陳亞菲 高 鑫 張雅楠 王洪凱 王明山

（棗莊學院 山東 棗莊 277160）

金線蛙不同時期蝌蚪骨骼的雙染色研究

陳亞菲 高 鑫 張雅楠 王洪凱 王明山*

（棗莊學院 山東 棗莊 277160）

本文對金線蛙不同發(fā)育時期蝌蚪的后肢骨進行雙重染色，研究其骨骼的發(fā)育。結果顯示，金線蛙后肢骨的發(fā)育模式基本遵循著由近端到遠端發(fā)育的順序，體現(xiàn)了金線蛙由水棲到陸棲環(huán)境轉換的骨骼系統(tǒng)形態(tài)改變和生態(tài)適應。

金線蛙 蝌蚪 骨骼 雙染色法

金線蛙(Rana plancyi plancyi)在我國分布廣、數(shù)量較多，是害蟲的天敵。兩棲動物代表著脊椎動物發(fā)育的原始模型，蛙的發(fā)育機制與人類等高等動物極為相似，從兩棲動物還可以演繹出爬行動物、鳥類和哺乳動物的不斷改善的發(fā)育進程。金線蛙是典型變態(tài)發(fā)育的兩棲動物，其體發(fā)育過程經(jīng)歷了卵、蝌蚪、幼蟾蜍、成蟾蜍四個階段。在從受精卵發(fā)育到成蟾蜍的變態(tài)過程中會進行骨骼的重構和四肢的發(fā)育，進而成為適應陸生環(huán)境的四足兩棲類。對兩棲動物肢體不同部位的發(fā)育模式及骨化次序進行觀察并研究，并需要掌握好骨骼雙染色法制作標本，為進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

金線蛙卵采自魯南地區(qū)的山東省棗莊市市中區(qū)棗莊學院周圍的小水潭(E116°48′-117°49′，N34°27′-35°19′，海拔191m。蛙卵置于透明玻璃缸內(nèi)，放于向陽處進行馴養(yǎng)，在蝌蚪培育期間(60～90日齡)，每天對蝌蚪進行采樣，每次隨機采集10尾，用顯微鏡或解剖鏡測定全長后立即用5%的福爾馬林溶液進行固定，供日后透明標本制作。

1.2 染色液的配置

1.2.1 茜素紅染色液配制 按100ml的0.3mol/L的氫氧化鉀溶液加入5mg的茜素紅的比例配置成紅色的硬骨染液。

1.2.2 阿利新藍染液 取20mg阿利新藍染料，加人60ml無水乙醇，再加40mI冰乙酸（pH≤1.0）。

1.2.3 脫色液 梯度酒精(25%、50%、75%、100%)。

1.2.4 透明液的配制 （1）透明液一：丙三醇20ml、蒸餾水77ml、2%氫氧化鈉溶液3ml混合而成。（2）透明液二：丙三醇75ml、蒸餾水25ml。（3）透明液三：100%的丙三醇100ml。

1.2.5 胰酶溶液 30ml飽和硼酸溶液+70ml蒸餾水+胰蛋白酶1g。

1.3 染色處理步驟

1.3.1 軟骨染色 首先將用福爾馬林固定的蝌蚪用蒸餾水滴洗數(shù)次直到軟化為止，直接放置于阿利新藍染液中浸泡處理5d，染色時間視軟骨染色程度而定，直至后肢骨骼出現(xiàn)濃青色為止。

1.3.2 脫色 將標本從軟骨染色液中取出，放入脫色液中脫色，接著用95%乙醇水溶液浸泡2h兩次，然后再依次分別用25%、50%、75%、100%的乙醇水溶液各處理2h，最后將標本移入蒸餾水中放置24h直到標本沉下。

1.3.3 去組織處理 經(jīng)蒸餾水浸泡后的標本用胰酶溶液36℃條件下進行去組織處理，每隔2d溶液呈藍色時，及時更換酶溶液，反復多次直至蝌蚪骨骼清晰可見。

1.3.4 硬骨染色 將經(jīng)酶溶液處理后的標本放入茜紅素染液，染色3～5h，直至硬骨染紅為止

1.3.5 褪色和透明 然后將茜紅素染液換成0.5%的NaOH溶液，浸泡數(shù)小時，直至多余染色液完全去除。

1.3.6 脫水和固定 再依次轉換成透明液一、透明液二和透明液三溶液，各處理5h。

1.3.7 觀察 使用配備有數(shù)碼照相機的生物顯微鏡和解剖鏡觀察各日齡蝌蚪骨骼發(fā)育形態(tài)特征，并進行拍照[1,4]。

2 結果

（1）雙染成功的標本，已骨化的骨骼被茜素紅染成紅色或紫紅色，軟骨則被阿利新藍染成藍色，在紅色的骨周圍或兩端都是染成藍色的軟骨，界限明顯，骨骼完好無損。雙染的標本在顯微鏡下可清楚地觀察到骨骼的發(fā)育形態(tài)。（2）金線蛙蝌蚪的后肢(hind limb)是由股骨(femur)、脛腓骨(tibio-ibula)、跗 骨 (tarsus)、蹠骨(metatarsus)、趾骨(phalanges)。（3）股骨為股部的一根棒狀硬骨，其近端呈圓球狀，與髂臼連接，稱股骨頭，股骨頭嵌入髖臼構成髖關節(jié)，遠端與脛腓骨相關節(jié)。股骨的長度隨時間的增長有所增加，軟骨性股骨的骨干逐漸骨化，股骨骨干的骨化由中央的骨干向兩端逐漸延伸。到圖三時期，股骨的骨干已完全骨化，但兩端骨骺仍未骨化[5]。（4）脛腓骨為脛部的一根長骨，骨干內(nèi)外兩面中間各有一條淺縱溝，表明此骨系由脛、腓兩骨合并而成，其近端與股骨形成膝關節(jié)，遠端與跗骨相關節(jié)。稍長于股骨。（5）跗骨(2-I)5枚，排成2列。與脛腓骨相關節(jié)的是一堆短棒狀骨，外側的為腓跗骨(跟骨)，內(nèi)側的稱脛跗骨(距骨)，兩骨上端愈合，下端相互靠攏。另3枚呈顆粒狀，在跟骨、距骨和跖骨之間排成一橫列。（6）蹠骨(2-II)為5支細長骨節(jié)，第4支最長，第3支和第5支次之，第2支又次之，第1支最短。（7）趾骨(2-III)是與蹠骨相連的骨節(jié)，趾節(jié)向遠端逐漸細小，每個隊、趾各關節(jié)兩端都覆以軟骨髓。后肢五趾，第1、2趾有2枚趾骨，第3、5趾有3枚趾骨，第4趾有4枚趾骨[6]。

1.Cosner39期，附骨出現(xiàn)，而且脛骨和膝骨兩端逐漸有愈合現(xiàn)象; 2.Cosner40期，趾骨以3-4-3-2-2的排列模式出現(xiàn)，而且可觀察到前拇趾的第二趾骨; 3.Cosner43期，趾骨已完全骨化，但前拇趾及遠端趾骨仍未骨化

3 討論

金線蛙后肢骨的發(fā)育模式基本遵循著由近端到遠端發(fā)育的順序。變態(tài)過程中后肢股骨與脛腓骨相對長度的變化趨勢是幼蛙登陸的重要指標。兩棲類蝌蚪的形態(tài)在多樣性的變態(tài)過程中，后肢脛腓骨的愈合體現(xiàn)了無尾類骨骼發(fā)育的保守性，以及由水棲到陸棲環(huán)境轉換的骨骼系統(tǒng)形態(tài)改變和生態(tài)適應。兩棲動物變態(tài)過程中骨骼的骨化增加了骨密度，導致支撐能力增強，也進一步解決了無尾目動物由水生到陸棲身體重量擔負問題。

3.1 染液的配制和保存

用蒸餾水配制茜素紅飽和液(即原液)時并不需要精確稱量，配制好后轉入棕色試劑瓶中避光保存。茜素紅染液、阿利新藍染液均要求常溫避光保存，否則會致標本著色過淺或無法著色。

3.2 染色和透明處理

在進行軟骨染色時，要在強陽光下進行，如果遇到陰天，則需要借助紫外光的照射。用透明液進行透明時，時間不要過長，應定時觀察標本情況，時間過長會導致骨骼過軟而散掉。

3.3 染色后標本的保存

為便于對染色后標本骨骼的觀察，可用寬底的玻璃稱量瓶(40mm×40mm)裝標本，這樣既便于觀察，同時能防止染液被蒸發(fā)，但應注意在一個容器內(nèi)不要放置過多的標本，最好是每瓶1～2個，因為標本過多，過于擁擠會延長染色時間。對于已有部分損傷的標本，如尾部斷開、四肢與軀干分開的標本，則每個瓶只裝一個。沒有經(jīng)過脫水處理的標本，容易發(fā)生霉變，從而影響觀察。因此，雙染成功的標本經(jīng)過逐級梯度甘油進行透明和脫水后，加入100%甘油保存，同時加少許麝香草酚以防腐?？傊?，骨骼雙染標本的制作，為動物學的骨骼研究、比較解剖學的研究和實驗教學提供了直觀、真實的形態(tài)學素材，在實驗教學中能激發(fā)學生的學習興趣，使學生對動物骨骼的發(fā)育過程和各骨的位置關系有更直觀的認識，同時骨骼雙染的標本可以長期保存作為陳列和展覽所用。

[1] 劉萬勝, 黃明輝, 劉力華等. .青蛙骨骼染色透明標本的制作及應用[J]. 現(xiàn)代預防醫(yī)學, 2008, 39(9)∶ 1700-1701.

[2] 薛大勇. 動物標本采集、保藏、鑒定和信息共享指南[M]. 北京∶中國標本出版社, 2005, 158-160.

[3] 張宏, 李嘯紅. 大鼠骨骼雙染標本的制作方法[J]. 重慶醫(yī)學, 2012. 11(2), 153-157.

[4] 王秋榮, 倪明瑩, 林利民等. 大黃魚仔稚魚脊柱、胸鰭及尾鰭骨骼系統(tǒng)的發(fā)育觀察[J]. 水生生物學報, 2010, 34(3)∶ 467-469.

[5] 高麗芳, 王宏元, 梁剛. 中華大蟾蜍蝌蚪后肢骨的發(fā)育及骨化順序研究[J]. 四川動物, 2015, 34(3)∶ 345-351.

[6] 戈志強. 生物學形態(tài)實驗指導[M]. 蘇州∶ 蘇州大學出版社. 2010, 122-124.

[7] 楊飛虹, 王宏元, 梁剛. 中華大蟾蜍蝌蚪變態(tài)過程中肩帶與前肢的發(fā)育及骨化次序[J]. 動物學雜志, 2015, 50(3)∶ 372-380.

本 刊 聲 明

1．本刊已許可中國學術期刊(光盤版)電子雜志社在中國知網(wǎng)及其系列數(shù)據(jù)庫產(chǎn)品中以數(shù)字化方式復制、匯編、發(fā)行、信息網(wǎng)絡傳播本刊全文，作者向本刊提交文章發(fā)表的行為即視為同意我刊上述說明，作者若不同意，請在投稿時說明。

2．本刊文章版權所有，未經(jīng)書面許可，不得以任何形式轉載。

山東畜牧獸醫(yī)編輯部

S966.3+9

A

1007-1733(2017)03-0006-02

2016-04-05）

*通訊作者