劉巖

（1.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086）

亞麻AtCesA1基因過表達(dá)載體的構(gòu)建

劉巖1，2

（1.東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，哈爾濱150086）

為開展纖維素合成酶基因?qū)雭喡榈幕蚬こ萄芯?，以擬南芥為材料克隆了纖維素合成酶基因AtCesA1，序列長為3912 bp，其中編碼區(qū)在277～3523堿基之間，共3246 bp，推測其編碼了1082個氨基酸。通過同義突變將全長基因克隆到植物表達(dá)載體pBI1301中，構(gòu)建出植物表達(dá)載體pCAMBIA1301－AtCesA1，經(jīng)酶切和PCR鑒定確認(rèn)目的基因已經(jīng)正確地插入到載體上，為下一步AtCesA1遺傳轉(zhuǎn)化亞麻功能研究打下了基礎(chǔ)。

亞麻；纖維素合成酶基因；克??；表達(dá)載體

1 前言

纖維作物亞麻（Limum usitatissimum）是人類最早使用的天然紡織材料之一，距今已有一萬多年的歷史。亞麻這種天然纖維珍貴稀有，僅占天然纖維總含量的1.5%。植物纖維中的主要成分就是纖維素，亞麻中纖維素占其纖維總量的67.07%［1］。纖維素是以D－葡萄糖為原材料，通過β－1，4糖苷鍵組成的大分子多糖。纖維素合成酶是合成纖維素過程中的關(guān)鍵酶，經(jīng)過催化合成出β－1，4糖苷鏈，在合成纖維素的過程中起到至關(guān)重要的作用。擬南芥是公認(rèn)的模式植物，擬南芥纖維素合成酶基因參與次生細(xì)胞壁的形成，這一論斷為改良亞麻纖維的品質(zhì)奠定了理論基礎(chǔ)［2］。近年來，經(jīng)過研究擬南芥纖維素合成酶發(fā)現(xiàn)，擬南芥纖維素合成酶基因1、2、3、6在合成初生細(xì)胞壁的過程中起著舉足輕重的作用［3－6］.因此，通過AtCesA1基因的克隆、測序與構(gòu)建其正義植物表達(dá)載體，為利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將AtCesA1基因?qū)雭喡椋M(jìn)而對改善亞麻纖維素質(zhì)量和產(chǎn)量具有十分重要的意義。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

植物材料：模式植物擬南芥葉片；植物表達(dá)載體：pBI1301（黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所提供）；pGET－T載體（Promega），RNaseA（Takara）、TaqDNA聚合酶（Promega）；IPTG、X－gal、氨芐青霉素、卡那霉素、羧芐青霉素（Promega）、HF109－EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（原平皓），qPCR迷你套裝III（TOYOBO）。所有引物及測序在哈爾濱賽信生物科技開發(fā)有限公司合成。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 RNA提取

取擬南芥葉片，迅速放入液氮中研磨成粉末狀，按照原平皓公司的HF109－EASYspin植物RNA快速提取試劑盒的操作提取并純化RNA。

2.2.2 RT反轉(zhuǎn)錄及雙鏈cDNA的合成

擬南芥雙鏈cDNA的合成采用的是TOYOBO公司的qPCR迷你套裝III完成。

2.2.3 PCR反應(yīng)

根據(jù)Genbank已發(fā)表的纖維素合成酶基因AtCesA1序列，以雙鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，68℃3 min 35個循環(huán)，72℃延伸7 min。

2.2.4 膠回收

100μL PCR產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳。待目標(biāo)帶分離較好時，用潔凈刀片切下目標(biāo)條帶所在膠塊，盡量切去多余的膠（紫外燈30 s內(nèi)，防止DNA變性），置于滅菌的1.5 mL離心管中。用Agarose Gel DNA Extraction Kit試劑盒回收目標(biāo)帶。

2.2.5 基因的克隆與測序

在PCR擴(kuò)增的過程中，TaqDNA聚合酶具有在雙鏈DNA 3′末端加上一個非模板來源的核苷酸A的特性，使擴(kuò)增產(chǎn)物具有A突出末端。將PCR產(chǎn)物與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHα菌株，藍(lán)白斑篩選，質(zhì)粒提取，酶切鑒定片段大小后測序。

2.2.6 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

按步驟進(jìn)行cDNA的PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物的回收，連接，酶切，感受態(tài)細(xì)胞制備，質(zhì)粒DNA的提取，連接、轉(zhuǎn)化以及瓊脂糖凝膠電泳分析［7］，構(gòu)建的植物表達(dá)載體命名為pCAMBIA1301－AtCesA1。

3 結(jié)果與分析

3.1 RNA的提取與cDNA的合成

利用賽信生物公司的HF－EASYspin植物RNA快速提取試劑盒提取的RNA的電泳圖（如圖1），主帶清晰完整，說明RNA質(zhì)量較好，可以用于合成雙鏈cDNA。取上述RNA用qPCR迷你套裝III合成雙鏈cDNA，合成產(chǎn)物在0.8%的瓊脂糖凝膠中電泳，電泳圖（圖2）呈現(xiàn)一條彌散的亮帶，符合植物雙鏈cDNA的帶譜特點(diǎn)。

圖1 RNA電泳圖譜Fig.1 RNA electrophoresismap

圖2 cDNA的合成圖譜Fig.2 Synthesismap of cDNA

3.2 纖維素合成酶基因的克隆與測序

根據(jù)Genbank已發(fā)表的纖維素合成酶基因AtCesA1序列，以雙鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，68℃3 min 35個循環(huán)，72℃延伸7 min?；厥誔CR產(chǎn)物，按照pGET－T載體試劑盒操作流程，將回收的DNA片段連接到T－載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DHA菌株，藍(lán)白斑篩選，質(zhì)粒提取，酶切鑒定片段大小后測序。

以雙鏈cDNA為模板進(jìn)行PCR，產(chǎn)物在0.1%的膠中電泳，在4000 bp左右大小處有一條亮帶（圖3），該基因片段具有開放的閱讀框，編碼區(qū)在277～3523堿基之間，編碼區(qū)為3246 bp，經(jīng)過計算推測編碼1082個氨基酸，將其與典型的植物纖維素合成酶基因進(jìn)行比較，其結(jié)構(gòu)有如下特點(diǎn)，具有纖維素合成酶共有的保守區(qū)D，D，DQXXW保守區(qū)，鋅指／LIM轉(zhuǎn)錄因子區(qū)，高變區(qū)，跨膜區(qū)（圖4），確認(rèn)3912 bp的DNA片段為一個全長纖維素合成酶基因AtCesA1，NM_119393是其在Genbank的注冊號。

圖4 纖維素合成酶基因AtCesA1的結(jié)構(gòu)Fig.4 Structure of cellulose synthase gene AtCesA1

圖3 纖維素合成酶基因編碼區(qū)的克隆譜圖Fig.3 Coding region’s cloningmap of cellulose synthase gene

3.3 AtCesA1基因正義植物表達(dá)載體的構(gòu)建

為了切除GUS基因，使整個植物表達(dá)載體縮小，從而利于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化，目的序列替換掉該載體上的GUS基因，可以利用35 S promoter作為啟動子，目的序列兩端的酶切位點(diǎn)分別為5′端NcoI／3′端PmlI。構(gòu)建好的表達(dá)載體pCAMBIA1301－AtCesA1的結(jié)構(gòu)圖如下：

圖5 AtCesA1基因植物表達(dá)載體pCAMBIA1301－AtCesA1的結(jié)構(gòu)圖Fig.5 Structure of AtCesA1’s expression vector pCAMBIA1301－AtCesA1

3.4AtCesA1基因植物表達(dá)載體的鑒定

將AtCesA1基因表達(dá)載體質(zhì)粒DNA雙酶切后電泳出現(xiàn)如下電泳圖譜（圖6），出現(xiàn)兩條帶譜，一條超過8.0 kb，一條為1.5 kb左右，符合預(yù)期結(jié)果。用基因的兩端引物進(jìn)行PCR檢測也能擴(kuò)增出3912 bp的亮帶（圖7）。證明全長基因AtCesA1基因整合到植物表達(dá)載體pBI1301中。

圖6 植物表達(dá)載體pCAMBIA1301－AtCesA1的雙酶切電泳圖Fig.6 Double enzyme electrophoresismap of plant expression vector pCAMBIA1301－AtCesA1

圖7 AtCesA1植物表達(dá)載體的PCR鑒定 Fig.7 PCR identification of AtCesA1’s expression vector

4 討論

亞麻是世界上最古老的纖維作物之一，亞麻纖維是我國五大麻紡原料之一，其品質(zhì)和價值與苧麻相仿，優(yōu)于黃麻、紅麻和大麻。亞麻纖維強(qiáng)度是棉花纖維的1.5倍，是絹絲的1.6倍，主要用于紡紗織布。提高亞麻纖維素含量，進(jìn)而為提高亞麻品質(zhì)，培育高纖亞麻品種具有重要意義。近年來，有關(guān)植物纖維素合成酶CESA的生物途徑、調(diào)控機(jī)制及其一系列編碼基因已被闡明，纖維素合成酶基因CESA對于提高纖維作物的品質(zhì)具有重要意義。目前，亞麻組織培養(yǎng)、分子標(biāo)記、轉(zhuǎn)基因技術(shù)等在國內(nèi)外已得到了廣泛應(yīng)用，轉(zhuǎn)化效率得到了顯著提高，這些都為纖維素合成酶基因AtCesA1遺傳轉(zhuǎn)化亞麻奠定了基礎(chǔ)。

本研究從模式植物擬南芥中克隆得到了纖維素合成酶基因AtCesA1，并且構(gòu)建了該基因全長的正義表達(dá)載體，為下一步利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將纖維素合成酶基因?qū)雭喡椋M(jìn)而改善亞麻纖維質(zhì)量及提高亞麻纖維產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。

［1］龍德樹，楊傳強(qiáng)，曾憲慶，等.亞麻和胡麻纖維的性能研究［J］.紡織學(xué)報，1999，20（3）：136－139

［2］孟成生，王志偉，張俊紅，等.棉花與擬南芥纖維素合成酶基因家族的生物信息學(xué)比較［J］.貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（7）：39－41.

［3］尉芹，馬希漢.魔芋開發(fā)利用研究綜述［J］.西北林學(xué)院學(xué)報，1998，13（3）：62－67.

［4］柏巧明，何波，陳建華，等.魔芋屬藥植資源的研究［J］.湖北農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2000，20（3）：213－214.

［5］劉紅.魔芋的藥用研究進(jìn)展［J］.湖北民族學(xué)院學(xué)報：醫(yī)學(xué)版，2002（3）：35－37.

［6］林慶華，馮麗霞，黃天文.魔芋的藥用價值及應(yīng)用態(tài)勢［J］.實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2003，17（4）：259.

［7］Samb rook J，F(xiàn)ristch E F，Mantiatis T.Molecular Clonging：A Laboratory Manual.Beijing Science Press，1996.

Cellulose Synthase Gene AtCesA1’s Expression Vector Construction of Transform ing Flax

LIU Yan1，2
（1.Northeast Forestry University，Harbin 150040，China；2.Industrial Crops Institute of Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences，Harbin 150086，China）

In order to introduce cellulose synthase gene into flax by agrobacterium mediated method，the cellulose synthase geneAtCesA1 was cloned from Arabidopsis thaliana.Sequence analysis showed that the coding region was located between the 277－3523 base，a total of3246 bp，which presumably encoded 1082 amino acids，and the total length of cellulose synthase gene was 3912 bp.The full lengthAtCesA1 cDNA was subcloned into pBI1301 by synonymy mutation，constructing a higher plant expression vector pCAMBIA1301－AtCesA1.The construction of the vectorwas verified by enzyme digestion and PCR identification，which can lay a foundation for further research on the function ofAtCesA1 gene transformation.

flax；cellulose synthase gene；clone；expresstion vector

S563.2

A

1671－3532（2017）02－0057－04

2016－09－26

哈爾濱市科學(xué)技術(shù)局科技創(chuàng)新人才（2013RFQYJ034）；黑龍江省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新工程（2014QN020）；國家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS－19－S03）

劉巖（1983－），男，助理研究員，在讀博士研究生，從事亞麻遺傳育種研究。E－mail：sharpen1983＠163.com