段佳慧，趙冬冬，李凱新，趙曉艷，左文君，林樹梅

(沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866)

專論與講座

胰腺干細胞分化為胰島細胞的誘導方法

段佳慧1，趙冬冬，李凱新，趙曉艷，左文君，林樹梅*

(沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院，遼寧沈陽 110866)

糖尿病作為全球范圍內(nèi)的代謝性常見疾病，嚴重影響著患者的生命質(zhì)量。常規(guī)的藥物和胰島素注射并不足以根治糖尿病。近年來，逐漸發(fā)展起來的干細胞的相關(guān)研究，有望從根本上治愈糖尿病及其并發(fā)癥，因而成為治療糖尿病的研究熱點。而利用干細胞醫(yī)治糖尿病的關(guān)鍵點是明確干細胞的來源及分化為胰島細胞的誘導方法。論文針對胰腺干細胞存在部位及誘導方法的研究概況做一綜述。

胰腺干細胞；糖尿??；誘導分化；胰島素

近年來，隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，糖尿病(DM)患者數(shù)量也在不斷上升。有調(diào)查研究表明，2013年全世界約有8.4%的成年人糖尿病患者，高達3.82億人。與人類的發(fā)病相似，寵物糖尿病(尤其是犬貓)也呈逐年遞增趨勢，而新近統(tǒng)計結(jié)果顯示，寵物糖尿病發(fā)病率基本在0.5%～1.5%之間。糖尿病是一種復雜的代謝性疾病，主要表現(xiàn)為血糖值高，并伴有神經(jīng)系統(tǒng)、心血管、腎臟等功能障礙[1]。根據(jù)發(fā)病機制不同，糖尿病可分為1型(胰島素依賴性糖尿病)和2型(非胰島素依賴性糖尿病)糖尿病。1型糖尿病表現(xiàn)為胰島β細胞胰島素分泌障礙，患者需終生依賴胰島素。2型糖尿病表現(xiàn)為胰島素抵抗，主要由遺傳因素和環(huán)境因素等引起[2]。針對于2 型糖尿病，臨床上已經(jīng)開發(fā)多種藥物并得到應用，起到一定的控制血糖作用，但患者依然會出現(xiàn)一些急慢性并發(fā)癥。顯而易見，這不是最好的治療糖尿病的手段。2000年加拿大學者埃德蒙創(chuàng)立了“埃德蒙法”，將分離出的胰島細胞團移植入患者體內(nèi)，是解決糖尿病問題的一大進步。但是，由于目前胰島來源相對匱乏，并且需要患者長期使用免疫抑制劑，使其應用受到了一定限制。近年來，逐漸發(fā)展起來的干細胞的相關(guān)研究表明，胰腺干細胞可在體外誘導分化，將誘導分化形成的類胰島細胞回植到患病動物體內(nèi)，可以長期維持血糖的穩(wěn)態(tài)[3]，有望從根本上治愈糖尿病及其并發(fā)癥，為糖尿病的治療提供了新的思路。

1 胰腺干細胞

人體內(nèi)大部分細胞是已達到終末分化狀態(tài)的細胞，如胰島細胞。而胰腺干細胞是未達到終末分化狀態(tài)的細胞，是能產(chǎn)生胰島結(jié)構(gòu)、能夠進行自我復制、定向分化的未定型細胞，是成體干細胞的一種[4]。移植胰腺干細胞，既解決了胚胎干細胞的道德倫理爭論，又不存在胰島β細胞缺乏的弊端。

2 胰腺干細胞的鑒定與分化

目前認為胰腺干細胞主要存在于胰腺的腺泡、導管和胰島中，而且有能力進一步分化為胰腺內(nèi)分泌和外分泌細胞。但胰腺干細胞的鑒定目前尚無確定一致的方法，多數(shù)依賴胰腺中的細胞所表達的蛋白質(zhì)作為分子標記物，如細胞角蛋白-19(cytokeratin-19，CK-19)、胰腺十二指腸同源盒-1(pancreatic duodenal homeobox-1，PDX-1)、巢蛋白(nestin)。試驗結(jié)果表明，在胰島、胰腺導管及外分泌胰腺中均有nestin的表達[5]，研究發(fā)現(xiàn)，胰腺組織中表達nestin的細胞具備干細胞的特性，稱nestin陽性胰島前體細胞。此類細胞也表達PDX-1，它是胰島細胞發(fā)育過程中早期的分化標志。而二者共表達被認為是胰腺干細胞的鑒定標志。研究發(fā)現(xiàn)，小鼠部分胰腺組織自體移植后，有CK-19和胰島素表達，而對照組無相應抗原表達[6]。體外試驗中胰腺導管上皮細胞和胰島細胞在胃泌素與表皮生長因子共同作用下可促進分化成胰島β細胞[7]。

3 胰腺干細胞誘導分化為胰島細胞的方法

3.1 化學試劑體外誘導分化

目前胰島細胞的獲取辦法，主要是基于Lumelsy等提出的五步誘導法[8]。通過分離純化胰腺干細胞，然后進行體外培養(yǎng)，加入營養(yǎng)因子，并誘導分化為具有功能的胰島結(jié)構(gòu)。緊接著，改良后的Bose B的方法有效提高了誘導率，達到65%左右[9]。目前最主要的誘導分化方法是化學誘導法，它通過添加一些化學誘導劑，誘導產(chǎn)生胰島素分泌細胞[10]。Yatoh S等[11]用胰腺腸癌抗原抗體處理導管細胞，得到了胰島素分泌細胞。在導管細胞培養(yǎng)基中加入霍亂毒素或8溴環(huán)磷酸腺苷等促環(huán)磷酸腺苷生成劑，經(jīng)過長期培養(yǎng)以后，發(fā)現(xiàn)了高表達的CK-19與Pdx1陽性細胞，當轉(zhuǎn)染神經(jīng)元素3蛋白(neurogenin3，Ngn3)之后，檢測到了胰島素。在外分泌細胞培養(yǎng)基中添加了Ngn3、Pdx1、肌腱膜纖維肉瘤癌基因同系物A(MafA)，有胰島β細胞產(chǎn)生[12]。另有研究表明，成年大鼠的胰導管上皮細胞在體外由肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF) 介導下也可以分化成β細胞[13]。張慧茹等[14]采用肝細胞生長因子加煙堿加葡萄糖組合，誘導分化仔豬胰腺干細胞，發(fā)現(xiàn)有胰島素產(chǎn)生，并且比用胰高血糖素肽-1誘導產(chǎn)生的胰島素水平要高。同時誘導產(chǎn)生的細胞具有一定的葡萄糖反應性，適當提高葡萄糖濃度，胰島素釋放量增加。

尼克酰胺是維生素B3的一種形式，可以通過代謝產(chǎn)物煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(簡稱輔酶1)廣泛介入許多生命調(diào)節(jié)過程。尼克酰胺在體外定向誘導分化為胰腺前體細胞被廣泛應用[15]。此外，還可作為β細胞分化的一種成熟的促進因子[16]。Kawakami M等[17]通過一種長春花生物堿-conophylline和尼克酰胺聯(lián)合誘導新生仔豬胰腺細胞3周，發(fā)現(xiàn)有新生胰島素分泌細胞產(chǎn)生，且具有較高的葡萄糖反應性。謝謙等[18]也發(fā)現(xiàn)，化學試劑尼克酰胺定向誘導胰腺干細胞，可產(chǎn)生胰島樣組織結(jié)構(gòu)。

3.2 基因誘導方法

基因誘導方法通常是利用基因工程技術(shù)將與β細胞功能相關(guān)的基因或胰島發(fā)育過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子導入干細胞，促進其分化，得到目的細胞的手段[19]。Blyszczuk P等[20]利用基因誘導方法，通過反轉(zhuǎn)錄病毒，將目的基因PDX-1和Pax-4插入小鼠干細胞，發(fā)現(xiàn)插入Pax-4基因的干細胞在體外培養(yǎng)后獲得了胰島樣細胞團，并產(chǎn)生胰島素，細胞團移植回體內(nèi)后出現(xiàn)血糖降低的情況。王鴻武等也發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染Mafa基因的干細胞具有向胰島素分泌細胞分化的潛能[21]。同時體外超表達Ngn3和MafA誘導得到的細胞團也具有降低血糖的作用[22]。近幾年，通過microRNA方法誘導篩選得到的miR-26、miR-182等也能夠促進胰島素分泌細胞形成。而miR-375則能靶向PDK1抑制胰腺干細胞分化[23]。

3.3 間充質(zhì)干細胞促進胰腺干細胞向胰島細胞分化

張迪等[24]在SD大鼠胰腺被膜下多點注射間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)胰腺干細胞標志物nestin、PDX-1的mRNA表達量增高，并且胰島素的mRNA表達量也增高，推測可能是干細胞向β細胞方向發(fā)生分化。因此張迪等認為，內(nèi)源性胰腺干細胞在間充質(zhì)干細胞的影響下，具有促進胰島β細胞新生的功能，對試驗性糖尿病大鼠有治療作用。有研究發(fā)現(xiàn)，干細胞不僅具備較強的增殖和分化能力外，通過細胞共培養(yǎng)，使細胞間充分接觸、融合，可促進細胞成熟和組織修復，進而維持正常組織細胞的功能。張育森等[25]發(fā)現(xiàn)，體外與胰島共培養(yǎng)的胰腺干細胞存活時間加長，將干細胞移植入糖尿病大鼠左腎包膜下后，血糖降低。機制的存在可能是與干細胞間相互接觸，能夠分泌各種促進損傷修復、營養(yǎng)支持的可溶性因子有關(guān) 。

3.4 胰腺干細胞自體移植

因為細胞的分化受細胞外基質(zhì)和胞內(nèi)基因的協(xié)同作用，所以在體外模擬活體內(nèi)干細胞巢的微環(huán)境，并促進干細胞定向分化具有較大難度。干細胞自體移植或許是可行的辦法之一。研究人員嘗試將胰腺干細胞直接移入體內(nèi)，使其在體內(nèi)微環(huán)境的作用下進行分化，得到胰島素分泌細胞。章樂虹等[6]切除大鼠大部分胰腺(>90%)，并將篩選出的胰腺干細胞回植入大鼠自體皮下，植入自體胰腺干細胞8周起，受體鼠血糖水平、糖刺激的耐受能力與對照組有顯著差異。受體小鼠在術(shù)后10周～12周移植物中發(fā)現(xiàn)胰腺樣結(jié)構(gòu)和胰島素染色、CK-19染色陽性細胞。說明大鼠胰腺內(nèi)存在胰腺干細胞，并在移植后能分化為胰島素陽性細胞，有效改善鼠的血糖水平，同時避免了免疫排斥反應。張悅等[26]研究發(fā)現(xiàn)，胰腺實質(zhì)內(nèi)原位移植胰腺干細胞的胎鼠，血清胰島素含量上升，高血糖癥狀有所緩解，病理切片可見外源性的細胞團，免疫組化顯示nestin、胰島素呈陽性表達。而肝及腎包膜下移植大鼠各項指標未見明顯改善。提示這可能是活體內(nèi)干細胞巢促使胰腺干細胞分化，促進胰島樣細胞團生成。

3.5 在體激活胰腺干細胞，促其分化為胰島細胞

傳統(tǒng)的糖尿病治療藥物主要通過刺激胰島β細胞分泌胰島素、提高機體胰島素敏感性或延緩葡萄糖的生成來控制血糖水平，這對糖尿病有一定的緩解作用，卻未能根治糖尿病或阻止糖尿病并發(fā)癥的形成，甚至會增加胰島細胞負擔，加快胰島細胞功能衰竭。目前，最好的治療糖尿病的方法是開發(fā)一種新藥，能在活體內(nèi)促進胰腺干細胞分化為胰島β細胞，既方便服用，又避免了胰島細胞負擔及胰島移植的免疫排斥反應。目前科研工作者也正在不斷嘗試，我們期望在不遠的將來成為現(xiàn)實。

綜上所述，目前能分化為胰島細胞的干細胞主要是胚胎干細胞和成體干細胞，胰腺干細胞作為成體干細胞，能夠在一定條件下誘導分化為胰島細胞。研究表明，目前通過細胞共培養(yǎng)和化學法誘導得到胰島素分泌細胞的方法，較為常用，但轉(zhuǎn)分化效率并不高?；蛘T導法可直接獲得目的產(chǎn)物，有望從根本上獲取胰島素分泌細胞，但安全性上有待探討。胰腺干細胞自體移植較為安全，且無免疫排斥反應，臨床上較為可行，有望成為糖尿病治療的主要手段。同時，服用藥物，在體激活胰腺干細胞，規(guī)避了上述多種誘導手段的缺點，且方便可行，將成為未來糖尿病治療的趨勢。

致謝：感謝沈陽農(nóng)業(yè)大學畜牧獸醫(yī)學院林樹梅副教授對文稿所提的寶貴意見。

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2017-04-24

國家自然科學基金項目(31572481)

段佳慧(1993-)，女，遼寧昌圖人，碩士研究生，主要從事基礎(chǔ)獸醫(yī)學研究。*

S852.2

A

1007-5038(2017)12-0111-04