陳中平李俊龍余 文王 箭鄒正渝汪 婷，3謝國明＊

（1.重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶400050；2.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室，重慶400016；3.重慶市涪陵中心醫(yī)院檢驗科，重慶408099）

基于DNA－AuNPs信號放大的腸出血性大腸埃希菌快速檢測電化學(xué)生物傳感器

陳中平1李俊龍2余 文2王 箭2鄒正渝1汪 婷2，3謝國明2＊

（1.重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，重慶400050；2.重慶醫(yī)科大學(xué)臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室，重慶400016；3.重慶市涪陵中心醫(yī)院檢驗科，重慶408099）

快速檢測腸出血性大腸埃希菌（EHEC）有利于疾病的早期診斷，為醫(yī)生合理使用藥物提供指導(dǎo)。本實驗基于DNA修飾的金納米粒子（DNA－AuNPs）與亞甲藍(lán)（MB）結(jié)合進(jìn)行信號放大構(gòu)建了一種靈敏的電化學(xué)生物傳感器。采用透射電鏡（TEM）和紫外可見吸收光譜（UV－Vis）對該生物傳感器的修飾進(jìn)行表征，利用交流阻抗法（EIS）、循環(huán)伏安法（CV）和差分脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行電化學(xué)性能檢測。該方法的檢測范圍是100pM到50nM，檢測限為75pM（S／N＝3）。與傳統(tǒng)細(xì)菌分離培養(yǎng)方法相比，該方法具有快速、靈敏等優(yōu)點，對EHEC的早期診斷有著巨大潛力。

腸出血性大腸埃希菌 16SrRNA基因 電化學(xué)生物傳感器 DNA－AuNPs擴(kuò)增部件

1 引言

O157：H7型腸出血性大腸桿菌（EHEC）是食源性疾病中最危險的致病因素之一。它產(chǎn)生的志賀樣毒素能引起危及生命的腸道感染，例如痢疾［13］。此外，EHEC還可以引起其他危機(jī)生命的并發(fā)癥，例如伴隨著長期后遺癥的溶血性尿毒綜合癥（HUS）［4］。自從O157：H7型腸出血性大腸桿菌由美國第一次報道，與該細(xì)菌相關(guān)疾病的爆發(fā)率、死亡人率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢［5］。致病菌傳統(tǒng)的檢測方法包括以下幾個基本步驟：選擇性培養(yǎng)，革蘭染色，生化或者血清學(xué)實驗。這些方法仍然被認(rèn)為是微生物檢測的金標(biāo)法［6］。然而這些方法屬于勞動密集型，而且通常需要4到7天才能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。

分子診斷是一種從分子層面對生物標(biāo)記物進(jìn)行分析的方法［79］。分子診斷被廣泛運用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，包括傳染病學(xué)、腫瘤學(xué)、人類白細(xì)胞抗原分型和預(yù)測藥物療效的藥物基因組學(xué)，這與醫(yī)學(xué)檢驗（體液檢測）有交叉之處［1012］。16SrRNA是原核核糖體小亞基的組成部分，分析檢測16SrRNA可用于細(xì)菌種類分類和傳染性疾病的分子診斷［1315］。在本研究中，我們從美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）挑選出腸出血性大腸桿菌16SrRNA的編碼基因作為目標(biāo)物（Target）。

金納米粒子（AuNPs）是一種穩(wěn)定的納米材料擁有很好的生物相容性，它可以與很多生物分子共軛結(jié)合并且不改變這些分子的性質(zhì)和活性。正因如此，DNA修飾在金納米粒子上被廣泛運用于生物分析方法［1618］。亞甲藍(lán)（MB）在生物學(xué)和化學(xué)被廣泛利用，它可以被用作染色劑和藥物［19］，是一種具有電活性的有機(jī)染料，可以與DNA通過三種模式結(jié)合，包括與脫氧核糖磷酸骨架靜電作用，嵌入雙鏈DNA的堿基對和與單鏈DNA暴露的鳥嘌呤殘留特異性結(jié)合［20］。因為MB的電活性和能嵌入核酸的特性，它被用來作為信號分子［21］。

本實驗建立了一種簡單靈敏的電化學(xué)方法用于EHEC基因檢測，如圖1所示，這種方法基于MB的電化學(xué)特性，MB可以堆積到結(jié)合有DNAAuNPs的金電極（Au）表面并作為指示劑。首先，硫醇化的捕獲探針（CP）通過金硫鍵結(jié)合到金電極表面。然后Target通過堿基互補與CP結(jié)合。檢測探針（DP）與AuNPs同樣通過金硫鍵結(jié)合形成DP－AuNPs信號擴(kuò)大部件。DP－AuNPs通過與Target另一端結(jié)合從而連接到金電極表面。當(dāng)沒有Target將DP－AuNPs連接到金電極時，只有少部分MB靠近金電極表面，得到一個較小的電化學(xué)信號。然而，當(dāng)DP－AuNPs通過Target連接到金電極表面時，大量的MB通過與DP－AuNPs結(jié)構(gòu)結(jié)合而靠近金電極表面，得到一個較大的信號。因此，Target能夠通過DNA－AuNPs結(jié)構(gòu)有效的信號擴(kuò)大作用被靈敏的檢測。

圖1 電化學(xué)生物傳感器檢測原理圖

2 實驗部分

2.1 試劑與儀器

四氯代氫金合三水化物（HAuCl4·3H2O）和三氯乙基磷酸酯（TCEP），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；6－巰基－1－己醇（MCH），亞甲藍(lán)（MB），過硫酸銨（AP）和四甲基乙二胺（TEMED），美國西格瑪公司；核酸染料（HGV－Ⅱ），北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；加樣緩沖液，大連寶生物工程有限公司；核酸；上海生工生物工程有限公司。Target：5＇－ATG AAG AAG GCC TTC GGG TTG TAA AGT ACT TTC AGC GGG GAG GAA GGG AGT AAA GTT AAT ACC TTT GCT CAT TGAC－3＇；捕獲探針（CP）：5＇－CTG AAA GTA CTT TAC AAC CCG AAG GCC TTC TTC AT－（CH2）6－SH－3＇；檢測探針（DP）：5＇－SH－（CH2）6－GTC AAT GAG CAA AGG TAT TAA CTT TAC TCC CTT CC－3′。

電化學(xué)工作站：CHI660D，上海辰華儀器有限公司；紫外可見吸收光譜儀：NANO－DROP1000，美國賽默飛世爾科技公司；投射電子顯微鏡：H600，日本日立公司；電泳儀：DYY－6C，北京市六一儀器廠；成像儀：美國伯樂公司。

2.2 DP－AuNPs復(fù)合物的制備

AuNPs（20nm）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的檸檬酸鹽法制備［22］。首先將50mL質(zhì)量體積比為0.01%的四氯金酸溶液加熱到沸騰，同時伴隨著強(qiáng)烈的攪拌。然后2mL質(zhì)量體積比為1%檸檬酸三鈉快速加入沸騰的溶液中。當(dāng)溶液的顏色從淡黃色變?yōu)榫萍t色時說明AuNPs形成。這時停止攪拌并將溫度恢復(fù)到室溫，溶液放入棕色瓶中儲存在4℃環(huán)境備用。同樣，根據(jù)之前報道過的方法將DP核酸修飾在AuNPs上。在將DP合成到AuNPs表面之前，硫醇化的DP用100倍的TCEP在室溫下處理1小時激活。然后15μL濃度為100μM的DP與500μL的AuNPs混合并在4℃孵育12小時，孵育后，加入1%的SDS10μL以穩(wěn)定AuNPs，后在室溫下震蕩1小時。然后在12小時的時間緩慢加入50μL濃度為0.5M的NaCl，以便形成DP－AuNPs。溶液用離心機(jī)在12000轉(zhuǎn)／分的速度下離心30分鐘，去上清液以分離未結(jié)合的試劑。DP－AuNPs再用0.01M的磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4）清洗并離心分離，重復(fù)3次。最終所得的DP－AuNPs用2×的SSC雜交液重懸后保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 傳感器的制備和檢測

電化學(xué)電極陣列制備流程見圖1。首先用直徑為0.3和0.05微米的氧化鋁粉末輕輕的打磨柱狀金電極直至光滑成鏡面，然后把打磨好的金電極放在去離子水、無水乙醇、去離子水中分別超聲10分鐘。然后電極表面用新鮮配置的食人魚溶液（98%的H2SO4與30%的H202體積比3∶1）處理10分鐘并用去離子水清洗干凈。隨后，將10μL的CP溶液滴加在金電極上，蓋上蓋防止液體蒸發(fā)及避光，室溫放置14小時，探針通過Au－S鍵固定在金電極上，接著用去離子水清洗。然后滴加1mM的MCH溶液在探針修飾后的金電極上，室溫1小時，封閉上金電極上未結(jié)合的位點并把探針鏈支撐起來，用去離子水清洗去除未結(jié)合的多余MCH。再10μL不同濃度的Target溶液繼續(xù)滴加在探針修飾的電極上，37度溫育2小時，靶探針是金電極上固定的捕獲探針堿基互補配對的單鏈，因此，加入的靶探針能夠與其互補配對形成直立的雙鏈DNA，用去離子水清洗。隨后10μL的DP－AuNPs滴加到電極上，37度溫孵育2小時，用去離子水清洗。

檢測之前，將電極浸入10mL濃度為20mM包含20μM的MB和20mM氯化鉀的Tris－HCl緩沖溶液（pH 7.4）5分鐘，后用去離子水清洗。電化學(xué)工作站差分脈沖伏安法檢測，參數(shù)為：初始電位，－0.60V；終止電位，0.10V；電位增量，0.004 V；振幅，0.05s；脈沖寬度，0.05s；采樣寬度，0.0167s；脈沖周期，0.2s和靜置時間，2s。

3 結(jié)果與討論

3.1 AuNPs和DP－AuNPs的表征

采用透射電鏡（TEM）和紫外可見吸收光譜（UV－vis）對AuNPs和DP－AuNPs進(jìn)行形態(tài)學(xué)表征。如圖2A所示，AuNPs的投射結(jié)果顯示AuNPs呈均勻分布的球形，平均尺寸在20nm左右。同時，采用紫外可見吸收光譜AuNPs和DP－AuNPs進(jìn)行表征（圖2B）。單純的AuNPs特征性的吸收峰在515nm處（曲線a）。當(dāng)用硫醇化的檢測探針DP修飾后，由于粒子間的等離子體激元耦合，DPAuNPs的特征性吸收峰紅移了9nm達(dá)到524nm（曲線b）。結(jié)果與之前的報道相一致［18，21］。這些結(jié)果都表明DP成功的修飾在了AuNPs表面。

圖2 AuNPs和DP－AuNPs光學(xué)表征

3.2 核酸雜交的凝膠電泳表征

聚丙烯凝膠電泳用以證實Target與CP和DP的雜交（圖3）。圖中條帶1到3分別表示Target，CP和DP。當(dāng)Target與CP雜交后產(chǎn)生了新的條帶條帶4，Target與DP雜交后產(chǎn)生了新的條帶5。電泳結(jié)果顯示Target能夠成功的與CP和DP雜交，實驗中所用到的DNA濃度都是1μM。

圖3 核酸雜交電泳表征

3.3 生物傳感器的電化學(xué)表征

圖4A顯示的是電極層層修飾過程。電極表面生物膜的形成影響電極的絕緣性質(zhì)，從而導(dǎo)致電阻的變化，因此可利用電化學(xué)阻抗譜（EIS）分析法進(jìn)一步反映電極表面的修飾過程。圖4B顯示的是采用Randles模式進(jìn)行等效電路擬合后的阻抗譜，在電壓變化高頻區(qū)，阻抗譜呈半圓形，表示電化學(xué)體系中界面電子傳遞受限的情況；在電壓變化低頻區(qū)，阻抗譜呈直線形，表示溶液中電子擴(kuò)散受限的過程。結(jié)果顯示裸金電極（曲線a）電阻較小。與裸金電極相比，修飾了CP的電極（曲線b）電阻明顯增加，這是由于CP在電極表面有阻止子傳遞的作用。在電極上進(jìn)一步修飾封閉劑MCH（曲線c）后，阻抗值進(jìn)一步增大，表明電極表面電子阻礙作增大。在加入Target后，電極（曲線d）阻抗繼續(xù)增加，表面Target與CP雜交。當(dāng)加入DP－AuNPs復(fù)合物后，DP－AuNPs靠近電極阻礙電子傳遞，電極（曲線e）阻抗增加明顯。

在含有5mmol·L－1［Fe（CN）6］3－／4－和0.1 mol·L－1KCl的PBS（pH 7.4）中，對傳感器的不同修飾過程進(jìn)行了循環(huán)伏安法（CV）測定。如圖4C所示，［Fe（CN）6］3－／4－在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)，裸金電極出現(xiàn)一對較大可逆的氧化還原峰（曲線a），在電極表面修飾上CP后，電極的氧化還原峰電流略有降低（曲線b），這是由于核酸修飾在電極上阻礙了電子傳遞。在CP／Au表面繼續(xù)修飾MCH封閉后，氧化還原峰電流進(jìn)一步降低（曲線c）。當(dāng)在電極表面結(jié)合了Target之后，電極的氧化還原峰電流同樣下降（曲線d）。最后加入DPAuNPs，電流下降（e），表明層層修飾成功。

圖4 生物傳感器層層組裝電化學(xué)表征

3.4 實驗條件優(yōu)化

為了使該生物傳感器達(dá)到最佳分析能力，實驗對CP固定的濃度和固定時間進(jìn)行了優(yōu)化。如圖5A所示，隨著CP濃度增加，電信號也跟著增加，當(dāng)CP濃度達(dá)到1μM時，信號值達(dá)到高峰。隨后，繼續(xù)增加CP的濃度對信號變化影響不明顯，表明過高的CP表面密度可產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)，降低雜交效率。因而實驗采用的CP濃度為1μM，并運用于剩下的實驗。同時探究了CP固定時間（6－18h）對信號大小的影響（圖5B）。保持其他的實驗條件相同，電信號隨著固定時間的增加而上升。但是超過14小時后信號隨固定時間的增加反而下降，所以14 h作為最佳固定時間。

圖5 實驗條件優(yōu)化

4 生物傳感器的分析性能

在最優(yōu)化實驗條件下，本方法的分析性能用示差脈沖伏安法（DPV）進(jìn)行評估。根據(jù)0nM到200 nM不同濃度的Target檢測得到的結(jié)果顯示在圖6A。圖6B說明隨著Target濃度增加，信號也跟著增加。當(dāng)Target濃度在100pM到50nM范圍時，信號的增加與Target濃度的對數(shù)有比較好的線性關(guān)系，其回歸方程為：ΔI（μA）＝－57.587＋ 35.307 log［C（pM）］，相關(guān)系數(shù)為0.9975，檢測限為75pM（S／N＝3）。

圖6 生物傳感器檢測性能分析

5 結(jié)論

本實驗建立了一種靈敏的電化學(xué)傳感器用于EHEC 16SrRNA基因檢測。利用DNA－AuNPs與MB結(jié)合后的信號擴(kuò)大作用。本方法檢測時間短、靈敏度高，擁有低的檢測限75pM和寬的檢測范圍100pM到50nM。同時，我們提出的這種策略只需要簡單的改變相應(yīng)DNA序列就可以用于其他Target檢測。結(jié)果表明我們提出的生物傳感方法在醫(yī)療診斷、食品安全和環(huán)境監(jiān)測方面具有一定的實用價值。

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A rapid electrochemical biosensor for EHEC detection based on DNA－AuNPs signal amplification.

Chen

Zhongping1，Li Junlong2，Yu Wen2，Wang Jian2，Zou Zhengyu1，Wang Ting2，3，Xie Guoming2＊
（1.Department of Clinical Laboratory，Chongqing Municipal Jiulongpo District People’s Hospital，Chongqing400050，China；2.Key Laboratory of Laboratory Medical Diagnostics，Ministry of Education，Department of Laboratory Medicine，Chongqing Medical University，Chongqing400016，China；3.Department of Clinical Laboratory，The Central Hospital of Fuling，Chongqing，Chongqing 408099，China）

Rapid detection of enterohemorrhagic Escherichia coli（EHEC）can facilitate the early diagnosis and provide essential guidance for appropriate usage of medicine.An ultrasensitive electrochemical biosensor was proposed in this study based on methylene blue（MB）combined with DNA－modified gold nanoparticles（DNA－AuNPs）for signal amplification.Transmission electron microscope（TEM）and UVVis absorption spectra were employed to characterize the modification process of the biosensor.Electrochemical impedance spectroscopy（EIS），cyclic voltammetry（CV）and differential pulse voltammetry（DPV）were used to study the electrochemical properties of the sensor.Under optimum conditions，the amperometric signals increased linearly with the target DNA concentrations（100pM to 50nM），and the DNA sensor exhibited a detection limit as low as 75pM（S／N＝3）.Comparing with traditional bacteria cultivation，the proposed biosensor exhibited some advantages，such as short analysis time and high sensitivity，which holds huge potential for early diagnosis of EHEC.

EHEC；16SrRNA gene；electrochemical biosensor；DNA－AuNPs amplification unit

10.3936／j.issn.1001－232x.2017.01.011

2016－08－31

重慶市醫(yī)學(xué)科研計劃項目（20142167）；重慶市渝中區(qū)科技計劃項目（20140108）。

陳中平，男，1970年出生，副主任技師，主要從事生化檢驗技術(shù)方法學(xué)評價、試劑盒研制、即時檢測與生物傳感技術(shù)在臨床應(yīng)用與轉(zhuǎn)化。

謝國明，男，1966年出生，碩士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事即時檢驗與生物傳感技術(shù)研究，E－mail：xiegm059＠foxmail.com；guomingxie＠cqmu.edu.cn。