董海峰 趙 亮 張學(xué)記

（北京科技大學(xué)，北京100083）

研究與討論

癌癥精準(zhǔn)醫(yī)療的瞄準(zhǔn)鏡和雷達之“液體活檢”
——微流控器件—核酸質(zhì)譜集成裝備研制及在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用解決方案

董海峰 趙 亮 張學(xué)記＊

（北京科技大學(xué)，北京100083）

液體活檢通過分析外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）和循環(huán)腫瘤核酸（ctDNA、microRNA）基因的表達和變異，從而獲取腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移和治療的信息，在腫瘤的精準(zhǔn)治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。發(fā)展有效的CTC、ctDNA及microRNA的檢測儀器顯得尤為重要。本文分析了目前國內(nèi)外液體活檢的相關(guān)儀器；介紹了“數(shù)字診療裝備研發(fā)”國家重點專項“微流控器件－核酸質(zhì)譜集成裝備研制及在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用解決方案”的研發(fā)情況。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞 循環(huán)腫瘤核酸 液體活檢 微流控 核酸質(zhì)譜

目前，腫瘤醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中最為重要的研究課題之一就是如何實現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)治療，如何應(yīng)用微量臨床病理樣本進行快速定量的分析。液體活檢就是癌癥精準(zhǔn)醫(yī)療的瞄準(zhǔn)鏡和雷達。液體活檢的標(biāo)志物包含兩部分，一部分是以循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）為典型代表的細(xì)胞水平標(biāo)志物。另一部分是循環(huán)核酸分子水平的標(biāo)志物；另外在分子水平，已有充分的研究證明：游離循環(huán)腫瘤DNA（Cell－free Circulating Tumor DNA，ctDNA），microRNA（miRNA）等核酸指標(biāo)與腫瘤的相關(guān)性最為顯著，其表達模式也與病人預(yù)后相關(guān)，可以進行惡性腫瘤的預(yù)警與早期診斷。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating tumor cell，CTC）是指從實體瘤中脫離出來并進 入外周血液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞。循環(huán)系統(tǒng)中檢測到CTCs提示可能有腫瘤微轉(zhuǎn)移的存在 并有進一步發(fā)展成為遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的可能性，因此對CTCs進行檢測有助于乳腺癌等腫瘤轉(zhuǎn)移的早期診斷、腫瘤治療效果評估、個體化治療方案定制及腫瘤轉(zhuǎn)移機制的研究［1］。凋亡、自噬或壞死的腫瘤細(xì)胞會釋放DNA進入血液循環(huán)系統(tǒng)，這些ctDNA和正常細(xì)胞釋放的DNA同時存在于無細(xì)胞的血漿中，由腫瘤細(xì)胞釋放到血漿中的單鏈或者雙鏈DNA，攜帶有與原發(fā)腫瘤組織相一致的分子遺傳學(xué)改變［2］。數(shù)十年來，科研人員一直都在尋找能夠很好地反映腫瘤情況的生物標(biāo)志物，與蛋白質(zhì)類生物標(biāo)志物相比，循環(huán)DNA的表現(xiàn)應(yīng)該會更好［3］。ctDNA檢測出現(xiàn)假陽性結(jié)果的可能性就要低得多，因為我們不是檢測ctDNA的水平，而是檢測它是否攜帶有腫瘤特異性的突變，或其它基因組改變信息。ctDNA作為一種癌組織潛在替代物，可以用于揭示腫瘤全基因譜，利用ctDNA作為一種新型的 “液相活組織切片”追蹤癌癥基因的信息，作為一種有效的腫瘤標(biāo)志物，非常迫切，前景廣闊［4，5］。miRNA與人類腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，其表達模式也與病人預(yù)后相關(guān)。而且，除了 組織和細(xì)胞中的miRNA，外周血miRNA的表達也表現(xiàn)為顯著的腫瘤相關(guān)性、組織特異性和表達穩(wěn)定性。因而，利用miRNA在不同癌變組織與正常對照之間存在顯著表達差異，可以發(fā)現(xiàn)新的惡性腫瘤生物標(biāo)志物；通過外周血中miRNA的檢測，可以進行惡性腫瘤的預(yù)警與早期診斷［6］。利用ctDNA和miRNA的生物功能進行進行疾病診斷、基因藥物開發(fā)、基因治療等，發(fā)展良好的ctDNA，miRNA分析檢測技術(shù)尤為關(guān)鍵［7，8］。

微流控系統(tǒng)首先采用流體動力學(xué)分離出血細(xì)胞，而后采用慣性聚焦和磁泳技術(shù)分離出白細(xì)胞，最終實現(xiàn)對CTC的富集。目前Veridex公司開發(fā)的CellSearch CTC采用上皮細(xì)胞粘附分子EpCAM磁珠富集腫瘤細(xì)胞，并用細(xì)胞角蛋白CK19鑒定腫瘤細(xì)胞，但不是所有腫瘤細(xì)胞都表達EpCAM，所以假陰性率高。

在質(zhì)譜儀器開發(fā)與檢測方面，國際生產(chǎn)MALDI－TOF質(zhì)譜儀的主要有美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司（ABI）生產(chǎn)的Super Voyager－DE、－STR和4700、沃特斯（Waters）公司生產(chǎn)的MALDI micro MXTM、日本島津（Shimadzu）公司生產(chǎn)的AXIMA PerformanceTM型、德國布魯克（Bruker）公司生產(chǎn)的CLINPROT microflex，還有與MALDI－TOF質(zhì)譜儀類似的美國賽弗吉（Ciphgen）生物系統(tǒng)公司生產(chǎn)的表面增強激光解吸電離（SELDI）／飛行時間（TOF）質(zhì)譜儀PBSⅡ／C和PCS4000。綜上所述，微流控芯片技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的聯(lián)用和集成化在CTC檢測，ctDNA、microRNA等腫瘤標(biāo)志物的高靈敏檢測方面尚未形成系統(tǒng)的專利和知識產(chǎn)權(quán)，相關(guān)報道不多。可以看出，目前發(fā)達國家和地區(qū)，特別是美國正在精準(zhǔn)醫(yī)療等大項目的推動下緊鑼密鼓地在商品化CTC檢測平臺上布局，我們國內(nèi)目前尚缺乏相關(guān)領(lǐng)域特別是利用微流控芯片作為技術(shù)載體的裝置設(shè)備的跟進。

最近，科技部公布的國家重點研發(fā)計劃“數(shù)字診療裝備研發(fā)”重點專項立項工作已經(jīng)完成，由北京科技大學(xué)化生學(xué)院傳感中心“千人計劃”張學(xué)記教授牽頭的“微流控器件－核酸質(zhì)譜集成裝備研制及在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用解決方案”以全票通過的形式，獲得科技部“十三五國家重點研發(fā)計劃數(shù)字診療裝備研發(fā)”專項的資助。本項目由北京科技大學(xué)牽頭，軍事科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所、北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院、毅新博創(chuàng)、河南省腫瘤醫(yī)院、大興區(qū)人民醫(yī)院等多家單位共同參與，圖1為微流控芯片－核酸質(zhì)譜集成裝備研制及在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用解決方案流程示意圖。

項目“微流控器件－核酸質(zhì)譜集成裝備研制及在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用解決方案”瞄準(zhǔn)微流控器件和質(zhì)譜技術(shù)的集成整合，進一步完善和開發(fā)器件化平臺，并在裝備研發(fā)成型后通過整合形成應(yīng)用解決方案，對不同層次醫(yī)療機構(gòu)進行投放和適用，最終形成臨床指南。通過構(gòu)建微流控器件裝置和相應(yīng)的質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，將能夠在器件上完成對極微量的同一臨床樣品中的ctDNA、miRNA及CTC多指標(biāo)精準(zhǔn)定量，最大程度地提高信息獲取的通量，實現(xiàn)腫瘤早期診斷以及藥物療效分析。針對腫瘤精確診斷和精準(zhǔn)治療，形成微流控芯片－核酸質(zhì)譜集成裝備在乳腺癌、肺癌中的臨床應(yīng)用解決方案；對此臨床應(yīng)用解決方案進行循證評價，并在各級臨床醫(yī)療單位進行試用和推廣，為進入臨床指南奠定基礎(chǔ)。通過構(gòu)建微流控器件裝置和相應(yīng)的質(zhì)譜檢測系統(tǒng)，將能夠在器件上完成對極微量的臨床樣品的腫瘤早期診斷以及藥物療效分析，用最少的取樣完成最大程度的生物信息提取，在臨床上最大程度地減小對病人的創(chuàng)傷，最大程度地提高信息獲取的 通量并強調(diào)同一樣本多指標(biāo)精準(zhǔn)定量，微量核酸檢測分析、單細(xì)胞水平基因信息，是對精準(zhǔn)醫(yī)療指導(dǎo)思想的直接實踐和完美闡釋。本項目為腫瘤的精確診斷和精準(zhǔn)治療提供一種新型的應(yīng)用解決方案，提高腫瘤患者的生存質(zhì)量，延長生存時間；對提升我國在精確診斷和精準(zhǔn)治療裝備方面的競爭優(yōu)勢有重要意義。

圖1 微流控芯片－核酸質(zhì)譜集成裝備研制及在腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用解決方案流程示意圖

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Liquid biopsy：the gunsight and radar of precision medicine－fabrication of microchip－nucleic acids mass spectra equipment and its application in precision medicine.

Dong Haifeng，Zhao Liang，Zhang Xueji＊

（University of Science and Technology Beijing，Beijing China，100083，China）

Liquid biopsy，that is，analysis of gene mutations and expression related to tumorigenesis，metastasis and therapy on circulating tumor cells（CTC）and cell－free circulating tumor DNA（ctDNA）or microRNA released into the peripheral blood from metastatic deposits，hold a great promise in precision medicine.Developing efficient detection equipment is significant.We analyze the recent processes in the“l(fā)iquid biopsy”instrument.Specially，we discuss the project of“Fabrication of Microchip－Nucleic Acids Mass Spectra Equipment and its Application in Precision Medicine”，which is one of the state key project of“Research of Digital Theranostic Equipment”.

circulating tumor cells；cirulating tumor nucleic acids；liquid biopsy；microfluidic；nucleic acids mass spectra

10.3936／j.issn.1001－232x.2017.01.010

2016－10－19

董海峰，男，1982年出生，博士，教授／博導(dǎo)，主要研究領(lǐng)域：生物分析與生物傳感，E－mail：hfdong＠ustb.edu.cn。