黃艷羚+孫淑蘭

摘要：獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)禽流感和雞新城疫抗體采用血凝（HA）-血凝抑制（HI）試驗(yàn)。該試驗(yàn)有些因素會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，是試驗(yàn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，如配制1%雞紅細(xì)胞時(shí)其濃度的高低會(huì)影響抗體滴度的高低；4單位抗原的配制需要回滴正確；試驗(yàn)的反應(yīng)時(shí)間和溫度也要符合要求。只有掌握好試驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)，才能得出準(zhǔn)確無(wú)誤的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)該試驗(yàn)的操作要點(diǎn)及注意事項(xiàng)進(jìn)行了介紹。

關(guān)鍵詞：禽流感抗體檢測(cè)；雞新城疫抗體抗體檢測(cè)；血凝（HA）-血凝抑制（HI）試驗(yàn)；操作要點(diǎn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S851.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1007-273X（2016）12-0022-01

實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)禽流感及雞新城疫抗體滴度采用血凝（HA）—血凝抑制（HI）試驗(yàn)，是利用了禽流感病毒、雞新城疫病毒的血凝素能凝集雞紅細(xì)胞的特性?，F(xiàn)將HA-HI試驗(yàn)操作步驟及注意事項(xiàng)介紹如下，供參考。

1 試劑配制

1.1 阿氏液配制

稱(chēng)量葡萄糖2.05 g、檸檬酸鈉0.80 g，檸檬酸0.055 g、氯化鈉0.42 g，加蒸餾水至100 mL，加熱溶解后調(diào)pH至6.1，高壓滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 1%雞紅細(xì)胞液的制備

因?yàn)槊恐浑u的血紅細(xì)胞的結(jié)合性不一樣，所以要取3～4只公雞血，要求是SPF雞，每3個(gè)月?lián)Q一次雞。采血與等量阿氏液混合均勻，放入離心管中。雞紅細(xì)胞的洗滌：將離心管中的血液經(jīng)2 500 r/min離心5 min，用吸管移去上清液及沉淀紅細(xì)胞上層的白細(xì)胞薄膜，再重復(fù)2次以上過(guò)程后，用生理鹽水配成1%紅細(xì)胞懸液，4 ℃保存?zhèn)溆茫怀^(guò)5 d。離心的時(shí)間、轉(zhuǎn)速不一樣，紅血球壓積不一樣。紅血球濃度低，檢測(cè)出的抗體效價(jià)就低，反應(yīng)時(shí)間變長(zhǎng)。紅血球濃度高，檢測(cè)出的抗體效價(jià)就高，會(huì)偏離正常值。轉(zhuǎn)速不能超過(guò)3 000 r/min，不然紅細(xì)胞易破碎。洗紅血球時(shí)需要用和稀釋液一樣的液體。

2 操作步驟

2.1 抗原血凝效價(jià)測(cè)定（HA試驗(yàn)，微量法）

在一次性微量反應(yīng)板的1～12孔均加入25 μL的生理鹽水，吸取25 μL抗原加入第一孔，混勻。從第一孔倍比稀釋至第11孔，從第11孔棄25 μL，每孔再加入25 μL生理鹽水，每孔均加入25 μL 1%雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻，室溫，25 min觀察結(jié)果，使紅細(xì)胞完全凝集的抗原最高稀釋度為1個(gè)血凝單位。

2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)（微量法）

4單位抗原配制：終點(diǎn)稀釋倍數(shù)除以4即為含4 HAU的抗原的稀釋倍數(shù)。4單位抗原在使用前最好做回滴試驗(yàn)，以確保配制的抗原正好為4單位抗原。具體操作方法如下：在微量反應(yīng)板的1～6孔均加入25 μL生理鹽水，吸取25 μL配好的4單位抗原，分別加入第1孔和第2孔，混勻，從第2孔倍比稀釋至第5孔，從第5孔棄25 μL，2～6孔再加入25 μL生理鹽水，1～6孔均加入25 μL1%雞紅細(xì)胞懸液，室溫靜置30 min，判斷結(jié)果。將板傾斜，1～3孔紅細(xì)胞全部凝集，第4孔顯淚滴狀流淌，則配液正確。調(diào)整抗原濃度，直到回滴正確。配好的抗原使用時(shí)間不超過(guò)4 h。4單位抗原配制是否正確，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響很大?？乖?20 ℃保存，用時(shí)恢復(fù)至室溫?？乖瓚?yīng)分裝，避免反復(fù)凍融，否則會(huì)降低效價(jià)。

在微量反應(yīng)板的第1～11孔加入25 μL生理鹽水，第12孔加入50 μL生理鹽水。吸取25 μL待檢血清加入第1孔，依次倍比稀釋至第10孔，從第10孔吸取25 μL棄去。第1～11孔均加入4HAU混勻的抗原液25 μL，室溫靜置30 min，每孔加入25 μL 1%的雞紅細(xì)胞懸液，混勻，室溫靜置30 min。結(jié)果判定：以完全抑制4個(gè)HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。只有陰性對(duì)照孔血清滴度不大于2log2，陽(yáng)性對(duì)照孔血清誤差不超過(guò)1個(gè)滴度，試驗(yàn)結(jié)果才有效。HI效價(jià)≤3log2判定HI試驗(yàn)陰性，HI效價(jià)=4log2為可疑，HI效價(jià)≥5log2為陽(yáng)性。

注意，稀釋液的pH應(yīng)在7.0～7.2，pH低時(shí)，看不見(jiàn)效價(jià)，pH大于7.8時(shí)，容易溶脫。反應(yīng)時(shí)，室溫高于37 ℃時(shí)，血細(xì)胞易脫落，4 ℃以下會(huì)自凝。溫度24～25 ℃反應(yīng)效果最好。稀釋溶液時(shí)，用10～100 μL量程多道移液器，每孔反復(fù)吹吸6次，動(dòng)作應(yīng)均勻一致。常用96孔V型板，一次性微量反應(yīng)板，沉降快，清晰、易判。用雞紅細(xì)胞檢測(cè)鴨血清時(shí)，會(huì)出現(xiàn)非特異性凝集，最好用同源動(dòng)物紅血球。