張文博++賀建龍++蔣浩++熊鵬

摘要：以稻草秸稈為樣品，通過美國國家可再生能源實驗室（NREL）方法水解得到液體成分，采用苔黑酚比色法和蒽酮比色法測定其五碳糖（5C）和六碳糖（6C）的含量。結果表明，液體成分中5C和6C達到一定濃度比例時，會互相干擾測定的準確度。對已有測定纖維素、半纖維素含量的方法進行綜合應用并加以改進，分析測定液體中5C和6C在不同波長下互不干擾的最大濃度和可測范圍。結果發(fā)現，在620 nm波長下準確測定水解液中6C含量時，要同時滿足[5C]<0.070 9 g/L和[5C]/[6C]<16；在660 nm波長下準確測定液體中5C含量時，要同時滿足[6C]<0.023 3 g/L 和[6C]/[5C]<24。在可測范圍內，可以通過稀釋法達到測定要求，此法適用于混合液中5C和6C含量的測定，與高效液相色譜（HPLC）法進行對比，測定結果相對誤差的絕對值小于統(tǒng)計學上規(guī)定的5%，表明該法適用于木質纖維物質中纖維素和半纖維素含量快速、準確的測定。

關鍵詞：美國國家可再生能源實驗室（NREL）；纖維素；半纖維素；稻草秸稈；定量分析

中圖分類號： TK61文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）05-0281-03

木質纖維素的主要成分是纖維素、半纖維素和木質素，3種組分含量的多少及變化是木質纖維素原料綜合利用的重要依據，因此，準確測定木質纖維素中纖維素、半纖維素及木質素的含量十分必要[1]。目前常用72%濃硫酸法[2]測定木質素含量，硫酸與重鉻酸鉀氧化法[3]、硝酸乙醇法[4]、差重法[5]等測定纖維素含量，堿液提取法[6]、2 mol/L鹽酸水解法[7]等測定半纖維素含量，它們的主要缺點是操作復雜、耗時長且無法進行批量測樣。其中用2 mol/L鹽酸水解半纖維素時，難以控制水解程度，此法僅適用于對比性研究，應用領域受到局限[7]。美國國家可再生能源實驗室（NREL）方法[8]是用72%濃硫酸和4%稀硫酸2步水解樣品，得到濾液，然后用高效液相色譜（HPLC）法測定濾液中的單糖含量，雖然HPLC法測定結果較準確，但是單位時間所測樣品有限，測定速度相對較慢，不適合批量測定。HPLC色譜柱一般采用的基質相對脆弱且價格昂貴，批量測樣會很快損壞色譜柱。為了降低成本，方便、快速地測定木質纖維物質中纖維素和半纖維素的含量，以稻草秸稈為樣品，先用NREL法處理樣品得到濾液，然后分別用苔黑酚比色法[7]和蒽酮比色法[9]測定濾液中五碳糖（5C）和六碳糖（6C）的含量。在試驗中發(fā)現，測定濾液中5C和6C含量時會出現相互干擾現象，從而影響了測定結果的準確性。因此本研究考察了濾液中5C和6C在不同波長下互不干擾測定結果的最大濃度和可測范圍，并與HPLC法[8]的測定結果進行對比驗證。

1材料與方法

1.1儀器、試劑與材料

9FZ-42型系列農作物秸稈粉碎機；UV752紫外-可見分光光度計（上海佑科儀器儀表有限公司）；XFH-50CA電熱式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）；SHB-3循環(huán)水多用真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；HH-4數顯恒溫水浴鍋（金壇市鴻科儀器廠）；分析天平（上海越平科學儀器有限公司）。

72% H2SO4溶液[9]：665 mL濃H2SO4（汕頭化工有限公司，分析純）加入300 mL蒸餾水中，冷卻至20 ℃，補加蒸餾水至1 000 mL。苔黑酚試劑[7]：A試劑，0.1 g FeCl3（天津市巴斯夫化工有限公司，分析純）溶于100 mL 37%濃HCl（上海振企化學試劑有限公司，分析純）中；B試劑，6 g苔黑酚（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）溶于100 mL無水乙醇（天津基準化學試劑有限公司）中，現用現配。蒽酮試劑[10]：0.2 g 蒽酮（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）溶于 100 mL 濃H2SO4（汕頭化工有限公司，分析純）中，現用現配。葡萄糖（天津市大茂化學試劑廠，分析純）；D-木糖（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；所采用的其他試劑按常規(guī)法配制。稻草秸稈：產自江蘇省淮安市，原料粉碎至1～2 cm，80 ℃烘干備用。

1.2測定方法

本試驗擬定的系統(tǒng)定量分析程序是將NREL法與苔黑酚比色法和蒽酮比色法的綜合應用并加以改進。以粉碎干燥后的稻草秸稈作為樣品，用72%濃H2SO4和4%稀H2SO4 2步水解樣品，樣品中的纖維素、半纖維素被水解成單糖，然后分別采用苔黑酚比色法和蒽酮比色法進行定量，操作流程如圖1所示[1，10]。

1.3不同波長下吸收曲線的繪制

[CM（24]用蒽酮定糖法測定葡萄糖和木糖在不同波長下的吸光

[FL（2K2]度：取3支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管，其中1支為空白，配制0.05 g/L葡萄糖標準溶液和0.1 g/L木糖標準溶液，分別取1 mL標準溶液于另2支試管中，1 mL蒸餾水于空白試管中，再分別加入2 mL蒽酮試劑，混勻，100 ℃下煮沸 5 min，自來水冷卻至室溫，用10 mm玻璃比色皿，分別于 520～700 nm（波長間隔10 nm）波長下測定吸光度，繪制葡萄糖和木糖標準溶液在520～700 nm波長下的吸收曲線。

用苔黑酚比色定糖法測定葡萄糖和木糖在不同波長下的吸光度：取3支洗凈烘干的20 mL具塞刻度試管，其中1支為空白，配制0.02 g/L木糖標準溶液和0.10 g/L葡萄糖標準溶液，分別取1 mL標準溶液于另2支試管中，1 mL蒸餾水于空白試管中，再分別加入2.000 mL A試劑和0.134 mL B試劑，混勻，100 ℃下煮沸20 min，自來水冷卻至室溫，用10 mm玻璃比色皿，于580～760 nm（波長間隔10 nm）波長下測定吸光度，繪制木糖和葡萄糖標準溶液在580～760 nm波長下的吸收曲線。

2結果與分析

2.1混合液中5C和6C之間相互干擾的分析

用本試驗方法測定純凈單糖時，結果準確，但實際上所接觸到的往往是某些糖的混合溶液，例如預處理稻草秸稈后得到的預處理液和固體水解液。用本試驗方法處理稻草秸稈得到的濾液就是一種同時存在5C和6C的混合溶液。由圖2和圖3可知，不同濃度的葡萄糖和木糖標準溶液在同一波長下用同一種方法測定時，都會呈現不同的吸光度，也就是說當測定濾液中某一單糖的吸光度時，另一種單糖也會有吸光度。因為吸光度具有加和性，所以2種糖之間必然會存在某種程度的干擾。若濾液中一種單糖的濃度減小，那么所測吸光度也會相應減小，當該糖該濃度下的吸光度減小到可以忽略不計而又不影響另一種單糖正常測定時，便可以消除干擾。

2.2測定6C含量時，5C的最大干擾濃度和可測范圍

配制不同濃度梯度的木糖標準溶液，用蒽酮比色法測定木糖的吸光度，采用5點法作圖。因為6C與蒽酮反應生成的有色物質在可見光區(qū)吸收峰為620 nm，所以以620 nm波長為中心，繪制580～650 nm波長下的木糖標準曲線。

選取所用紫外-可見分光光度計讀數的最小可信值為 0.05，那么6C的吸光度≥0.05時，視為可信的吸光度，根據620 nm波長下葡萄糖的標準曲線（y=13.090x-0.006，r2=0999 9，y： 吸光度；x：濃度，g/L） 可以得到吸光度為0.05時

6C的濃度為0.004 3 g/L，此濃度即為6C的最小可測濃度。同理，5C的吸光度<0.05時，不會影響6C的吸光度，根據不同波長下木糖的標準曲線可以得到吸光度為0.05時5C的濃度，只有混合液中5C小于此濃度時，才不會干擾6C的測定結果，此時的5C濃度即為不干擾6C測定的最大濃度。因此，測定6C含量時，5C的濃度要小于最大干擾濃度，6C的濃度要大于最小可測濃度（0.004 3 g/L），即5C與6C濃度的比值會恒小于某個數。由5C和6C濃度的比值可以得到不同波長下的可測范圍。

2.3測定5C含量時，6C的最大干擾濃度和可測范圍

配制不同濃度梯度的葡萄糖標準溶液，用苔黑酚比色法測定葡萄糖的吸光度，采用5點法作圖。因為苔黑酚比色法測定木糖在660 nm波長下有最大吸光度，所以以 660 nm 波長為中心，繪制620～690 nm波長下的葡萄糖標準曲線。

選取所用紫外-可見分光光度計讀數的最小可信值為 0.05，5C的吸光度≥0.05時，視為可信的吸光度，根據 660 nm 波長下木糖的標準曲線（y=62.870x-0.012，r2=0.999 9，y：吸光度；x：濃度，g/L）可以得到吸光度為0.05時5C的濃度為0.986 mg/L，此濃度即為5C的最小可測濃度。同理，6C的吸光度<0.05時，不會影響5C的吸光度，根據不同波長下葡萄糖的標準曲線可以得出吸光度為0.05時6C的濃度，只有混合液中的6C小于此濃度時，才不會干擾5C的測定結果，此時6C的濃度即為不干擾5C測定的最大濃度。因此，測定5C含量時，6C的濃度要小于最大干擾濃度，5C的濃度要大于最小可測濃度（0.986 mg/L），即6C與5C濃度的比值會恒小于某個數。由5C和6C濃度的比值可以得到不同波長下的可測范圍（

3結論與討論

本試驗所采用的方法操作簡便，成本低，測定結果準確，可以進行多個試樣的分析，在具有一般化學分析條件的實驗室內都可以使用。用本法準確測定混合液中6C含量時，需要同時滿足[5C]<0.070 9 g/L和[5C]/[6C]<16；準確測定5C含量時，需要同時滿足[6C]<0.023 3 g/L和 [6C]/[5C]<24。在測定混合液中5C和6C含量時，可以通過稀釋的方法控制濃度大小，通過標準曲線計算得到的糖濃度符合表1和表2所列的互相不干擾范圍，即認為測定結果準確。用本法測定稻草秸稈中纖維素含量38.74%、半纖維素含量21.84%，與HPLC法測定結果一致。此方法對測定木質纖維素原料中纖維素和半纖維素的含量提供了幫助，也為進一步利用木質纖維素這一寶貴的資源提供了資料。

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