羅清+梁春+唐瑩瑩+秦玉燕+盧業(yè)飛+覃坤蘭

摘 要：文章對(duì)近年來(lái)杜鵑分子標(biāo)記的研究工作進(jìn)行了梳理和總結(jié)，綜述了ISSR、AFLP、RAPD、SSR及SRAP等分子標(biāo)記在杜鵑的應(yīng)用，并展望應(yīng)用前景和提出了建設(shè)性意見(jiàn)，為日后開(kāi)展杜鵑品種鑒定及遺傳多樣性分析、分子標(biāo)記輔助育種、構(gòu)建統(tǒng)一的分類(lèi)系統(tǒng)及分子標(biāo)記研究等提供參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：杜鵑 分子標(biāo)記 進(jìn)展

杜鵑花（Rhododendron simsii Planch.）是杜鵑花科（Ericaceae）杜鵑屬（Rhododendron L.）常綠或落葉多年生植物，全世界約有960余種。我國(guó)杜鵑花自然分布廣泛，占世界種類(lèi)的59 %，因其種類(lèi)繁多、花色艷麗、株型多樣聞名于世。我國(guó)豐富的杜鵑花資源傳布到世界各國(guó)并經(jīng)植物學(xué)家及園藝學(xué)家繁殖培育，獲得了大量的雜交組合及新品種，至今栽培出的園藝品種近萬(wàn)種。由于杜鵑花品種繁多、產(chǎn)區(qū)廣泛、新品種審定不及時(shí)、地區(qū)使用習(xí)慣稱(chēng)呼不同等，出現(xiàn)了許多同名異種及同種異名的現(xiàn)象，此外我國(guó)廣闊土地的深山野林中還有許多未被保存的杜鵑種質(zhì)資源。因此，對(duì)杜鵑種質(zhì)資源進(jìn)行有效分類(lèi)與鑒定是今后深入開(kāi)展杜鵑育種研究的基礎(chǔ)。

近年來(lái)隨著分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)廣泛應(yīng)用于杜鵑研究。分子標(biāo)記是揭示堿基序列變異的遺傳標(biāo)記，與細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、形態(tài)學(xué)標(biāo)記、生物化學(xué)標(biāo)記相比，不受環(huán)境、發(fā)育階段等影響，且檢測(cè)手段迅速簡(jiǎn)單、多態(tài)性高、穩(wěn)定準(zhǔn)確，是形態(tài)學(xué)分類(lèi)的重要補(bǔ)充。文章綜述了近年來(lái)分子標(biāo)記技術(shù)在杜鵑研究中的應(yīng)用，以期為日后杜鵑花系統(tǒng)分類(lèi)、合理開(kāi)發(fā)利用杜鵑種質(zhì)資源提供參考。

1 分子標(biāo)記的發(fā)展動(dòng)態(tài)

分子標(biāo)記是植物DNA水平上遺傳多樣性的體現(xiàn)，新型分子標(biāo)記技術(shù)的大量涌現(xiàn)大大縮短了植物常規(guī)育種的周期，分子標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物遺傳結(jié)構(gòu)檢測(cè)、親緣關(guān)系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析及轉(zhuǎn)基因研究等方面[1-2]。目前分子標(biāo)記種類(lèi)繁多，根據(jù)不同的核心技術(shù)可分為3類(lèi)： 第一類(lèi)以Southern雜交為核心，如RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）；第二類(lèi)以PCR反應(yīng)為核心，包括多位點(diǎn)標(biāo)記方法RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）、DAF（DNA Amplification Fingerprinting）、SSCP（Single Strand Conformational Polymorphism）、SSR（Simple Sequence Repeats）、小衛(wèi)星DNA（Minisatellite DNA）等，位點(diǎn)特異的PCR標(biāo)記方法ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）、AP-PCR（Arbitrary Primer PCR）、STS（Sequence Tagged Site）等及PCR與酶切相結(jié)合的方法AFLP（Amplified Fragment Length Polymorphism）、CAPS（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence）等；第三類(lèi)以單核苷酸多態(tài)性或mRNA為核心，主要以SNP（Single Nucleotide Polymorphic）技術(shù)和EST（Expressed Sequence Tag）技術(shù)等為代表[3-7]。

分子標(biāo)記技術(shù)能夠更深層次的解釋生命現(xiàn)象本質(zhì)，使我們認(rèn)知范圍從宏觀表型到微觀世界[8]。分子標(biāo)記直接反映DNA水平上的遺傳多樣性，能夠反映生物個(gè)體或種群間基因組中某種差異的特異性DNA片段[9]。因此，在形態(tài)分類(lèi)學(xué)基礎(chǔ)上結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行物種鑒定與分類(lèi)對(duì)物種的種質(zhì)資源研究及品質(zhì)創(chuàng)新具有重要的意義。

2 主要分子標(biāo)記的研究

2.1 杜鵑ISSR分子標(biāo)記的應(yīng)用

ISSR （簡(jiǎn)單重復(fù)序列間多態(tài)性）分子標(biāo)記技術(shù)由Zietkiewicz等[10]提出，在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的分子標(biāo)記，屬于位點(diǎn)特異的PCR標(biāo)記。ISSR標(biāo)記具有實(shí)驗(yàn)成本低廉、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、引物適用廣泛等優(yōu)點(diǎn)[11-12]。

目前國(guó)內(nèi)學(xué)者在杜鵑屬植物種群間的遺傳多樣性和種間親緣關(guān)系分析研究中運(yùn)用最多的分子標(biāo)記是ISSR標(biāo)記。劉旭穎等[13]將ISSR用于9種杜鵑花的親緣關(guān)系分析，擴(kuò)增出522條帶，其中有90.63 %是多態(tài)性的。遺傳距離從0. 1833到0. 7236，表明種間具有較豐富的遺傳多樣性。鄭宇等[14]研究了11個(gè)杜鵑栽培品種的遺傳多樣性，Shannon多樣性指數(shù)為0.4742，表明遺傳多樣性水平較高。彭嬋等[15]、趙芯等[16]及羅清等[17]學(xué)者都利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分別對(duì)不同的野生杜鵑屬植物種群進(jìn)行遺傳關(guān)系研究，結(jié)果都表明種群遺傳多樣性處于較高水平，種群間的基因交流頻率很高，能較好的適應(yīng)當(dāng)前環(huán)境。孔剛[18]對(duì)福建旗山2個(gè)馬銀花（R. ovatum （Lindl.） Planch. ex Maxim. ）種群研究，2個(gè)種群的基因流 Nm=0.2627<1，表明種群基因交流較少，可能由于種群所處的生境與外界聯(lián)系甚少，被周?chē)h(huán)境的高山與溪流所阻隔。鐘容等[19]對(duì)篩選出13條引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，研究表明4種杜鵑花遺傳背景既有相同之處又有一定差異。陳春福[20]以九仙山上的鹿角杜鵑（R. latoucheae Franch.）與滿(mǎn)山紅（R.mariesii Hemsl.et Wils.） 6大類(lèi)為實(shí)驗(yàn)材料， ISSR分子標(biāo)記分析表明，在不同海拔處的株系呈現(xiàn)出較大的遺傳差異，可能與植株所處的環(huán)境條件、氣候等因素有關(guān)。趙冰等[21]對(duì)秦嶺地區(qū)美容杜鵑（R. calophytum Franch.）的5個(gè)野生種群通過(guò)ISSR分子標(biāo)記技術(shù)分析其遺傳多樣性，表明不同種群間的美容杜鵑遺傳多樣性水平差異大，遺傳分化的程度與地理距離無(wú)相關(guān)性。而趙凱等[22]學(xué)者研究群居的都支杜鵑（R. shanii Fang）遺傳多樣性較低，但是遺傳距離卻與地理距離顯著相關(guān)，可能是都支杜鵑高度一致性的生境及異交的生活特性所導(dǎo)致。王剛[23]對(duì)黃山杜鵑（R. maculiferum Franch.）5個(gè)種群利用ISSR標(biāo)記進(jìn)行研究，種群間遺傳水平不高，需對(duì)幼苗進(jìn)行混合繁殖，加大居群間遷移和交流使居群間的遺傳基因重組，以此提高黃山杜鵑種群的遺傳多樣性水平。

2.2 杜鵑AFLP分子標(biāo)記的應(yīng)用

AFLP（擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性）由荷蘭科學(xué)家Pieter Vos等[24]提出，是3端具有選擇性的雙引物PCR標(biāo)記，屬于PCR與酶切相結(jié)合的方法[25]。AFLP分子標(biāo)記具有重復(fù)性好、多態(tài)性強(qiáng)、分辨率高及樣品適用性廣等優(yōu)點(diǎn)，在構(gòu)建遺傳圖譜、遺傳育種、基因表達(dá)與調(diào)控、物種分類(lèi)和進(jìn)化等方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

AFLP標(biāo)記一次單個(gè)反應(yīng)可檢測(cè)到大量限制性片段， AFLP是最有效的分子標(biāo)記，由于實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)量龐大，因此運(yùn)用在杜鵑屬植物上較少，僅有幾個(gè)學(xué)者采用AFLP標(biāo)記對(duì)杜鵑遺傳多樣性進(jìn)行分析?？v丹等[26]采用AFLP標(biāo)記對(duì)馬纓杜鵑（R. delavayi Franch.）5個(gè)居群進(jìn)行檢測(cè)與分析，居群內(nèi)83.12 %發(fā)生遺傳變異，基因流為2.4624，居群遺傳多樣性較高。趙冰等[27]研究秀雅杜鵑（R. concinnum Hemsl.）種群的遺傳分化程度及遺傳多樣性，結(jié)果表明秀雅杜鵑無(wú)論在種群水平還是物種水平上遺傳多樣性都比較高，遺傳變異主要在種群內(nèi)部，且遺傳距離與地理距離相關(guān)性不顯著。吳富勤[28]對(duì)2個(gè)居群的大樹(shù)杜鵑（R. protistum Balf. f. et Forrest var. giganteum （Tagg） Chamb. ex Cullen et Chamb.）利用AFLP分子標(biāo)記來(lái)研究遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳多樣性，研究顯示2個(gè)居群間的遺傳分化程度低，基因流較高，遺傳多樣性在物種水平上較高。其研究結(jié)果印證了“狹域分布的小種群亦能維持較高的遺傳多樣性”的假說(shuō)。

2.3 杜鵑RAPD分子標(biāo)記的應(yīng)用

RAPD（隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記）是由Williams等[29]提出，是基于PCR技術(shù)對(duì)未知序列的基因組檢測(cè)DNA多態(tài)性的方法。RAPD分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)單易行、易于程序化、所需DNA樣品量少、退火溫度低、實(shí)驗(yàn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于遺傳學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)與分子生藥學(xué)等領(lǐng)域。

張春影等[30]對(duì)不同海拔牛皮杜鵑（R. aureum Georgi）種群利用RAPD標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析：產(chǎn)地不同的種群遺傳多樣性高，可能與氣候因子、環(huán)境因子及地理因子等因素綜合影響有關(guān)；產(chǎn)地相同的遺傳多樣性水平低，可能是由于分生境狹小產(chǎn)生地理間隔的生殖屏障，阻斷基因交流。姬文秀等[31]利用RAPD標(biāo)記鑒定出6份大字杜鵑（R. schlippebachii Maxim.）的親緣關(guān)系。劉雁飛[32]對(duì)長(zhǎng)白山居群牛皮杜鵑進(jìn)行研究，借助RAPD分子標(biāo)記分析，發(fā)現(xiàn)遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)受地理環(huán)境的影響，遺傳多樣性水平高，說(shuō)明牛皮杜鵑適應(yīng)環(huán)境的能力較強(qiáng)。

2.4 杜鵑SSR分子標(biāo)記的應(yīng)用

SSR（簡(jiǎn)單序列重復(fù)）由Moore[33]提出，是重復(fù)單位（含有1～6個(gè)核苷酸）組成的基序串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列，為單引物PCR標(biāo)記。SSR長(zhǎng)度的高度變異性是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。SSR分子標(biāo)記具有等位基因變異多、多態(tài)性高、信息量豐富、重復(fù)性好、結(jié)果可靠及呈共顯性等優(yōu)點(diǎn)，具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，因而該技術(shù)被用于目標(biāo)基因的標(biāo)定、分子輔助選擇育種、遺傳機(jī)制、品種測(cè)定和遺傳連鎖圖譜構(gòu)建等的研究中。

雖然目前最接近理想的分子標(biāo)記是SSR標(biāo)記，但引物開(kāi)發(fā)要建立在已知的DNA序列上，由于杜鵑植物DNA序列信息相對(duì)缺乏的情況下，使得杜鵑SSR標(biāo)記引物的開(kāi)發(fā)相對(duì)較少，因此國(guó)內(nèi)學(xué)者在杜鵑屬植物上對(duì)SSR標(biāo)記的應(yīng)用不多[34-36]。周泓[37]運(yùn)用Dendauw等開(kāi)發(fā)的SSR引物對(duì)130個(gè)杜鵑花進(jìn)行SSR分子標(biāo)記實(shí)驗(yàn)，所用引物呈現(xiàn)的多態(tài)性都比較高，聚類(lèi)結(jié)果與傳統(tǒng)分類(lèi)系統(tǒng)基本吻合。吳富勤[28]運(yùn)用SSR標(biāo)記對(duì)居群大樹(shù)杜鵑進(jìn)行保護(hù)遺傳學(xué)研究，結(jié)果表明大樹(shù)杜鵑歷史基因流高，經(jīng)過(guò)多年演變現(xiàn)已不能維持足夠的等位基因豐富度，近代基因流低，瀕臨極危的狀態(tài)，建議加強(qiáng)基因交流，就地保護(hù)與遷地保護(hù)相結(jié)合，擴(kuò)大有效居群地。

2.5 杜鵑SRAP分子標(biāo)記的應(yīng)用

目前在杜鵑屬上應(yīng)用的還有SRAP分子標(biāo)記。該分子標(biāo)記由于2001年美國(guó)加州大學(xué)Li和Quiros[38]博士提出的，是基于PCR的一種新型的標(biāo)記系統(tǒng)。SRAP分子標(biāo)記具有高共顯性、重復(fù)性好、方便測(cè)序和簡(jiǎn)單高效等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用于重要性狀基因標(biāo)記、比較基因組學(xué)、遺傳多樣性分析及遺傳圖譜構(gòu)建等研究領(lǐng)域。

蘇家樂(lè)等[39]運(yùn)用SRAP分子標(biāo)記鑒別了10份杜鵑屬植物，遺傳分化明顯，遺傳多樣性高，分類(lèi)結(jié)果與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)基本一致。吳月燕等[40]以24個(gè)西洋杜鵑為實(shí)驗(yàn)材料，優(yōu)化建立了適合西洋杜鵑的SRAP-PCR反應(yīng)體系，并利用該體系對(duì)供試材料進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示SRAP分子標(biāo)記可以很好用于該實(shí)驗(yàn)材料的鑒定。

3 總結(jié)與展望

分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于杜鵑遺傳育種中，在遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系研究與種質(zhì)資源鑒定等方面開(kāi)展了一系列工作并獲得了一些成果。多態(tài)性信息的統(tǒng)計(jì)分析可以從分子水平提供杜鵑遺傳變異的證據(jù)，為全面掌握現(xiàn)有杜鵑資源的遺傳多樣性提供參考。從基因組DNA水平上的差異研究杜鵑親緣關(guān)系，結(jié)果客觀準(zhǔn)確，為選育雜交優(yōu)勢(shì)強(qiáng)、性狀優(yōu)良的杜鵑品種提供理論支撐。杜鵑品種繁多、市場(chǎng)混亂，分子標(biāo)記技術(shù)以品種間變異的可識(shí)別性與穩(wěn)定性成為傳統(tǒng)植物鑒別方法的有效補(bǔ)充。

杜鵑分子水平研究仍處于起步階段，遺傳圖譜構(gòu)建與輔助選擇育種等研究未見(jiàn)報(bào)道。遺傳圖譜是遺傳育種及分子克隆的理論基礎(chǔ)，高密度遺傳圖譜的構(gòu)建可有效開(kāi)展質(zhì)量、數(shù)量性狀定位、分子標(biāo)記輔助育種及比較基因組學(xué)等研究。分子標(biāo)記輔助育種可對(duì)目標(biāo)性狀進(jìn)行早期選擇，從而縮短育種周期。

在與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上，開(kāi)展杜鵑分子水平研究，開(kāi)發(fā)更為高效的分子標(biāo)記技術(shù)，各種分子標(biāo)記技術(shù)相互滲透，使用構(gòu)建杜鵑遺傳連鎖圖譜，利用與目標(biāo)性狀連鎖的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇育種成為今后杜鵑分子標(biāo)記育種的研究重點(diǎn)，可為杜鵑名品鑒賞、雜交親本選擇、傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)等提供豐富的分子水平依據(jù)。

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