郭曉 商云霞+王夢(mèng)遠(yuǎn)+劉曉婷+楊紅洋 +陳潔 谷新利

摘要：探討在體外環(huán)境下不同質(zhì)量濃度中藥復(fù)方多糖對(duì)雞外周血淋巴細(xì)胞信號(hào)分子表達(dá)的影響。分別采用200、100、50、25、0 μg/mL 5個(gè)中藥復(fù)方多糖質(zhì)量濃度梯度在體外條件下刺激雞外周血淋巴細(xì)胞，采用ELISA法測(cè)定中藥多糖作用1、2、4 h時(shí)細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）的含量，以及作用24 h時(shí)鈣離子（Ca2+）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（iNOS）的分泌水平。結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組能顯著提高細(xì)胞培養(yǎng)上清中cAMP、cGMP的水平（P<0.05）。當(dāng)作用1 h時(shí)，100 μg/mL多糖處理組與其他試驗(yàn)組的cAMP差異顯著（P<0.05）；作用2、4 h時(shí)，200 μg/mL多糖組的cAMP、cGMP分泌水平顯著高于其他試驗(yàn)組。與對(duì)照組相比，100、200 μg/mL多糖組能顯著提高細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ca2+、NO的分泌水平（P<0.05），25、50 μg/mL多糖組對(duì)淋巴細(xì)胞中Ca2+、NO的分泌水平無(wú)顯著影響（P>0.05）。中藥復(fù)方多糖能顯著提高淋巴細(xì)胞分泌iNOS的水平（P<0.05），而與其他多糖組相比，100 μg/mL 多糖組淋巴細(xì)胞分泌iNOS的水平顯著提高（P<0.05）。中藥復(fù)方多糖可通過(guò)改變Ca2+、cAMP、cGMP、NO、iNOS等細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的活性或含量而啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性和功能，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)和釋放，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

關(guān)鍵詞：中藥復(fù)方；多糖；黃麻雞；淋巴細(xì)胞；免疫信號(hào)分子

中圖分類號(hào)： S852.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）05-0167-03

中草藥具有安全、低毒、低殘留、不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛研究并運(yùn)用到畜禽生產(chǎn)中以有效增強(qiáng)畜禽機(jī)體抵抗病原的能力。研究發(fā)現(xiàn)，中草藥中提取的多糖是能夠調(diào)節(jié)畜禽免疫力的主要物質(zhì)之一[1]。單一活性多糖是近年來(lái)中藥免疫藥理學(xué)研究的熱點(diǎn)，卻鮮見(jiàn)關(guān)于中藥復(fù)方多糖的研究。目前，中藥多糖免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制尚未明確。已有研究發(fā)現(xiàn)，中藥多糖通過(guò)與免疫細(xì)胞表面受體結(jié)合，改變環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）、鈣離子（Ca2+）、一氧化氮（NO）、一氧化氮合成酶（iNOS）等免疫細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子的活性或含量而啟動(dòng)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的活性和功能，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)和釋放，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[2-3]。

朱曉慶等研究發(fā)現(xiàn)，中藥復(fù)方免疫增強(qiáng)劑能在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)增強(qiáng)雞的免疫調(diào)節(jié)作用[4]。本試驗(yàn)以雞外周血淋巴細(xì)胞為研究對(duì)象，在體外條件下研究一定純度中藥復(fù)方多糖對(duì)淋巴細(xì)胞中環(huán)磷酸腺苷（cAMP）、環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷（cGMP）、鈣離子（Ca2+）、一氧化氮（NO）、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）等信號(hào)分子產(chǎn)生的影響，為進(jìn)一步揭示中藥復(fù)方多糖的作用機(jī)制提供依據(jù)。

1材料與方法

[HTK]1.1試驗(yàn)藥物[HT]

中藥復(fù)方多糖是由筆者所在實(shí)驗(yàn)室自主開(kāi)發(fā)的中藥復(fù)方免疫增強(qiáng)劑，經(jīng)水提-醇沉法提取后，由AB-8大孔吸附樹(shù)脂吸附解吸附后獲得精制中藥多糖，經(jīng)苯酚-硫酸法測(cè)定中藥多糖含量為79.6%。采用滅菌蒸餾水將其配制成 200 μg/mL 的中藥復(fù)方多糖母液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后，于4 ℃下儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試劑與儀器

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、苯酚、氫氧化鈉、碳酸氫鈉、乙醇、丙酮、石油醚、濃硫酸均為AR級(jí)。雞外周血淋巴細(xì)胞分離液（TBD，天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司），PBS磷酸緩沖液（Hy Clone，賽默飛世而生物化學(xué)制品北京有限公司），胎牛血清（Gibco公司），RPMI1640培養(yǎng)基（Hy Clone），雙抗（Gibco公司）。雞cAMP、cGMP、Ca2+、NO、iNOSELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海藍(lán)基生物科技有限公司。

生物安全柜（Thermo公司），CO2培養(yǎng)箱（Thermo公司），垂直離心機(jī)（Thermo公司），OLYMPUS倒置相差顯微鏡，Power Wave XS2 BioTek型酶標(biāo)儀。

1.3試驗(yàn)動(dòng)物

40羽新疆黃麻雞購(gòu)自石河子市孵化場(chǎng)，按照試驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)方法飼養(yǎng)至體質(zhì)量達(dá)1.5～2.0 kg。

1.4試驗(yàn)方法

1.4.1雞外周血淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

采用含EDTA的無(wú)菌采血管在雞翅下靜脈采集2 mL血液，將血液用等體積PBS液稀釋混勻，將稀釋的4 mL血液緩慢加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液層上，采用Ficoll密度梯度離心法（22 ℃，800 g，垂直離心30 min），收集中間層白色云霧狀的外周血單核細(xì)胞（PBMC）。得到的細(xì)胞經(jīng)5倍體積的PBS（4 ℃）洗滌2次（2 500 r/min，離心10 min），最后采用完全RPMI1640培養(yǎng)液洗滌1次（2 500 r/min，離心10 min）。將細(xì)胞重懸在1 mL含15%胎牛血清的完全RPMI1640培養(yǎng)液中，于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，除去貼壁細(xì)胞，收集懸浮細(xì)胞。采用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞2次（1 500 r/min，離心10 min），再用完全RPMI1640培養(yǎng)基重懸懸浮細(xì)胞，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色，細(xì)胞存活率大于95%，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL。試驗(yàn)分為5個(gè)組，即空白對(duì)照組（多糖質(zhì)量濃度為 0 μg/mL）以及不同質(zhì)量濃度多糖組，多糖組的終質(zhì)量濃度分別為200、100、50、25 μg/mL。

1.4.2淋巴細(xì)胞cAMP和cGMP的測(cè)定

按上述方法分離培養(yǎng)淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個(gè)/mL。取6個(gè)24孔培養(yǎng)板，按以上分組，每組5個(gè)孔，每孔加入1 mL淋巴細(xì)胞懸液并加入多糖，使其終質(zhì)量濃度分別達(dá)到200、100、50、25、0 μg/mL。將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1、2、4 h，分時(shí)段離心收集細(xì)胞培養(yǎng)上清。按ELISA試劑盒說(shuō)明書測(cè)定cAMP、cGMP的含量。

1.4.3淋巴細(xì)胞Ca2+、NO、iNOS的測(cè)定

按以上方法分離培養(yǎng)并分組，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，以 3 000 r/min 離心15 min，收集細(xì)胞上清液。采用ELISA法測(cè)定Ca2+、NO、iNOS的含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.4.4數(shù)據(jù)分析

各項(xiàng)免疫指標(biāo)數(shù)據(jù)結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（x[TX-*5]±s）表示。采用SPSS 17.0軟件對(duì)各免疫性狀結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果均以α=0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2結(jié)果與分析

2.1中藥復(fù)方多糖對(duì)cAMP、cGMP含量的影響

由表1可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組顯著提高了細(xì)胞培養(yǎng)上清中cAMP、cGMP的水平（P<0.05）。當(dāng)作用1 h時(shí)，與其他試驗(yàn)組相比，100 μg/mL多糖組的cAMP差異顯著（P<0.05）；當(dāng)作用2、4 h時(shí)，200 μg/mL多糖組的cAMP、cGMP分泌水平顯著高于其他試驗(yàn)組。[FL）]

3結(jié)論與討論

黃芪多糖能使小鼠脾淋巴細(xì)胞中cGMP濃度迅速升高，一定劑量的半枝蓮多糖能使小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高[6]。趙飛艷等研究表明，沙蔥多糖可顯著提高淋巴細(xì)胞內(nèi)cAMP、cGMP含量[7]。本研究表明，一定純度的中藥復(fù)方多糖能顯著提高淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中cAMP、cGMP的水平，且cAMP、cGMP的平均水平隨著時(shí)間的延長(zhǎng)及中藥復(fù)方多糖質(zhì)量濃度的升高而增加，這與帥學(xué)宏等[8]、高建峰等[9]利用其他多糖的研究結(jié)果具有相似趨勢(shì)。

鈣離子是細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要分子之一，對(duì)淋巴細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和功能實(shí)現(xiàn)具有重要作用[10]。淋巴細(xì)胞鈣離子水平直接影響淋巴細(xì)胞的分裂、巨噬細(xì)胞的吞噬作用并促進(jìn) IL-2 的釋放等。研究表明，多糖可引起淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的改變，從而調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能[11]。本研究表明，一定純度的中藥復(fù)方多糖能顯著提高淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中Ca2+的水平，這與劉媛等的研究結(jié)果[12]相一致。

一氧化氮（NO）是由一氧化氮合成酶（iNOS）催化，經(jīng)多步氧化還原反應(yīng)而生成的，在生物體內(nèi)是一種重要的信使分子和效應(yīng)分子[13]。張明等研究發(fā)現(xiàn)，適宜劑量的中藥復(fù)方多糖（CPPS）能顯著提高小鼠脾淋巴細(xì)胞的增殖活性和細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO含量，提示CPPS可能通過(guò)NO介導(dǎo)信號(hào)通路，引起cGMP生成，進(jìn)而發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)作用[14-16]。余桂朋等研究發(fā)現(xiàn)，艾葉多糖能增強(qiáng)巨噬細(xì)胞生成NO的能力，且在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)存在劑量-效應(yīng)關(guān)系[17]。本研究表明，一定純度的中藥復(fù)方多糖能促進(jìn)雞外周血淋巴細(xì)胞中NO、iNOS的生成，這與韓杰等關(guān)于一定濃度刺五加多糖對(duì)體外培養(yǎng)的仔豬外周血淋巴細(xì)胞內(nèi)NO、iNOS影響的研究結(jié)果[18]相一致。

一定純度的中藥復(fù)方多糖能通過(guò)提高細(xì)胞內(nèi)Ca2+、NO、iNOS的水平來(lái)改變cAMP、cGMP分泌，影響免疫細(xì)胞信號(hào)的傳導(dǎo)，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。

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