靳亞西，孫彩顯，高 虹，張連峰，張 麗

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

研究報(bào)告

利用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)檢測胰腺癌細(xì)胞的藥物敏感性

靳亞西，孫彩顯，高 虹，張連峰，張 麗*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 基于實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)評估胰腺癌細(xì)胞的藥物敏感性，為胰腺癌個(gè)體化診療提供參考。方法 選取SW1900、Capan-2、PANC-1三株人胰腺癌細(xì)胞系，選用鹽酸吉西他濱和替吉奧膠囊兩種胰腺癌治療藥物，接種24 h后分別梯度濃度給藥，實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)監(jiān)測給藥前后細(xì)胞生長曲線，計(jì)算藥物對胰腺癌細(xì)胞的生長抑制率(IC50)。同時(shí)，細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)給藥，進(jìn)行AO/EB染色和激光共聚焦觀察。結(jié)果 藥物作用72 h，同一藥物對不同細(xì)胞抑制率不同。鹽酸吉西他濱對SW1900、Capan-2、PANC-1細(xì)胞的IC50分別為1.69、10.05、12.74 μmol/L。替吉奧膠囊對SW1900、Capan-2、PANC-1細(xì)胞的IC50分別為180.29、765.70、95.57 μmol/L。AO/EB染色驗(yàn)證IC50真實(shí)可靠。結(jié)論 SW1900及Capan-2細(xì)胞可作為鹽酸吉西他濱及替吉奧的對照，建立細(xì)胞模型，對藥物進(jìn)行體外篩選，為臨床利用該技術(shù)進(jìn)行病人腫瘤藥物篩選提供一個(gè)參考，具有一定的借鑒意義。

胰腺癌；化療藥物；實(shí)時(shí)細(xì)胞分析；藥物敏感性

胰腺癌(pancreatic carcinoma)是一種消化系統(tǒng)性惡性腫瘤，40～70歲多見，男性多于女性，已成為我國人口死亡的十大惡性腫瘤之一。近年來，年輕的胰腺癌病人也較10年前有明顯增加的趨勢，而且惡性度更高，預(yù)后更差。大多數(shù)胰腺癌病人在早期可無明顯癥狀，確診時(shí)已到中晚期，治療效果較差，5年生存率低于6%[1]，死亡率與發(fā)病率相近[2]。胰腺癌常見的治療方式包括切除手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療以及姑息治療等。手術(shù)治療和放射治療僅針對早期未轉(zhuǎn)移患者，因此，化學(xué)治療是治療中晚期胰腺癌的重要手段[3]。而化療藥物的正確選擇將直接影響療效。

不同病人對不同藥物敏感性不同，治療前對藥物敏感性進(jìn)行評估,可以為臨床治療提供參考，提高治療效果，減少毒副作用。藥敏試驗(yàn)還可調(diào)整和優(yōu)化個(gè)體化診療方案[4,5]，但化療敏感性評估目前還沒有一種較為理想的方法[6，7]。因此，發(fā)展簡便穩(wěn)定的藥敏評估方法是對臨床患者藥物敏感性評估和保證個(gè)體化治療的關(guān)鍵。

近年發(fā)展起來的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)(RTCA)是一種通過檢測培養(yǎng)環(huán)境中阻抗的變化而動(dòng)態(tài)監(jiān)測細(xì)胞生長情況的技術(shù)，與傳統(tǒng)方法相比有細(xì)胞用量少、高通量快速和操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，是一種新型的適合靶點(diǎn)藥物評估和中高通量的藥物篩查的理想方法[8]。本實(shí)驗(yàn)室在之前的研究中已經(jīng)成功利用RTCA法比較5種前列腺癌細(xì)胞系對三種化療藥物的敏感性，證實(shí)了該方法用于前列腺癌藥敏研究的可行性[9]。本研究再次將RTCA技術(shù)推廣應(yīng)用到胰腺癌細(xì)胞藥敏評價(jià)研究當(dāng)中，驗(yàn)證該技術(shù)在不同類型腫瘤，不同藥物的藥敏研究中的應(yīng)用價(jià)值，并可為胰腺癌個(gè)體化治療和臨床推廣提供細(xì)胞模型與參考。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

SW1900人胰腺癌脾轉(zhuǎn)移細(xì)胞、Capan-2人胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞、PANC-1人胰腺導(dǎo)管癌細(xì)胞，采用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(Gbico)，于5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)前一天進(jìn)行細(xì)胞傳代，細(xì)胞滿度在60%～80%之間，收集細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，濃度為5×105cells/mL，接種在E-plate 16檢測板(艾森生物)上用于RTCA分析。

1.2 藥物配制

鹽酸吉西他濱(北京百靈威科技有限公司)溶于DPBS中，DMEM培養(yǎng)基稀釋成100 μmol/L的儲液；替吉奧(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)溶于DMSO中，DMEM培養(yǎng)基稀釋成成1 mmol/L的儲液, 均分裝，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞生長分析

RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀(real-time cell analyzer，RTCA)采用xCELLigence細(xì)胞功能分析儀DP系統(tǒng)，購自艾森生物(杭州)有限公司，用于細(xì)胞增殖分析。檢測板E-Plate 16 的底部整合有微金電子傳感器芯片，當(dāng)貼壁生長在微電極表面的細(xì)胞引起電極界面阻抗的改變時(shí)，該阻抗值的變化直接反映細(xì)胞的生物學(xué)狀態(tài)。其主要分析參數(shù)為細(xì)胞指數(shù)(cell index)，與細(xì)胞覆蓋面積成正比。

檢測板每孔加入50 μL培養(yǎng)基，放入RTCA Station(艾森生物)中測定基線，保證每孔接觸正常并且細(xì)胞指數(shù)在正常值之內(nèi)。取制備好的胰腺癌細(xì)胞懸液，分別以每孔5×103、1×104、2×104個(gè)細(xì)胞量接種于E-Plate 16檢測板中，在超凈臺中靜置30 min后，置于培養(yǎng)箱中的RTCA工作站中，每隔15 min記錄細(xì)胞指數(shù)，總時(shí)長96 h。

1.4 RTCA實(shí)時(shí)藥物敏感性評價(jià)

取對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞，分別以每孔1×104個(gè)接種于檢測板E-Plate 16中，放到培養(yǎng)箱中的RTCA Station中培養(yǎng)并檢測，24 h后添加藥物。實(shí)驗(yàn)組分別加入0.1、0.5、1、10、50、100 μmol/L的鹽酸吉西他濱，0.031 25、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L的替吉奧；對照組中加入無藥物的溶解液，空白組中加入DMEM培養(yǎng)基。給藥后繼續(xù)在RTCA Station中進(jìn)行培養(yǎng)并檢測。

1.5 吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB)雙熒光染色

取對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞，分別以每孔1×105個(gè)接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后分別加入半數(shù)致死濃度的鹽酸吉西他濱或者替吉奧藥物溶液，每組3孔重復(fù)。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)72 h后進(jìn)行吖啶橙/溴化乙啶(AO/EB染色。染色方法：棄去帶藥物培養(yǎng)基，PBS 沖洗兩遍，加入AO/EB混合液(各100 μg/mL)，室溫20 min染色[10]，用溫PBS沖洗兩遍，激光共聚焦顯微鏡(Leica)下觀察拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用RTCA Software 2.0系統(tǒng)軟件和Student’st-tests分析處理數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*P< 0.05為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞最佳接種量確定

注：a，SW1900細(xì)胞增殖曲線；b，Capan-2細(xì)胞增殖曲線； c，PANC-1細(xì)胞增殖曲線。圖1 三種胰腺癌細(xì)胞96 h增殖曲線Note. a, SW1990 cells; b, Capan-2 cells; c, PANC-1 cells. Fig.1 Proliferation curves of the three pancreatic cancer cell lines cultured for 96 hours

SW1900、Capan-2 和 PANC-1等三株胰腺癌細(xì)胞，均制備細(xì)胞懸液，梯度稀釋，采用每孔5×103、1×104、2×104個(gè)不同接種量，接種于檢測板E-plate 16中，檢測96 h內(nèi)細(xì)胞指數(shù)變化，觀察細(xì)胞的生長增殖過程系統(tǒng)軟件生成細(xì)胞生長曲線(圖1)。如圖1所示，以96 h內(nèi)形成最佳S型增值曲線為標(biāo)準(zhǔn)，確定三株胰腺癌細(xì)胞的最佳接種量均為每孔1×104個(gè)/孔。

2.2 不同胰腺癌細(xì)胞系對鹽酸吉西他賓敏感性對比分析

取對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞，按上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳接種濃度，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于檢測板E-Plate 16 中，培養(yǎng)24 h后給藥，RTCA分析細(xì)胞增殖曲線。鹽酸吉西他濱藥物劑量分別為0.1、0.5、1、10、50、100 μmol/L。另設(shè)藥物溶劑對照和空白對照。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)并檢測CI變化(圖2a-c)。結(jié)果表明鹽酸吉西他濱對SW1990、Capan-2、PANC-1三種細(xì)胞系72 h的IC50分別為(1.69±0.21)μmol/L，(10.05±0.24)μmol/L，(12.74±1.17)μmol/L。其中SW1990對鹽酸吉西他濱最敏感，而PANC-1最不敏感。

注：a，鹽酸吉西他濱對SW1990的IC50為1.69 μmol/L； b，鹽酸吉西他濱對Capan-2的IC50為10.05 μmol/L； c，鹽酸吉西他濱對PANC-1的IC50為12.74 μmol/L；d，鹽酸吉西他濱對三株細(xì)胞的IC50統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。n=6，*P < 0.05。圖2 3種胰腺癌細(xì)胞對鹽酸吉西他濱劑量反應(yīng)曲線(變斜率)Note. a, The IC50 of gemcitabine hydrochloride for SW1990 cells was 1.69 μmol/L; b, The IC50 of gemcitabine hydrochloride for Capan-2 cells was 10.05 μmol/L; c, The IC50 of gemcitabine hydrochloride for PANC-1 cells was 12.74 μmol/L; d, Statistical comparison of the IC50 of gemcitabine hydrochloride for the three cell lines. n=6, *P<0.05.Fig.2 The dose-response (variable slope) curves of gemcitabine hydrochloride for the three pancreatic cancer cell lines

注：a，替吉奧對SW1990的IC50為180.29 μmol/L； b，替吉奧對Capan-2的IC50為760.70 μmol/L； c，替吉奧對PANC-1的IC50為95.57 μmol/L；d，替吉奧對三株細(xì)胞的IC50統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。n=6, *P < 0.05。圖3 胰腺癌3種細(xì)胞對替吉奧劑量反應(yīng)曲線(變斜率)Note. a, The IC50 of compound tegafur capsule for SW1990 cells was 1.69 μM; b, The IC50 of compound tegafur capsule for Capan-2 cells was 10.05 μmol/L; c, The IC50 of compound tegafur capsule for PANC-1 cells was 12.74 μmol/L; d, Comparison of IC50 of compound tegafur capsule for the three cell lines. n=6, *P < 0.05.Fig.3 The dose-response (variable slope) curves of gemcitabine hydrochloride for the three pancreatic cancer cell lines

2.3 不同胰腺癌細(xì)胞系對替吉奧敏感性對比分析

取對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞，按上述實(shí)驗(yàn)確定的最佳接種濃度，以1×104個(gè)細(xì)胞/孔接種于檢測板E-Plate 16 中，培養(yǎng)24 h后給藥，RTCA分析細(xì)胞增殖曲線。替吉奧藥物劑量分別為0.03125、0.0625、0.125、0.25、0.5、1 mmol/L。另設(shè)藥物溶劑對照和空白對照。給藥后繼續(xù)培養(yǎng)并檢測CI變化(圖3a-c)。結(jié)果表明替吉奧對SW1990、Capan-2、PANC-1三種細(xì)胞系72 h的IC50分別為(180.29±17.06)μmol/L，(765.70±11.72)μmol/L，(95.57±5.11)μmol/L。其中PANC-1細(xì)胞對替吉奧最敏感，而Capan-2細(xì)胞最不敏感。

2.4 AO/EB染色驗(yàn)證胰腺癌細(xì)胞對鹽酸吉西他賓和替吉奧敏感性

取對數(shù)生長期的胰腺癌細(xì)胞，每孔1×105個(gè)接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后，根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)計(jì)算得到的IC50 分別加入半數(shù)致死濃度的鹽酸吉西他濱及替吉奧藥物溶液。72 h后AO/EB熒光染色，激光共聚焦顯微鏡觀察拍照(圖4a-i)。吖啶橙可透過正常細(xì)胞膜，使細(xì)胞呈綠色熒光，溴化乙錠只能透過破損細(xì)胞膜，嵌入DNA產(chǎn)生紅色熒光，由此可區(qū)分出正常細(xì)胞和壞死細(xì)胞。結(jié)果顯示，使用RTCA法計(jì)算的半數(shù)致死藥物濃度作用SW1990、Capan-2、PANC-1細(xì)胞72 h后，約半數(shù)細(xì)胞死亡，直觀證實(shí)該法所得IC50值真實(shí)可信。

注：a，SW1990細(xì)胞給藥前；b，鹽酸吉西他濱作用于SW1990細(xì)胞；c，替吉奧膠囊作用于SW1990細(xì)胞; d，Capan-2細(xì)胞給藥前；e，鹽酸吉西他濱作用于Capan-2細(xì)胞；f，替吉奧膠囊作用于Capan-2細(xì)胞；g，PANC-1細(xì)胞給藥前；h, 鹽酸吉西他濱作用于PANC-1細(xì)胞；i，替吉奧膠囊作用于PANC-1細(xì)胞。圖4 AO/EB雙熒光染色Note. a, Pre-administration of SW1990; b, Gemcitabine hydrochloride (IC50) treatment on SW1990; c, Compound tegafur capsule (IC50) treatment on SW1990; d, pre-administration of Capan-2; e, Gemcitabine hydrochloride (IC50) treatment on Capan-2; f, Compound tegafur capsule (IC50) treatment on Capan-2; g, Pre-administration of PANC-1; h, Gemcitabine hydrochloride (IC50) treatment on PANC-1; i, Compound tegafur capsule (IC50) treatment on PANC-1. Scale=250 um.Fig.4 AO/EB double staining of the three pancreatic cancer cell lines

3 討論

目前，在常規(guī)胰腺癌化療中，所有患者往往只采用一種以全體通用和常用劑量為基礎(chǔ)的藥物診療方式。這種診療方式治療效果不佳甚至無效，目前認(rèn)為主要原因與腫瘤的異質(zhì)性與耐藥性的形成有關(guān)[11]，因此，單一治療方案根本無法滿足臨床化療的實(shí)際需要，個(gè)體化治療勢在必行[12,13]。

而腫瘤個(gè)體化治療評估，除了采用對腫瘤細(xì)胞的DNA、RNA及生物標(biāo)記物進(jìn)行鑒定外，就是對腫瘤細(xì)胞進(jìn)行藥物敏感性及耐藥性實(shí)驗(yàn)[14]。鑒于腫瘤的復(fù)雜性、異質(zhì)性，整合患者樣本建立體外模型以對體內(nèi)藥物反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測是個(gè)體化醫(yī)療的發(fā)展趨勢[15]。這些模型可以用于藥物敏感性及耐藥性檢測，避免盲目無效用藥，提高腫瘤化療療效[16-19]。

本研究將RTCA實(shí)時(shí)細(xì)胞分析技術(shù)應(yīng)用于胰腺癌細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，檢測2種臨床常用化療藥物鹽酸吉西他濱和替吉奧膠囊對3株胰腺癌細(xì)胞的體外抑制率。結(jié)果證明，SW1990細(xì)胞對鹽酸吉西他濱敏感性最強(qiáng)，而PANC-1細(xì)胞敏感性最差；PANC-1細(xì)胞對替吉奧敏感性最強(qiáng)，而Capan-2細(xì)胞敏感性最差。可將SW1990細(xì)胞作為高度敏感對照，PANC-1細(xì)胞作為不敏感對照，建立對鹽酸吉西他濱的體外藥物篩選體系；可將PANC-1細(xì)胞作為高度敏感對照，Canpan-2細(xì)胞作為不敏感對照，建立對替吉奧的體外藥物篩選體系，具有向臨床推廣，進(jìn)行個(gè)體化藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的價(jià)值。且本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已有研究具有一致性[20]。

而且，本研究還采用經(jīng)典的AO/EB雙熒光染色結(jié)合激光共聚焦對RTCA法計(jì)算得到的兩種藥物對細(xì)胞的IC50進(jìn)行二次驗(yàn)證，證實(shí)了RTCA法的真實(shí)性。另有其他多項(xiàng)研究證明，RTCA在藥物敏感性實(shí)驗(yàn)中具有可靠性，與傳統(tǒng)的MTT等方法測定的結(jié)果吻合[21-25]。證明該方法真實(shí)有效且更加簡單靈敏，可以應(yīng)用于臨床患者藥物敏感性評價(jià)。

綜上所述，本研究將RTCA技術(shù)應(yīng)用到胰腺癌細(xì)胞對臨床治療藥物的藥敏研究當(dāng)中，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了該技術(shù)并可用于更多類型腫瘤細(xì)胞，更多藥物的藥敏研究。證實(shí)了其在高通量快速藥物篩查和藥敏評估中的重要應(yīng)用價(jià)值，可為個(gè)體化治療和臨床推廣提供胰腺癌細(xì)胞模型與參考。

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Drug sensitivity assessment of pancreatic cancer cells by real-time cell analysis

JIN Ya-xi, SUN Cai-xian, GAO Hong, ZHANG Lian-feng, ZHANG Li*

(Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine, Ministry of Health, Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100021，China)

Objective To assess the drug sensitivity of pancreatic cancer cells based on real-time cell analysis and provide a reference for individualized diagnosis and treatment of pancreatic cancer.Methods Three human pancreatic cancer cells lines SW1900, Capan-2 and PANC-1 were selected and treated with gemcitabine hydrochloride and tegafur gimeracil oteracil potassium capsules, respectively. After 24 hours of culture, the cells were treated with the two drugs in gradient concentration. The cell growth curves before and after the drug administration was monitored using a real-time cells analyzer and the growth inhibition rates (IC50) of the drugs of the pancreatic cancer cells were calculated. At the same time, the cells in the cell culture plate were treated with the drug, and acridine orange/ethidium bromide (AO/EB) staining and laser scanning confocal microscopy were performed to observe the changes of cells after the drug administration. Results 72 hours after the drug administration, IC50 values for the three cell lines were different. The IC50 values of gemcitabine hydrochloride for SW1900, Capan-2 and PANC-1 cells were 1.69 μmol/L, 10.05 μmol/L and 12.74 μmol/L, respectively. The IC50 values of tegafur capsule for SW1900, Capan-2 and PANC-1 cells were 180.29 μmol/L, 765.70 μmol/L and 95.57μmol/L, respectively. AO/EB staining confirmed the reliability of IC50. Conclusions SW1900 and Capan-2 cells can be used as the control for gemcitabine hydrochloride and tegafur gimeracil oteracil potassium capsules to establish cell models for drug screeninginvitro, which provides a reference for the application of the technology in anticancer drugs screening.

Pancreatic cancer; Chemotherapeutic drugs; Real-time cell analysis; Drug sensitivity

衛(wèi)生行業(yè)科研專項(xiàng) (201402001)。

靳亞西，女，碩士生，研究方向：比較醫(yī)學(xué)。E-mail: Jinyaxi@yeah.net

張麗(1981-)，女，助理研究員，研究方向：比較醫(yī)學(xué)。E-mail: zhangl@cnilas.org

R-33

A

1671-7856(2017) 03-0025-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.03.005

2016-07-27