陳宇飛，楊 柳，杜德偉，王 磊，孫如一，隋 馨

（1.吉林工商學院食品工程學院，吉林長春 130507； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118；3.吉林省醫(yī)療器械檢驗所，吉林長春 130062）

寵物食品中肉毒桿菌LAMP檢測方法的研究

陳宇飛1，楊 柳1，杜德偉1，王 磊1，孫如一2，隋 馨3

（1.吉林工商學院食品工程學院，吉林長春 130507； 2.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，吉林長春 130118；3.吉林省醫(yī)療器械檢驗所，吉林長春 130062）

為研究寵物食品中肉毒桿菌環(huán)介導恒溫擴增（LAMP）檢測方法，本試驗根據(jù)肉毒桿菌特異性基因片段（NtnH）設計1組引物，應用LMAP技術，通過擴增肉毒桿菌和14種非肉毒桿菌基因片段，對建立的LAMP反應體系進行最佳溫度及反應時間篩選試驗、采用濁度法和染色法進行特異性試驗以及與PCR對比的敏感性試驗。結果表明：建立的LAMP反應體系只擴增肉毒桿菌基因，特異性良好；體系最佳反應溫度為64℃，最佳反應時間為60 min；最低檢測濃度為0.0001 pg/μL，比PCR高出10倍。本試驗所建立的方法特異性好、靈敏度高，反應時間短，適用于寵物食品中肉毒桿菌的檢測。

肉毒桿菌；LMAP技術；PCR；濁度法

肉毒中毒主要是由肉毒桿菌（Clostridium Botulinum）產(chǎn)生的肉毒神經(jīng)毒素引起的一種病死率極高的周圍神經(jīng)麻痹性疾病[1]。肉毒桿菌按其產(chǎn)生毒素的血清學特性可分為A～G 7個型，其中引起人肉毒中毒的主要是A、B、E 3個型，且不同的國家及地區(qū)肉毒中毒的型別具有地域性差別，我國以A型的發(fā)生頻率居首位[2]。肉毒毒素對酸的抵抗力特別強，胃酸溶液24 h內不能將其破壞，繼而可被胃腸道吸收，損害身心健康[3]。純的1 mg肉毒毒素能殺死2億只小鼠，毒性極大。

寵物食品專門為寵物、小動物提供，是介于人類食品與傳統(tǒng)畜禽飼料之間的高檔動物食品[4]。若寵物食品及其原料污染了肉毒桿菌，其產(chǎn)生的菌毒素A將會對寵物造成極大的傷害。近些年，寵物市場逐步興起，因此寵物食品中肉毒桿菌的檢測對寵物保健行業(yè)的發(fā)展十分重要。

Notomi等[5]在2000年發(fā)明環(huán)介導恒溫擴增技 術（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP），可以在等溫條件下實現(xiàn)核酸擴增。LAMP技術的反應原理是根據(jù)序列保守區(qū)域設計的1對外引物、1對內引物和1對環(huán)引物特異性識別靶序列上的6個獨立區(qū)域，在Bst大片段聚合酶的作用下引起自循環(huán)鏈置換反應，在60～65℃條件下60 min內，大量合成目標DNA 的同時，伴隨有副產(chǎn)物白色的焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生。由于LAMP擴增過程依賴識別靶序列6個獨立區(qū)域，所以反應特異性強。核酸擴增過程是在恒溫條件下進行，檢測時間大大縮短，反應快速敏感。目前，LAMP技術在細菌和病毒檢測、耐藥基因檢測[6]、寄生蟲檢測[7]、胎兒性別鑒定等方面被廣泛應用。黃金海等[8]研究了食品中沙門菌LAMP 快速檢測方法，可用于沙門氏菌污染食品的快速檢測；孫園園等[9]建立了動物飼料中沙門菌LAMP快速診斷方法，對24份樣品的3次檢測結果與國標法完全一致；苑昊[10]將LAMP技術與微流控技術結合，檢測環(huán)境中的金黃色葡萄球菌，使DNA的釋放、擴增以及結果的觀察集成在一個長寬均為厘米級別的芯片中，完成高通量的檢測。本研究根據(jù)肉毒桿菌特異性基因序列，建立寵物食品中肉毒桿菌LAMP快速檢測方法，專門對寵物食品及原料進行特異性檢測，對肉毒桿菌的監(jiān)測具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌種 菌種來源于北京博奧晶典生物技術有限公司，菌種的活化、核酸提取等在該公司的二級病原微生物實驗室完成。

1.2 試劑與儀器 LAMP法熒光檢測試劑盒（DNA Amplification Kit）產(chǎn)自日本榮研化學株式會社；LAMP反應管（Reaction Tube）產(chǎn)自日本榮研化學株式會社；熒光染料（Fluorescent Detection Reagent，F(xiàn)D）產(chǎn)自日本榮研化學株式會社；Chelex-100、甜菜堿來自Sigma 公司；氯化錳、硫酸鎂、氯化鉀、氫氧化鈉、EDTA、硫酸銨購自國藥集團化學試劑有限公司；Tris-HCl來自上海生科生物科技有限公司； Triton X-100來自北京美萊博醫(yī)學科技有限公司；dNTP來自Pharmacia公司；NP-40來自Fluka公司；2×Tap MIX試劑盒產(chǎn)自天根生化科技（北京）有限公司；瓊脂糖來自Amresco公司。

La-320C實時濁度儀來自日本榮研化學株式會社；CHB-100HB-100型恒溫金屬浴來自杭州博日科技有限公司；NanoDrop ND-1000型分光光度計來自凱樂博（北京）科技發(fā)展有限公司；ST5型凝膠成像儀來自VILBER公司；ETC811型基因擴增儀來自蘇州東勝興業(yè)科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA 模板的制備 使用TIANGEN 核酸提取試劑盒，按照試劑盒說明書提取細菌基因組 DNA。其中通過對肉毒桿菌基因序列進行生物信息學分析，自行設計肉毒桿菌靶基因序列，并對此靶序列在美國NCBI數(shù)據(jù)庫（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）進行比對檢索，其特異性較好。根據(jù)該基因序列，人工合成該基因片段。

1.3.2 LAMP反應引物的設計 根據(jù)LAMP引物設計軟件網(wǎng)址（http://primerexplorer.jp/e/）進行LAMP引物設計，將待擴增的DNA 分為6個獨立區(qū)域，根據(jù)這6個區(qū)域分別設計LAMP 反應所需引物（內引物FIP和BIP、外引物F3和B3、環(huán)引物LB和LF），設計LAMP引物擴增靶基因：

肉毒桿菌基因序列片段及引物合成由上海生工生物科技有限公司完成。

1.3.3 LAMP 反應體系的建立 25 μL反應混合物包括：12.5 μL 2×反應液(終反應液離子濃度：20 mmol/L Tris-HCl ,pH為 8.8，10 mmol/L KCl，10 mmol/L（NH4）2SO4，0.1% Triton X-100，0.8 mol/L 甜菜堿，8 mmol/L MgSO4，1.4 mmol/L dNTP)，1 μL 8 U Bst DNA 聚合酶，2.6 μL引物混合液（終引物濃度：40 pmol/L FIP 和BIP，5 pmol/L F3 和B3，20 pmol/L LB和LF），2 μL引物模板，6.9 μL雙蒸水補齊 。將混合物置于60～65℃恒溫反應60 min左右。以雙蒸水為陰性對照。

表1 試驗用對照菌種

1.3.4 LAMP檢測方法 濁度法的反應過程:

其中，Mg2P2O7為焦磷酸鎂，為白色沉淀。利用實時濁度儀LA-320c進行實時測量，每隔6 s測定反應管的濁度，繪制成曲線來判斷反應的陰陽性。

熒光染色法：鈣黃綠素是一種金屬離子指示劑，根據(jù)反應液中鎂離子的變化而呈現(xiàn)出不同的顏色，陰性時為橙色，陽性時為綠色。

1.3.5 最佳溫度篩選試驗 利用建立的LAMP反應體系，對引物進行最佳溫度篩選試驗，設置溫度從60～67℃，梯度為1℃，根據(jù)起峰時間和出峰高點，測定LAMP最佳反應溫度。

1.3.6 特異性試驗 利用建立的LAMP反應體系，肉毒桿菌基因組為陽性樣品，以福氏志賀氏菌、大腸埃希氏菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、糞腸球菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、停乳鏈球菌、蠟樣芽孢桿菌、肺炎鏈球菌、屎腸球菌、副溶血性弧菌、表皮葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌、乳房鏈球菌等14株菌（表1）以及雙蒸水樣品作為對照，進行特異性試驗。

1.3.7 LAMP 、PCR方法敏感性對比試驗 為了驗證LAMP 方法的檢測靈敏度，以肉毒桿菌基因組為檢測對象，定量后將總DNA進行10 倍稀釋度稀釋，使得最終核酸濃度分別為1、100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001 pg/μL，并以雙蒸水作為陰性對照。然后進行LAMP反應，分別采用染色法和濁度法來檢測結果。

將10倍梯度稀釋的基因組用于PCR反應。引物為F3、 B3。PCR 反應總體積25 μL：1 μL模板、10 pmol各引物、12.5 μL 2×Taq MIX。擴增循環(huán)條件：95℃預變性5 min，之后95℃變性30 s；55℃退火30 s；72℃延伸30 s，共30個循環(huán)，最后延伸7 min。取PCR 產(chǎn)物10 μL，在1%含EB瓊脂糖凝膠電泳上120 V 電泳35 min，在凝膠成像系統(tǒng)下照像檢測。

2 結果與分析

2.1 最佳溫度篩選 由圖1可以看出，在60～67℃時，都能發(fā)生LAMP反應。但不同溫度下，LAMP反應的起峰時間和出峰高點不同。隨著溫度的升高，呈現(xiàn)出峰時間先縮短，之后再增長的趨勢。當溫度為64℃時，出峰時間最短（18 min）。該溫度下，當LAMP反應60 min時，出峰最高。因此，將最佳溫度定在64℃，反應時間定為60 min。

圖1 最佳溫度篩選試驗結果

2.2 特異性試驗結果 由圖2可以看出，只有肉毒桿菌基因組樣品發(fā)生了LAMP反應，其他14個菌種的核酸及陰性對照樣本均未發(fā)生LAMP反應。因此，可以確定本試驗建立的LAMP反應體系特異性良好。由圖3也可以看出，只有第15號（肉毒桿菌）離心管發(fā)生了顏色反應，即具有較好的特異性。

圖2 特異性試驗結果（濁度檢測）

2.3 最佳引物的敏感性試驗結果及與PCR的比較將10倍梯度稀釋的肉毒桿菌基因組模板用于LAMP反應，檢測結果見圖4～5。濁度法與染色法實驗結果一致，LAMP最低檢測濃度為0.0001 pg/μL。由圖6可知，PCR最低檢測濃度為0.001 pg/μL。可見，LAMP反應的敏感性要優(yōu)于PCR反應。

3 結 論

圖3 特異性試驗結果（目視熒光檢測）

圖4 最佳引物的敏感性試驗結果（濁度檢測）

圖5 最佳引物的敏感性試驗結果（目視熒光檢測）

圖6 PCR敏感性的實驗結果

本文研究了寵物食品中肉毒桿菌LAMP檢測方法。根據(jù)肉毒桿菌特異性基因序列，人工合成肉毒桿菌基因片段，以14種食品中常見細菌作對照，對建立的LAMP反應體系進行溫度篩選試驗、最佳反應時間試驗、采用濁度法和染色法進行特異性試驗以及與PCR對比的敏感性試驗。結果表明，建立的LAMP反應體系只擴增肉毒桿菌，對其他14種食品中常見的細菌均沒有擴增，特異性良好；體系最佳反應溫度為64℃，最早出峰時間為18 min，最佳反應時間為60 min；最低檢測濃度為0.0001 pg/μL，比PCR（0.001 pg/μL）高出10倍。本方法靈敏度高、特異性強、操作簡便，可以用來檢測寵物食品中的肉毒桿菌。

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Study on Detection Method for LAMP Technique in Clostridium Botulinum of Pet Food

CHEN Yu-fei1, YANG Liu1, DU De-wei1, WANG Lei1, SUN Ru-yi2,SUI Xin3
(1.Department of Food Engineering, Jilin Business and Technology College, Jilin Changchun 130507, China; 2. College of Life Science, Jilin Agricultural University, Jilin Changchun 130118, China; 3. Jilin Medical Instrument Inspection Institute, Jilin Changchun 130062,China)

The detection method for LAMP technique in Clostridium botulinum of pet food was studied in the paper. A set of primers was designed according to the specif i c gene(NtnH)fragments of Clostridium botulinum. Through ampilifying gene fragments of Clostridium botulinum and 14 nonClostridium botulinum, screening test of optimum temperature and response time on LAMP reaction system, specif i c test by using nephelometry and staining method, sensitivity test of that compared to PCR were studied. The result demonstrated that LAMP only amplif i ed gene of Clostridium botulinum, and had a good specif i city. The optimum response temperature of the system was 64℃, and the optimum response time was 60 min. The minimum detectable concentration was 0.0001 pg/μL, which was 10 times higher than PCR. The method established by the study had a good specificity and high sensitivity and short response time, which was adapt to the detection for Clostridium botulinum of pet food.

Clostridium botulinum; LAMP technique; PCR; Nephelometry

TS207.4

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-127

2016-11-02；

2016-11-15

中國農(nóng)業(yè)部重點實驗室2016開放基金；吉林省科技廳2015年重點科技攻關項目（20150204064NY）

陳宇飛（1968-），男，教授，本科，主要從事食品安全檢測研究，E-mail:254447088@163.com