梁素蕓，聞治國，謝 明，黃 葦，侯水生*，李復煌

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193 2. 北京市畜牧總站，北京 100107）

綠頭野鴨蛋品質研究及蛋殼強度相關基因的篩選

梁素蕓1，聞治國1，謝 明1，黃 葦1，侯水生1*，李復煌2

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100193 2. 北京市畜牧總站，北京 100107）

本試驗選取體重、周齡一致的100只綠頭野鴨，對其蛋品質進行測定并進行相關分析，測定指標包括蛋殼顏色、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋形指數(shù)、蛋白高度、哈氏單位和蛋黃顏色，同時通過轉錄組測序篩選了與蛋殼強度相關的候選基因。結果表明：不同蛋殼顏色的鴨蛋之間蛋形指數(shù)、蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋白高度和哈氏單位有顯著差異（P<0.05）；綠頭鴨大部分蛋品質性狀之間相關性顯著，其中蛋殼厚度與蛋殼強度呈顯著正相關，相關系數(shù)為0.8742，而蛋殼顏色作為蛋殼強度的衡量指標時，白殼組強度最大，綠殼組次之，黃綠殼組最?。≒<0.01）；通過轉錄組測序對蛋殼強度進行差異表達模式對比分析，共找到差異表達基因325個，其中149個基因表達量上調， 176個基因表達量下調，與蛋殼強度相關的基因有CACNA1I、CACNB4、CALN、CACNA1S、LOC101801793等17個基因,這些基因主要參與了鈣離子跨膜轉運、鈣離子結合、鈣離子釋放等生物學過程，本研究結果為進一步研究蛋殼強度差異的分子機理提供了基礎。

綠頭野鴨；蛋品質；轉錄組測序；基因篩選

禽蛋品質直接關系到禽蛋產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和人類的健康生活，蛋殼的破損會給禽蛋產(chǎn)業(yè)造成巨大的損失[1]，因此蛋殼質量在整個蛋品質中至關重要。禽類的品種和產(chǎn)蛋年齡[2-4]、攝入的營養(yǎng)[5]、產(chǎn)蛋環(huán)境[6]以及蛋在子宮中的時間長短都會對蛋殼強度造成影響[7]，而蛋殼的結構屬性（蛋殼厚度）和物質屬性（超微結構）可能是蛋殼強度出現(xiàn)差異的主要原因[8]。蛋殼顏色一直作為衡量蛋殼強度的一種重要指標[9]，研究發(fā)現(xiàn)綠殼蛋的蛋殼主要由膽綠素和膽綠素鋅螯合物2種色素組成[10-11]，綠殼蛋的藍綠色度與蛋殼中膽綠素的濃度呈顯著相關[12-13]。同時有研究發(fā)現(xiàn)，在雞產(chǎn)蛋過程中，子宮部位基因的表達會影響蛋殼質量，禽類卵清蛋白基因（OVAL）、鈣離子轉運ATP酶基因家族（ATP2家族）[14]、鈣離子通道上皮亞基家族（SCNN1家族）[15]等基因均被發(fā)現(xiàn)與蛋殼強度的差異形成有關。而水禽子宮組織基因表達是否影響蛋殼質量，目前未見報道。因此，本實驗以綠頭鴨為研究對象，對蛋品質性狀進行相關性分析，并對蛋殼強度相關基因進行篩選，為蛋鴨分子育種提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 實驗所用的綠頭野鴨均來自中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所試驗基地。選取健康、體重、周齡大小一致的母鴨100只，每只鴨均單籠飼養(yǎng)，營養(yǎng)水平一致，自由采食，最后收集300枚蛋用于測定蛋品質。挑選高低2個蛋殼強度組的蛋鴨各2只，采集子宮組織樣品，迅速置于液氮中冷卻，保存于-80℃超低溫冰箱，用于總RNA的提取。

1.2 蛋品質測定指標與方法 利用 QCR測色儀進行蛋殼顏色測定，以純黑色為0，純白色為81.2進行校正，數(shù)據(jù)越大表示蛋殼顏色越淺。蛋殼反射率(L* value)進行三點（蛋殼的銳端、頓端和中間）測定，結果取其平均值。蛋殼強度用蛋殼強度測定儀( ROBOT-MATION MODEL-Ⅲ)將鴨蛋尖端向上、垂直豎放測定；蛋殼厚度用蛋殼厚度測定儀（PEACOCK）測定，每個蛋測定鈍端、銳端和中間三點，結果取其平均值；蛋形指數(shù)用蛋形指數(shù)測定儀測定，量取短軸和長軸長度，結果取長軸與短軸的比值。蛋黃高度、哈氏單位、蛋黃顏色均由EMT5200多功能蛋品分析儀測定。

1.3 轉錄組測序及差異基因篩選 樣品總RNA提取步驟按照Trizol法進行，使用 Oligotex mRNA Midi試劑盒（Qiagen，德國）進行純化提取的mRNA樣品。RNA 的質量通過使用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和核酸分光光度計（Nanodrop ND-1000?）檢測260 nm吸光度，當260/280 nm下測定值大于1.8時，RNA質量較好。RNA完整性通過Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer 檢 測 RIN值， 當RIN值大于8時被認為RNA比較完整。所有RNA樣品均送到北京貝瑞和康生物技術有限公司進行mRNA分離、cDNA文庫構建和測序。測序平臺為 Illumina HiSeqTM2500。下機數(shù)據(jù)經(jīng)過質控，對原始數(shù)據(jù)進行評估和可信度的分析，通過質量控制得到質量較高的序列，利用Tophat將數(shù)據(jù)映射到基因組上，然后進行堿基并鑒別遺傳變異。篩選差異表達基因的過濾條件為Probability ≥ 80%，SD = 2.0，篩選顯著差異基因的過濾條件為logFC > 2 或logFC < -2； P ≤ 0.05。根據(jù)基因的差異表達進行功能注釋和富集分析。

1.4 統(tǒng)計分析 實驗數(shù)據(jù)采用SAS 8.0中One Way ANOVA進行統(tǒng)計分析，各處理間平均值比較采用Duncan氏多重比較進行差異顯著性檢驗，結果以平均值±標準差（Mean ± SD） 表示，以P <0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 實驗結果

2.1 蛋品質性狀及其相關分析 蛋品質間的表型性狀相關分析見表1。由表1可以看出，不同顏色蛋殼具有顯著的蛋殼反射率（P<0.05）；綠頭野鴨群體中，白殼組的蛋殼強度大于綠殼組和黃綠殼組（P<0.01），而白殼組的蛋殼厚度極顯著低于綠殼組和黃綠殼組（P<0.01），隨著蛋殼顏色的加深，蛋殼強度逐漸降低，說明在綠頭野鴨群體中蛋殼顏色可以作為一種衡量蛋殼強度的指標；3組在蛋形指數(shù)上呈現(xiàn)顯著差異（P<0.05）；白殼組在蛋白高度與哈氏單位上均優(yōu)于綠殼組和黃綠殼組，3組蛋黃顏色無顯著差異。

對7個蛋品質進行相關性分析（表2）發(fā)現(xiàn)，蛋殼強度與蛋殼厚度的相關系數(shù)為0.8742，具有較強相關性；蛋殼強度與蛋殼顏色、蛋形指數(shù)、蛋白高度、哈氏單位屬于中等相關水平；蛋殼顏色與蛋殼強度、蛋殼厚度、蛋白高度、哈氏單位屬于中等相關水平。

2.2 蛋殼強度相關差異基因的分析 本試驗中，高低蛋殼強度組強度大小分別為3.968 kg/cm2、3.693kg/cm2，呈極顯著差異。對不同蛋殼強度的個體進行轉錄組測序，分析差異表達基因，共篩選出325條差異表達基因。與低蛋殼強度組相比，高蛋殼強度組表達量顯著上調的基因有149個，表達量顯著下調的基因有176個。

表1 綠頭野鴨不同顏色（L* value）蛋的蛋品質比較

表2 蛋品質性狀間的相關系數(shù)

表3 與蛋殼強度相關的差異表達基因

2.3 與蛋殼強度相關基因的篩選 本研究從325個顯著差異基因中篩選了17個與綠頭鴨蛋殼強度相關的重要基因，包括CACNA1S、CACNB4、LOC101801793、CAMK2A、CALN1等，如表3所示。 這些差異基因大部分與鈣離子代謝相關，主要參與鈣離子跨膜轉運、鈣離子結合、鈣離子的釋放等，表明鈣離子在蛋殼強度形成過程中具有重要的作用。

3 討 論

3.1 蛋品質性狀及相關分析 鳥類蛋殼顏色的變化多種多樣，而這種顏色的變化主要取決于膽綠素與原卟啉的含量，膽綠素濃度越高，蛋殼顏色越深，隨之蛋殼反射率越低。Daniel Hanley等[16]為了更好地解釋蛋殼顏色的變化而建立了蛋殼顏色的混合模型，模型基于膽綠素與原卟啉濃度的多少，利用蛋殼碳酸鈣的反射率進行模型的校正，結果發(fā)現(xiàn)蛋殼顏色的變化與膽綠素濃度直接相關，尤其是與蛋殼的反射率結合起來測定結果更加可靠，這說明L* value對蛋殼顏色的測定具有一定的可靠性。本實驗利用L* value對各品種（系）蛋殼顏色進行分組且結果呈極顯著差異，證明L* value對蛋殼顏色的測定具有一定的可靠性，這與Reynolds[17]等的結論一致。

本實驗發(fā)現(xiàn)隨著蛋殼顏色的加深，蛋殼強度逐漸降低，說明在綠頭野鴨群體中蛋殼顏色可以作為一種衡量蛋殼強度的指標。Campo等[18]最早提出在未受到人工選擇的群體中，蛋殼顏色與蛋殼的強度存在顯著的正相關，隨著蛋殼顏色的變深，蛋殼質量越好，而人工選擇會根據(jù)不同的選擇指標而改變蛋殼強度的這一趨勢。這同時也意味著，在每個群體中，隨著蛋殼顏色的變化，強度也會呈現(xiàn)不同的變化。Ingram等[4]認為若只用蛋殼顏色去衡量蛋殼質量，結果并不準確。Carter等[19]也提出蛋殼顏色作為衡量蛋殼質量的指標并不適用于所有的品系，本研究結果只適用綠頭野鴨。因此，育種工作者在蛋鴨育種工作中應先進行顏色與強度的分析，再根據(jù)不同的情況進行選擇。

3.2 與蛋殼強度相關的差異基因篩選 與蛋殼礦化過程有關的子宮部基因可能是導致蛋殼質量變異的關鍵因素，因此，研究蛋殼礦化時期影響碳酸鈣沉積的關鍵候選基因及其遺傳變異是新的研究方向。為了尋找蛋殼強度差異形成的分子機制，本研究采用RNA-seq技術對不同強度差異組的鴨子宮進行轉錄組學測序及對比分析。在本研究篩選到的325個差異表達的基因中，共找到17個與鈣離子轉運有關的基因，主要參與鈣離子跨膜轉運、鈣離子結合、鈣離子的釋放等過程。與鈣離子轉運有關的基因如ATP家族、SCNN1家族與OPN等基因位于其中，這些家族基因通過鈉、鈣等陽離子通道的改變而改變蛋殼質量。除了上述出現(xiàn)的基因之外，本研究發(fā)現(xiàn)了包括了CA家族（CALN、CAMK、CALM、CACNB4等）與手鈣結合蛋白（NECAB2）等一系列新的差異基因，這些基因也是通過控制鈣電壓門控通道進而改變蛋殼中鈣離子的轉運，說明鈣離子通道的改變在蛋殼強度差異形成的分子機制中占據(jù)重要地位。這些基因的篩選為鴨蛋殼強度的分子選育提供了理論基礎。

4 結 論

本實驗通過比較綠頭野鴨群體蛋殼顏色與質量之間的關系，發(fā)現(xiàn)蛋殼顏色可作為綠頭野鴨蛋殼強度的衡量指標，其中白殼鴨蛋的蛋殼強度最大。采用高通量轉錄組測序找到17個與蛋殼強度相關的差異基因，這些基因主要參與了鈣離子跨膜轉運、鈣離子結合、鈣離子釋放等生物學過程，本研究結果為進一步研究蛋殼強度差異的分子機理提供了基礎。

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Study on Quality of Mallard Eggs and Screening of Genes Related to Eggshell Strength

LIANG Su-yun, WEN Zhi-guo, XIE Ming, HUANG Wei, HOU Shui-sheng*, LI Fu-huang2
( 1.Insitite of Animal Science of CAAS, Beijing 100193,China 2.Beijing Animal Husbandry Station, Beijing 1000107, china)

A total of 100 healthy and same age mallard were selected were selected to analysis their eggs quality, including eggshell color, eggshell strength, eggshell thickness, egg shape index, White height, Haugh unit value and egg yolk color, in addition ,candidate genes related to eggshell strength were screened by transcriptome sequencing. The results showed that there were significant differences in egg shape index, eggshell strength, White height and Haugh unit value(P<0.05). The correlation coefficient of eggshell strength and thickness was 0.8742,while the eggshell color can be as a measure of egg quality in mallard, the strength of white shell was largest and yellow-green shell was the smallest(P<0.001).A total of 325 dif f erentially expressed genes were identif i ed, among which 149 genes were up-regulated and 176 genes were down-regulated. The genes related to shell strength were CACNA1I,CACNB4,CALN,CACNA1S,L OC101801793, are involved in the processes of calcium ion binding , calcium ion transmembrane transport and calcium release. The results provide a basis for further study on the molecular mechanism of the dif f erences in eggshell strength.

Mallard; Eggshell strength; Transcriptome sequencing; Gene screening

S834.2

A

10.19556/j.0258-7033.2017-04-028

2016-11-12；

2017-01-10

現(xiàn)代水禽產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項（CARS-43）

梁素蕓（1990-），女，山東滕州人，在讀碩士，研究方向為家禽遺傳育種，E-mail:liangsu_yun@163.com

* 通訊作者：侯水生(1959-)，研究員，博士生導師，研究方向為動物遺傳育種與營養(yǎng)，E-mail:houss@263.net