PCR儀型：Bio-Rad CFX96 touchTM。

1.2 白骨壤材料處理和收集

1.3 總RNA提取和基因表達(dá)譜測序

采用Trizol法提取污水脅迫處理組和對照組白骨壤葉片樣品的總RNA，對照和處理各3份生物學(xué)重復(fù)；然后，將對照和處理的各自3份RNA樣品等量混合，由廣州基迪奧公司構(gòu)建測序文庫，采用Illumina HiSeqTM 2000平臺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。

1.4 差異表達(dá)基因的篩選

基因的表達(dá)量由比對到基因表達(dá)區(qū)域序列的readcount頻率來估算，通過edgeR軟件對得到的readcount數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，以篩選差異表達(dá)基因。本實驗差異基因篩選標(biāo)準(zhǔn)為P-value<0.05，|log2Fold Change|>1，其中，F(xiàn)old Change 為污水脅迫處理樣本與對照樣本中各基因表達(dá)量的比值。對于差異表達(dá)基因，其log2Fold Change>0時，認(rèn)為該差異表達(dá)基因是上調(diào)的；反之，若log2Fold Change <0，則認(rèn)為該差異表達(dá)基因是下調(diào)的。

1.5 Gene Ontology (GO) 基因功能注釋和KEGG代謝通路分析

采用GO數(shù)據(jù)庫(http：//www.geneontology.org/)對污水脅迫處理下白骨壤的差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集顯著性分析。采用GOseq方法計算得到一個特定的P-value。一般校正后的P-value≤0.05，表示差異表達(dá)基因在該GO中出現(xiàn)了富集。同時，使用KOBAS(2.0)軟件對差異基因進(jìn)行KEGG 代謝通路富集性分析，當(dāng)FDR(錯誤發(fā)現(xiàn)率)≤0.05時，表示該通路中差異表達(dá)基因富集顯著。

1.6 qRT-PCR驗證

表1 引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 測序質(zhì)量分析

分析白骨壤數(shù)字基因表達(dá)譜測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，重金屬污水脅迫處理樣品和對照樣品測序所得數(shù)據(jù)，經(jīng)過濾篩除含有接頭和低質(zhì)量部分后，得到高質(zhì)量Clean reads的比例分別為98.26%、98.23%，證明測序質(zhì)量較高。將得到的Clean reads與參考基因比對，對照樣本和重金屬污水脅迫處理樣本分別有89.20%和87.45%的Clean reads可比對上參考基因，這為白骨壤轉(zhuǎn)錄組序列的注釋打下了結(jié)實的基礎(chǔ)。測序結(jié)果提交到Genebank，登錄號為SRA487295。

飽和度是用來衡量單一樣本測序得到的基因數(shù)量是否覆蓋全基因組的標(biāo)準(zhǔn)，檢測所得的基因數(shù)量隨測序量的增加而增加，當(dāng)測序量接近基因組的大小時，其檢測到的基因總數(shù)達(dá)到峰值，表明檢測到的基因數(shù)已基本覆蓋全基因組。本研究中，對照樣本和污水脅迫處理樣本的Reads數(shù)量超過10 M時，檢測到的基因數(shù)量趨于飽和，而實驗中2個樣品的測序量分別為25.26、25.64 M，證明絕大部分基因已被檢測到。隨機(jī)性分析表明：各樣本的Reads呈正態(tài)分布，具有很高的隨機(jī)性。上述結(jié)果表明：本次測序結(jié)果能夠較好地反映各樣本中基因表達(dá)的真實情況，可用于分析重金屬污水脅迫處理下白骨壤基因的表達(dá)變化。

2.2 差異表達(dá)基因篩選

MeV聚類分析顯示：聚在同一類的基因表達(dá)量在對照樣本和重金屬污水脅迫處理樣本間差異極大，大部分基因表現(xiàn)為在污水脅迫處理樣本中的表達(dá)量比對照樣本中的高。

通過比較對照樣品與重金屬污水脅迫處理樣品基因表達(dá)譜，共篩選出10 459個差異表達(dá)基因，其中，有8 685個基因表達(dá)量增加，1 774個基因表達(dá)量減少，表明重金屬污水脅迫處理極大的誘導(dǎo)了白骨壤基因的表達(dá)。

2.3 差異表達(dá)基因GO功能顯著性富集分析

將白骨壤差異表達(dá)基因比對到GO數(shù)據(jù)庫，共得到2 041條terms，其中，“分子功能”514條，占25.18%；“細(xì)胞組分”202條，占9.90%；“生物學(xué)過程” 1 325條，占64.92%。以P-value≤0.01為標(biāo)準(zhǔn)篩選極顯著富集條目，共得到230條，其中，“分子功能”39條，“細(xì)胞組分”46條，“生物學(xué)過程”145條。對差異表達(dá)基因GO功能分類發(fā)現(xiàn)，大部分類別中，表達(dá)量上調(diào)的基因數(shù)比表達(dá)量下調(diào)的基因數(shù)多，其中，與“生物學(xué)過程”相關(guān)的差異表達(dá)基因主要涉及“代謝過程”、“對刺激因素的響應(yīng)”、“區(qū)域化”、“生物調(diào)節(jié)”等過程，與“分子功能”相關(guān)的差異表達(dá)基因主要與“結(jié)構(gòu)分子活性”、“轉(zhuǎn)運體活性”、“催化活性”、“結(jié)合活性”等分子活性相關(guān)，與“細(xì)胞組分”相關(guān)的差異表達(dá)基因主要與“細(xì)胞器組分”、“細(xì)胞組分”、“大分子復(fù)合物”、“膜組分”等結(jié)構(gòu)相關(guān)。此外，重金屬污水脅迫處理還提高了白骨壤的“抗氧化因子”、“蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子”、“核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子”、“電子載體”、“鳥嘌呤核苷酸交換因子”等關(guān)鍵因子的活性，進(jìn)而影響“生物粘附”、“ 信號傳導(dǎo)”、“ 多細(xì)胞調(diào)節(jié)”等過程。

2.4 KEGG 代謝通路顯著性富集分析

通過KEGG 代謝通路富集分析，可以揭示差異表達(dá)基因參與的主要生理活動途徑。結(jié)果表明：重金屬污水脅迫處理下，白骨壤差異表達(dá)基因輻射到126條Pathway中。從表2可以看出：在P≤0.05顯著性富集的20條Pathway中，富集在“核糖體途徑”的基因數(shù)量最多，共有409個差異表達(dá)基因；其次是“碳代謝途徑”，富集了303個差異表達(dá)基因?！耙胰┧猁}代謝”途徑、“光合生物固碳途徑”和“丙酮酸代謝途徑”也是3個顯著性富集的代謝途徑，分別富集了107、103、113個差異表達(dá)基因，占差異表達(dá)基因總數(shù)的6.32%、6.08%、6.67%。此外，在“苯丙環(huán)素的生物合成”、“氮素代謝”、“光合作用”、“脂肪酸代謝”、“氨基酰-tRNA的生物合成”、“半乳糖代謝”等途徑也富集了一定數(shù)量的差異表達(dá)基因。

表2 KEGG代謝通路富集分析

2.5 污水脅迫處理對白骨壤激素合成、運輸和信號途徑基因的表達(dá)調(diào)控

植物激素是一類參與植物生長發(fā)育、代謝和環(huán)境響應(yīng)的重要化學(xué)物質(zhì)[20]。通過對白骨壤DEG分析，得到了生長素、乙烯、細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉素和油菜素內(nèi)脂等一系列激素相關(guān)基因的表達(dá)差異情況，并分析了污水脅迫對上述基因的影響。結(jié)果(表3)表明：在污水脅迫處理下，一個生長素上調(diào)小RNA基因SAUR(0052024)顯著上調(diào)。多個乙烯信號途徑基因也得到了分析，其中，乙烯不敏感3基因EIN3(0016997)的表達(dá)保持穩(wěn)定，而乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子1基因ERF1(0013995)的表達(dá)受到污水脅迫的明顯誘導(dǎo)。眾多細(xì)胞分裂素基因的表達(dá)受到污水脅迫的顯著影響，如細(xì)胞分裂素脫氫酶7基因CKX7(0057124)的表達(dá)顯著上調(diào)，而一個富含組氨酸的磷酸轉(zhuǎn)移蛋白1基因AHP1(0029198)的表達(dá)受到極大的抑制。另一個內(nèi)源細(xì)胞分裂素相關(guān)基因玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因ZEP(0021189)在污水脅迫處理下表達(dá)水平也顯著上調(diào)。在脫落酸途徑中，一個脫落酸不敏感5基因ABI5(0061511)的表達(dá)顯著上調(diào)。最后筆者發(fā)現(xiàn)，油菜素內(nèi)脂的一個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分基因——油菜素內(nèi)酯信號激酶基因BSK(0043741)的表達(dá)受到極大的誘導(dǎo)。

表3 激素相關(guān)基因在污水脅迫下的表達(dá)變化

2.6 污水脅迫處理影響白骨壤刺激代謝關(guān)鍵酶編碼基因的表達(dá)

通過KEGG分析發(fā)現(xiàn)：污水處理可顯著影響白骨壤中萜類和黃酮類次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)(表4)，其中，萜類物質(zhì)生物合成的限速酶牻牛兒基焦磷酸合酶(0009238)、甲基赤蘚醇磷酸胞苷酰轉(zhuǎn)移酶(0057458)和1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶(0025369)的表達(dá)都受到污水脅迫的顯著誘導(dǎo)。另外，黃酮類生物合成的幾個關(guān)鍵酶，如：黃酮醇合成酶(0001833)和查爾酮合成酶(0000917)的編碼基因表達(dá)水平也受到明顯的誘導(dǎo)。大量次生代謝相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，暗示污水脅迫可能加速白骨壤內(nèi)次生代謝產(chǎn)物的積累。

表4 次生代謝相關(guān)基因在污水脅迫下的表達(dá)變化

2.7 重金屬污水脅迫下的轉(zhuǎn)錄因子分析

一系列轉(zhuǎn)錄因子家族成員在植物環(huán)境脅迫響應(yīng)中起到了重要的作用[21]?；谀Ｊ街参飻M南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫，筆者對白骨壤轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比對和注釋，一共鑒定到了分屬于56個常見家族的6 662個轉(zhuǎn)錄因子，轉(zhuǎn)錄因子家族及其包含的家族成員數(shù)據(jù)見表5。研究發(fā)現(xiàn)：bHLH、NAC、MYB_related、WRKY等家族在白骨壤中擁有大量的成員。此外，一批與激素相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族也得到了鑒定，如ARF、ERF、ARR-B等；一些與植物環(huán)境脅迫密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族也得到了不同程度的分析，如bZIP、GATA家族。鑒定轉(zhuǎn)錄因子家族，有利于形成一個完整的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示白骨壤污水脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制。

表5 轉(zhuǎn)錄因子分析

2.8 差異表達(dá)基因qRT-PCR驗證

為了驗證測序數(shù)據(jù)的可靠性，筆者選擇顯著富集的GO分類條目“GO:0016491”、“GO:0005198”、“GO:0016866”和“GO:0003723”中的8個差異表達(dá)基因進(jìn)行qRT-PCR分析，這8個基因分別是：0003922、0048831、0026527、0053069、0020253、0055711、0016422和0049777，它們都是白骨壤中參與基礎(chǔ)代謝的關(guān)鍵基因。實驗結(jié)果表明：這8個基因的qRT-PCR結(jié)果與數(shù)字基因表達(dá)譜中檢測到的表達(dá)趨勢有較高的一致性。

3 討論

重金屬污染是影響植物生長發(fā)育較為嚴(yán)重的逆境。植物在長期進(jìn)化過程中，響應(yīng)重金屬脅迫而形成了特定的生長習(xí)性和形態(tài)、生理特征。作為一種有代表性的紅樹植物，白骨壤對污染脅迫表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐受性[9]，展開對白骨壤的轉(zhuǎn)錄組分析，有利于從基因?qū)用娼沂炯t樹植物耐受污染脅迫的機(jī)制。在本研究中，污水脅迫處理下，白骨壤的差異表達(dá)基因大部分上調(diào)表達(dá)，說明白骨壤可能通過提高自身轉(zhuǎn)錄水平應(yīng)對污染脅迫，并增強(qiáng)適應(yīng)能力。GO顯著性分析發(fā)現(xiàn)，“代謝過程”共富集了1 792個上調(diào)表達(dá)基因，178個下調(diào)表達(dá)基因；KEGG代謝通路顯著性分析表明，“核糖體”、“氮素代謝”、“碳代謝”、“丙酮酸代謝”、“脂肪酸代謝”等途徑中富集了大量的差異表達(dá)基因(大部分為上調(diào)基因)，說明白骨壤可能通過上調(diào)表達(dá)與基本代謝相關(guān)的基因來加快有害物質(zhì)的新陳代謝，從而增強(qiáng)自身對污染脅迫的耐受能力。

光合作用的強(qiáng)弱能反映植物體對外界環(huán)境變化的適應(yīng)情況。微量的重金屬能刺激紅樹植物葉綠素的合成，使光合作用增強(qiáng)，以提供更多的能量促進(jìn)植物體的生長[22]；然而，紅樹植物對污染脅迫也有一定的耐受范圍，當(dāng)脅迫濃度超過其耐受的上限時，會抑制葉片的光合作用。用大于30 mg·kg-1的Cd處理桐花樹(Aegicerascorniculatum(Linn.) Blanco)發(fā)現(xiàn)，葉片細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)被破壞，葉綠素含量降低[22]；另有報道，在高濃度Hg2+(50 mg·L-1)處理下，白骨壤幼苗葉片凈光合作用的速率降低[23]。此外，黃國勇等[24]報道，增加復(fù)合重金屬的脅迫濃度，秋茄(Kandeliacandel(L.) Druce)葉片葉綠素的合成量下降加劇。原因可能是重金屬離子與葉綠素合成酶的功能結(jié)構(gòu)域結(jié)合，阻礙它們發(fā)揮作用。另外，重金屬離子也能加快葉綠素的分解速率。在本研究中，KEGG 代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，“光合作用途徑”中富集了83個差異表達(dá)基因，說明在污染脅迫下白骨壤可能通過調(diào)節(jié)與光合作用相關(guān)基因的表達(dá)，以維持葉綠素的正常合成和葉綠體的結(jié)構(gòu)完整性，從而使光合作用得以正常進(jìn)行。

大量研究表明，激素作為植物體內(nèi)一類重要的化學(xué)成分參與植物的抗逆反應(yīng)[25]。在白骨壤的DEGs(差異表達(dá)基因)中，鑒定得到一批與激素相關(guān)的基因，它們的表達(dá)水平受到污水脅迫處理的調(diào)控。在擬南芥(Arabidopsisthaliana(L.) Heynh.)和甘草(GlycyrrhizauralensisFisch.)中，鎘、銅或者汞脅迫顯著誘導(dǎo)了ERF家族基因的表達(dá)[26-27]。本研究中，一個乙烯響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子ERF1(0013995)受到誘導(dǎo)，這與模式植物的表達(dá)情況一致。脫落酸是已知的逆境激素，張春榮等[27]發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫顯著誘導(dǎo)ABA生物合成關(guān)鍵酶ZEP基因和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組分ABI5基因的表達(dá)。在本研究中，細(xì)胞分裂素相關(guān)基因玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶ZEP(0021189)和脫落酸不敏感基因ABI5(0061511)都受到重金屬污水脅迫的顯著誘導(dǎo)。重金屬脅迫顯著促進(jìn)了白骨壤乙烯、細(xì)胞分裂素的生物合成和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，這有可能進(jìn)而促進(jìn)根的發(fā)生和細(xì)胞增殖，從而提高脅迫下的植株適應(yīng)能力。

環(huán)境脅迫往往會導(dǎo)致一些次生代謝產(chǎn)物的積累，研究白骨壤次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)，有助于揭示次生代謝途徑參與白骨壤環(huán)境脅迫的分子機(jī)制[28]。在眾多的次生代謝成分中，黃酮類和萜類物質(zhì)與環(huán)境脅迫的聯(lián)系最緊密。有報道稱，多種環(huán)境脅迫可以誘導(dǎo)黃酮類植物在植物體內(nèi)的積累[29]。通過對差異表達(dá)基因的分析，筆者發(fā)現(xiàn)，與黃酮和萜類化合物次生代謝相關(guān)的關(guān)鍵基因的表達(dá)都受到污水脅迫處理的一致上調(diào)，其中，黃酮合成的2個上游酶編碼基因：黃酮醇合成酶(0001833)和查爾酮合成酶(0000917)都受到明顯的誘導(dǎo)。這進(jìn)一步說明，積累的次生代謝產(chǎn)物有助于白骨壤污水脅迫耐受性的形成。

前期的研究表明，一系列轉(zhuǎn)錄因子參與了植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)。作為植物中最大的家族之一， MYB類轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與植物次生代謝調(diào)控、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生、脅迫應(yīng)答、分生組織形成及細(xì)胞周期控制等[30]。在白骨壤中，筆者一共鑒定得到219個MYB轉(zhuǎn)錄因子和431個MYB-related轉(zhuǎn)錄因子。NAC家族轉(zhuǎn)錄因子也被認(rèn)為是一類重要的脅迫調(diào)控因子。OsMAC5和OsNAC6都是水稻(OryzasativaL.)響應(yīng)生物及非生物脅迫的關(guān)鍵因子，它們與植物的脅迫耐受性密切相關(guān)[31-32]。在白骨壤中，可能的NAC轉(zhuǎn)錄因子一共有487個。以上結(jié)果為進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)錄因子家族在白骨壤污水脅迫中的響應(yīng)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實驗以重金屬處理下的白骨壤差異基因表達(dá)譜為基礎(chǔ)，得到了大量重金屬響應(yīng)基因，并預(yù)測了這些基因可能的生物學(xué)功能。筆者分析表明，重金屬處理影響了白骨壤大量的新陳代謝、光合作用、小分子酸合成、激素合成與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及次生代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的表達(dá)。白骨壤對重金屬脅迫響應(yīng)機(jī)制具有極高的復(fù)雜性，深入研究一些關(guān)鍵基因?qū)⒂兄谌媪私馄浞肿訖C(jī)制。

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(責(zé)任編輯：徐玉秀)

Digital Gene Expression Profiling Analysis ofAvicenniamarinaunder Heavy Metal Stress Treatment

YUANChang-chun1,MOJian-xin1,YUANGLiu-jiao1,YURu-feng1,LIUQian2,ZHONGJun-di1,LIUKai-dong1

(1.Life Science and Technology School, Lingnan Normal University, Zhanjiang 524048, Guangdong, China; 2.Guangzhou Gene Denovo Company, Guangzhou 510006, Guangdong, China)

[Objective]Transcriptome sequencing was perform to study the molecular mechanism in response to heavy metal stress inAvicenniamarina.[Method]Digital Gene Expression Profiling (DGE) technique was used to analyze the differences in gene expressions ofA.marinaunder artificial heavy metal stress.[Result]Compared to the controls, 10459 differentially expressed genes (DEGs) were detected, including 8685 up-regulated genes and 1774 down-regulated genes. MeV cluster analysis indicated that the expression level of most genes was largely induced in artificial heavy metal treatment sample than that in control sample. Gene Ontology analysis showed that most DEGs locate in “organelle envelope”, “plastid envelope” and “chloroplast part”, and were enriched in the biological process of “response to stimulus”, and “l(fā)ocalization”, etc. Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway enrichment analysis revealed that these genes are distributed in 126 pathways involved in “ribosome”, “photosynthesis”, and various metabolism pathways, such as pyruvate and glyoxylate. Several terpenoid and flavonoid biosynthesis-related enzymes, such as geranylgeranyl pyrophosphate synthase (Unigene0009238) and flavonol synthase (Unigene0001833), were up-regulated by heavy metal stress, which might be the reason for the enhancement for the active ingredients accumulation inA.marina. Furthermore, heavy metal stress significantly induced the cytokinin dehydrogenase 7(CKX7) (Unigene0057124) and serine/threonine-protein kinase (BSK) (Unigene0043741). Besides, the transcription factor analysis demonstrated that bHLH, NAC, MYB-related and WRKY play vital roles in response to heavy metal stress．Furthermore, eight randomly selected genes were used to confirm the accuracy of DGE by qRT-PCR method.[Conclusion]Heavy metal stresses have effects on the expression of related genes involved in the metabolism, photosynthesis, small molecule acid synthesis, hormone synthesis and signal transduction, and secondary metabolites synthesis ofA.marina

Avicenniamarina; heavy metal stress; digital gene expression profiling (DGE); differentially expressed genes (DEGs); mechanism

2016-06-12 基金項目： 廣東省林業(yè)科技創(chuàng)新項目(2013KJCX011-03; 2015KJCX025)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(201510579277)；湛江市熱帶特色資源植物技術(shù)開發(fā)重點實驗室項目(2014A06008)；嶺南師范學(xué)院自然科學(xué)研究項目(LZL1507) 作者簡介： 袁長春，博士，教授. 主要研究方向：植物分子生物學(xué). E-mail:yuanchangchun@163.com * 通訊作者：劉鍇棟，碩士，副研究員. 研究方向：植物分子生物學(xué). E-mail: liukaidong2001@126.com

10.13275/j.cnki.lykxyj.2017.02.004

S718.46

A

1001-1498(2017)02-0206-08