吳建陽+何冰+杜玉潔++李偉才+魏永贊

摘要 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由于具備靈敏度高、重復性好、特異性強及高通量等優(yōu)點，已經(jīng)成為研究基因表達分析的常用方法，但其結(jié)果的準確性取決于內(nèi)參基因。在任何試驗條件下都能穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因幾乎不存在，科研工作者為了獲得精準的試驗結(jié)果，首先必須從眾多的內(nèi)參基因中篩選出穩(wěn)定的內(nèi)參基因。geNorm、NormFinder和BestKeeper等是專門用于篩選穩(wěn)定性內(nèi)參基因的軟件，但這3種軟件使用方法差異很大，為了讓更多的科研人員了解這些軟件、節(jié)省時間，筆者結(jié)合自己的科研經(jīng)驗詳細介紹了這3種軟件的使用方法，以期為相關科研人員利用這些軟件篩選內(nèi)參基因提供便利。

關鍵詞 內(nèi)參基因；穩(wěn)定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper

中圖分類號 S60 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2017）05-0278-04

Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR technology（RT-qPCR） is used for gene expression analysis with high sensitivity，good repea-tability，strong specificity，high throughput，but the veracity and reliability results depend on whether select appropriate reference gene or not.However，no universally applicable reference genes with an invariant expression are available.In order to obtain accurate results，appropriate reference genes for RT-qPCR normalisation must systematically evaluate the stability of candidate reference genes prior to using in each experimental system.geNorm，NormFinder and BestKeeper are useful programs to identify appropriate reference genes for RT-qPCR analysis，but the methods for using the three softwares were different.In order to save the time to understanding the way to use them and provide convenient for new researchers，this study described the methods of application.

Key words reference gene；stability analysis；geNorm；NormFinder；BestKeeper

實時熒光定量PCR（RT-qPCR）由于具備靈敏度高、重復性好、特異性強及高通量等優(yōu)點，已經(jīng)成為研究基因表達分析的常用方法[1-2]。實時熒光定量PCR分為絕對定量和相對定量，在進行相對定量分析時不需要已知量的標準品，因而該方法被經(jīng)常運用，但該方法需要用內(nèi)參基因?qū)δ康幕蜻M行數(shù)據(jù)校正，才能獲得精確的結(jié)果[3-4]。

肌動蛋白基因（ACT）、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPD

H）、18S rRNA、轉(zhuǎn)錄延伸因子基因（EF-1α）、多聚泛素酶基因（UBQ）、α微管蛋白基因（TUA）和β微管蛋白基因（TUB）等看家基因在之前的研究中常常被當作內(nèi)參基因進行使用[5-8]。然而，越來越多的研究表明，在某種試驗穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因，在另一種試驗中有可能是變化的[9-11]，而在任何試驗條件下都能穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因幾乎不存在[12-13]。如果僅僅根據(jù)文獻報道使用某個常用的內(nèi)參基因，不僅可能導致試驗結(jié)果的不準確性，甚至可能導致結(jié)論的錯誤。因此，本著嚴謹?shù)目茖W態(tài)度，科研工作者首先必須從眾多的內(nèi)參基因中篩選出在各自試驗條件下較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

geNorm、NormFinder 和 BestKeeper是專門用于篩選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的軟件，但這3種軟件的使用方法和分析的側(cè)重點各不一樣，為了讓相關科研人員快速了解并掌握這3種軟件的使用方法，筆者結(jié)合自身使用這些軟件的經(jīng)歷，詳細介紹了這3種軟件的使用要點，以期為相關科研人員分析內(nèi)參基因穩(wěn)定性提供便利。

1 geNorm軟件

1.1 軟件概述

geNorm 軟件是Vandesompele等[14]在2002年編寫的專門用于實時熒光定量PCR中篩選內(nèi)參基因及確定最適內(nèi)參基因數(shù)目的程序，該程序可以用于篩選任何試驗的任意數(shù)目的內(nèi)參基因，并最終挑選出2個或2個以上的內(nèi)參基因組合來校正數(shù)據(jù)，可使相對定量的結(jié)果更為精確。geNorm程序通過計算出每個內(nèi)參基因穩(wěn)定性的M值來篩選出穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因，判定標準為M值越小內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，反之，則穩(wěn)定性越差。該軟件還可計算引入1個新的內(nèi)參基因后標準化因子的配對變異V值，并根據(jù)Vn/Vn+1值來確定所需最適內(nèi)參基因的數(shù)目。默認的V值為0.15（該值可以人為稍作調(diào)整），如果Vn/Vn+1值<0.15，則最適內(nèi)參基因的數(shù)量是n個；而如果Vn/Vn+1值>0.15，則最適內(nèi)參基因的數(shù)量是n+1個。

1.2 操作流程

1.2.1 修改Excel表格安全性級別。若geNorm軟件打開后不能正常運行時，可能是由于Excel表格默認宏的安全性級別設置的比較高，這時需要將Excel表格安全性級別更改到最低級別。更改方法為點擊Excel表格中的“工具”按鈕，然后點擊其下拉菜單“宏”的子菜單“安全性”選項，在彈出來的“安全性”對話框中將安全級別設置為最低。

1.2.2 計算？駐Ct值。先找到該基因在所有樣品中最小的Ct（Cycle threshold）值（表達量最高），再用其他樣品的Ct值減去最低Ct值，從而得到？駐Ct值，該值≥0。

1.2.3 計算2-？駐Ct值。獲得每個樣品每個基因的？駐Ct值后，利用Excel中的函數(shù)計算出相應樣品相應基因的2-？駐Ct值，該值就是每個候選內(nèi)參基因的相對定量數(shù)據(jù)，也是進行geNorm軟件分析時要用到的數(shù)據(jù)。

1.2.4 制作Excel表格。在利用geNorm軟件分析時是將已經(jīng)處理好的各個候選內(nèi)參基因的相對定量數(shù)據(jù)保存在一個新的Excel表格中，再把Excel表格導入geNorm程序中。而這個Excel表格中對于基因和樣品的排列位置是有特定要求的，要求規(guī)定第一列為試驗的樣品（樣品數(shù)量至少在2個以上，樣品數(shù)量越多結(jié)論越可靠），第1行為欲篩選的內(nèi)參基因，第1列第1行的單元格必須是空的，其他單元格的數(shù)據(jù)是在步驟1.2.3中計算得到的基因相對表達量的數(shù)值。

1.2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性和合適內(nèi)參基因數(shù)目的確定。關閉所有Excel程序，啟動geNorm程序，點擊菜單欄中的“Load input data”按鈕導入已經(jīng)在步驟1.2.4中制作的Excel表格，點擊軟件中的“Calculate”按鈕，軟件初步計算后再點擊“Automated analysis”按鈕，便可得到候選內(nèi)參基因穩(wěn)定性折線圖，見圖1（a），該圖最左邊基因的M值最高，是穩(wěn)定性最差的基因（H3基因），右邊基因的M值依次較左邊基因的M值低，穩(wěn)定性依次增強，最右邊基因的M值最低，是穩(wěn)定性最好的2個基因（CYP1和Fe-SOD2基因）。點擊菜單欄中的“Print or Save report”按鈕，從彈出來的對話框中選中“save output to fi”選項便可把每個候選內(nèi)參基因的M值導出到一個Excel中。再次點擊“Automated analysis”按鈕便可得到最適數(shù)據(jù)歸一化內(nèi)參數(shù)目的柱形圖，見圖1（b），可根據(jù)每個柱形圖上面的V值來確定試驗所需的最適內(nèi)參基因數(shù)目，判定標準為當Vn/Vn+1< 0.15時，則最合適內(nèi)參基因的數(shù)量是n個；而如果Vn/Vn+1 > 0.15時，則最合適內(nèi)參基因的數(shù)量是n+1個，所以該試驗條件下的最適內(nèi)參基因數(shù)目是2個，因為V2/3=0.135<0.15。再次點擊菜單欄中的“Print or Save report”按鈕，從彈出來的對話框中選中“save output to fi”選項便可把所有的Vn/Vn+1值導出到一個Excel中。

2 NormFinder軟件

2.1 軟件概述

NormFinder是Claus等[15]在2004年編寫的用于篩選穩(wěn)定性內(nèi)參基因的另一種程序，該程序計算原理與geNorm 程序相似，也是先獲得內(nèi)參基因表達穩(wěn)定值，再根據(jù)穩(wěn)定值大小來篩選出最合適的內(nèi)參基因，判定標準為表達穩(wěn)定值最小的內(nèi)參基因為最合適的內(nèi)參基因。NormFinder程序不但可以比較候選內(nèi)參基因的表達差異，還可以計算樣品組間的變異，但該程序只能篩選出一個最合適的內(nèi)參基因[16]。

2.2 操作流程

2.2.1 在Excel表格中插入NormFinder軟件。先打開一個Office 2003版的Excel表格，在菜單欄中單擊“工具”下拉菜單中的“加載宏”選項，通過“加載宏”對話框中的“瀏覽”按鈕找到NormFinder軟件存放的位置，點擊“確定”按鈕，將NormFinder軟件功能加載到Excel中，加載成功后在Excel菜單欄中會多一個NormFinder按鈕（圖2）。

2.2.2 計算？駐Ct值。計算方法與步驟1.2.2一致。

2.2.3 計算2-？駐Ct值。計算方法與步驟1.2.3一致。

2.2.4 制作Excel表格。進行NormFinder分析是在Excel表格中進行的，但Excel表格中基因和樣品的排列位置與進行geNorm軟件分析時有所不同。利用NormFinder分析時，Excel表格中第1列為欲篩選的內(nèi)參基因，第1行為試驗中的樣品，第1列第1行的單元格必須是空的，其他單元格的數(shù)據(jù)是步驟2.2.3中計算得到的基因相對表達量的數(shù)值。

2.2.5 內(nèi)參基因穩(wěn)定性的確定。步驟2.2.4處理好后單擊Excel菜單欄“NormFinder”按鈕下拉菜單的“NormFinder”選項，便彈出對話框，如圖3所示。單擊“Select input date”后面的按鈕，就可以利用鼠標在Excel表格中選定數(shù)據(jù)區(qū)域，選定區(qū)域后再次回到圖3界面，然后單擊“Go”按鈕，便可獲得各個基因穩(wěn)定性M值，同時穩(wěn)定性最好的基因（Best gene）會單獨顯示出來，如圖4所示最穩(wěn)定的基因為RPL2。

3 BestKeeper軟件

3.1 軟件概述

BestKeeper是Michael等[17]編寫的針對內(nèi)參基因和目標基因表達量分析的程序，該程序最多只能比較100個樣品中10個內(nèi)參基因和10個目標基因的表達水平。通過該程序計算可以獲得每個基因之間產(chǎn)生配對的相關系數(shù)（r）、標準偏差（SD）和變異系數(shù)（CV），再通過比較各個值的大小，最終確定穩(wěn)定性較好的內(nèi)參基因。判定原則為相關系數(shù)越大、標準偏差和變異系數(shù)越小，內(nèi)參基因穩(wěn)定性越好，反之，穩(wěn)定性越差；當SD>1時，則該內(nèi)參基因表達不穩(wěn)定。該程序不但可以用于內(nèi)參基因穩(wěn)定性比較，還可以分析目的基因的表達水平。

3.2 操作流程

BestKeeper程序是一個內(nèi)置公式的Excel表格，在該表格中只有CP（crossing point）值輸入?yún)^(qū)域（CP date input）可以進行數(shù)據(jù)的輸入和修改，其他區(qū)域的單元格由于帶有內(nèi)置公式而不能進行任何操作。該程序操作較簡單，只需要將實時熒光定量PCR所獲得的CP值直接輸入“CP date input”區(qū)域，輸入的CP值是RT-qPCR中3次技術重復所得值的幾何平均數(shù)。當CP值輸入完畢后，BestKeeper程序會自動將計算好的相關系數(shù)（r）、標準偏差（SD）和變異系數(shù)（CV）等值顯示在表格的下方。之后根據(jù)判定原則，確定較穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

4 結(jié)語

geNorm、NormFinder和BestKeeper等軟件是專門用于篩選內(nèi)參基因穩(wěn)定性的程序，且在多種植物中利用這些軟件獲得的內(nèi)參基因穩(wěn)定性試驗成果已在較高檔次的SCI期刊上發(fā)表，如在大豆[18]、馬鈴薯[19]、印加果[20]、香蕉[21]上的試驗結(jié)果分別在BMC Molecular Biology、Journal of Experimental Botany、International Journal of Molecular Sciences、Planta期刊上發(fā)表，筆者利用這些軟件分析獲得的龍眼[22]內(nèi)參基因穩(wěn)定性結(jié)果也發(fā)表在Frontiers in Plant Science期刊。

利用geNorm和NormFinder軟件分析時，需要將RT-qPCR所得到的Ct值轉(zhuǎn)化為基因的相對表達量，然后按相應的格式把這些數(shù)據(jù)保存在Excel表格中，而在使用BestKeeper軟件時不需要將RT-qPCR所得到的CP值進行轉(zhuǎn)化，可以直接使用所得到的CP值。

geNorm分析時首先是將已經(jīng)處理好的數(shù)據(jù)保存在Excel表格中，再把Excel表格導入geNorm程序中。NormF-inder分析時是在Excel表格中將NormFinder程序以宏的方式插入到Excel表格中，從而使Excel具有NormFinder分析功能。BestKeeper分析時是在內(nèi)置BestKeeper公式的Excel表格中直接輸入CP值進行分析。

這3種軟件各具優(yōu)點，geNorm軟件可以用于篩選任何樣品的任意數(shù)量內(nèi)參基因，通過該程序分析可以篩選出合適的內(nèi)參基因以及確定最適內(nèi)參基因數(shù)目。NormFinder軟件不但可以比較內(nèi)參基因的表達差異，還可以計算樣品組間的變異，但只能篩選出1個合適的內(nèi)參基因。BestKeeper軟件可以用于比較100個樣品中10個內(nèi)參基因和10個目標基因的表達水平，并最終獲得較為穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

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