連總強滾雙寶李 力張 鋒肖 偉吳旭東

(1. 寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所, 銀川 750001; 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070; 3. 寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心, 銀川 750001)

基于第二代測序技術(shù)蘭州鲇線粒體基因組全序列測定與分析

連總強1,2,3滾雙寶2李 力1,3張 鋒1,3肖 偉1,2,3吳旭東1,2,3

(1. 寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所, 銀川 750001; 2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 蘭州 730070; 3. 寧夏漁業(yè)工程技術(shù)研究中心, 銀川 750001)

研究采用高通量第二代測序技術(shù), 構(gòu)建獲得蘭州鲇(Silurus lanzhouensis)線粒體基因組全序列, 并對全序列特征和結(jié)構(gòu)進行了分析。研究結(jié)果表明, 蘭州鲇線粒體基因組全序列長度為16523 bp, 堿基組成具有高A+T低G+C含量的偏向性, 具有脊椎動物典型的結(jié)構(gòu)組成。13個PCG基因中存在2種啟動子(ATG、GTG)、3種終止子(TAG、TAA和T或TA)。除tRNA-Ser(AGN)基因二級結(jié)構(gòu)中DHU臂缺失, 其余21個tRNA基因可折疊成典型三葉草結(jié)構(gòu)。12S rRNA二級結(jié)構(gòu)由45個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成4個結(jié)構(gòu)域, 16S rRNA由54個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成6個結(jié)構(gòu)域。含有關(guān)鍵序列標(biāo)簽的控制區(qū)(CR)可分為3個不同的結(jié)構(gòu)域: 終止序列區(qū)(TAS1、TAS2)、中央保守區(qū)(CSB-F、CSB-E和CSB-D)和保守序列區(qū)(CSB1、CSB2和CSB3)。非編碼區(qū)含有一段保守的控制輕鏈復(fù)制起始的序列區(qū)(OL)。基于線粒體基因組全序列和通用標(biāo)簽COX1基因標(biāo)記可區(qū)分蘭州鲇同其他鲇形目魚類種質(zhì)進化關(guān)系。

蘭州鲇; 線粒體基因組; 結(jié)構(gòu)特征; 系統(tǒng)發(fā)育

蘭州鲇(Silurus lanzhouensis)又名黃河鯰, 隸屬于鲇形目(Siluriformes)、鲇科(Siluridea)、鲇屬(Silurus), 是我國黃河中上游特有的大型經(jīng)濟魚類,具有較高營養(yǎng)價值和產(chǎn)業(yè)化養(yǎng)殖價值, 成為近年來技術(shù)研究與養(yǎng)殖開發(fā)領(lǐng)域的焦點。但由于過度捕撈、水利工程等因素, 蘭州鲇野生種群數(shù)量日益減少, 已被《中國物種紅色名錄》列為瀕危物種[1]。鑒于此, 農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)在寧夏回族自治區(qū)水產(chǎn)研究所科研基地建設(shè)國家級蘭州鲇原種場, 項目單位先后攻克了蘭州鲇人工馴養(yǎng)、人工繁育等關(guān)鍵技術(shù)并開展了相關(guān)的增殖保護工作, 目前正在開展良種選育工作。

迄今為止, 關(guān)于蘭州鲇的研究主要集中于形態(tài)學(xué)[2]、生理生化學(xué)[3,4]和群體遺傳學(xué)[5]等領(lǐng)域。此外, 王慶榮等[6]在北京某農(nóng)貿(mào)市場采集來源于山東某養(yǎng)殖場樣本并采用PCR擴增產(chǎn)物直接測序和引物行走法構(gòu)建獲得了蘭州鲇線粒體基因組序列(GenBank: J F895472)。本課題組以蘭州鲇原種為試驗材料, 采用克隆測序的方式構(gòu)建獲得了線粒體細胞色素b (Cytb)基因全序列[7], 并與王慶榮等研究結(jié)果進行了鲇屬魚類系統(tǒng)進化關(guān)系的研究, 二者對蘭州鲇分類存在一定分歧。

脊椎動物線粒體DNA(mtDNA)具有自我復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯功能, 突變率高, 進化速度快。通過對mtDNA的基因結(jié)構(gòu)和序列特征分析, 可以獲得豐富的遺傳進化信息, 目前已廣泛應(yīng)用于動物系統(tǒng)發(fā)育、物種分類、群體遺傳進化、種質(zhì)鑒定等領(lǐng)域。鑒于此, 本研究在前人研究的基礎(chǔ)上, 采集國家級蘭州鲇原種場野生群體繁育的F1代群體樣本,利用高通量第二代測序技術(shù)開展蘭州鲇線粒體基因組全序列與結(jié)構(gòu)特征研究, 進一步分析鲇科魚類系統(tǒng)進化關(guān)系, 以期為蘭州鲇物種分類、種質(zhì)鑒定、良種選育提供更加可靠的技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

按照蘭州鲇種質(zhì)鑒定標(biāo)準(zhǔn), 隨機選取國家級蘭州鲇原種場培育4冬齡的F1代蘭州鲇3尾, 采集尾鰭去離子水沖洗后, 置于無水乙醇中-20℃保存。組織DNA的提取依據(jù)上海生工動物基因組DNA提取試劑盒說明進行, 核酸定量分析儀、1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和完整性。

1.2 全基因組二代測序

混合經(jīng)檢測合格的3個DNA樣品建立混合池,通過Covaris超聲波破碎儀隨機打斷成長度為180—330 bp的片段, 構(gòu)建蘭州鲇小片段基因組DNA文庫,進行Hiseq 2500二代測序。應(yīng)用CLC Genomics Workbench v7.5軟件進行raw data的質(zhì)量修剪, 得到相同數(shù)量clean paired reads。

1.3 基因組組裝與注釋

以鲇形目魚類線粒體全基因組序列為初始參照序列(表 1), 應(yīng)用GENEIOUS R8 (Biomatters Ltd., Auckland, New Zealand)軟件進行線粒體基因組注釋。轉(zhuǎn)運RNA (tRNAs)及核糖體RNA (rRNA) 注釋應(yīng)用在線軟件MITOS Web Server (http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py)[8]進行分析, 基于已有鲇形目魚類線粒體基因組比對進行蛋白編碼基因(PCGs)及D-loop注釋。MEGA6.0軟件進行鲇科魚類線粒體基因組序列堿基組成特征、密碼子使用情況及堿基偏移度分析。

表 1 鲇形目魚類線粒體系統(tǒng)發(fā)育分析基因組Tab. 1 The complete mitochondrial genomes used for phylogenetic analyses in this study

1.4 基因二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蘭州鲇線粒體tRNA基因定位采用在線tRNAscan-SE 1.21軟件進行分析, tRNA基因二級結(jié)構(gòu)預(yù)測使用RNA structure 5.3軟件進行分析。參照黑尾地鴉(Podoces hendersoni) 12S rRNA[9]和麥穗魚(Pseudorasbora parva)16S rRNA[10]基因二級結(jié)構(gòu), RNA-structure 4.6 和Rnaviz2.0.3[11]軟件進行蘭州鲇12S rRNA、16S rRNA基因二級結(jié)構(gòu)預(yù)測。

1.5 鲇科魚類系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

2 結(jié)果

2.1 線粒體基因組的組成

本研究采用高通量第二代測序技術(shù), 構(gòu)建獲得蘭州鲇線粒體全基因組序列長度為16523 bp (Gen-Bank: KP255959), 包含有13個蛋白編碼基因(PCG)、22個tRNA基因、2個rRNA基因和1個控制區(qū)(圖1)。蛋白質(zhì)編碼基因、rRNA基因、tRNA基因和非編碼區(qū)分別占整個線粒體長度的68.94%、9.41%、15.92%和5.77%。蘭州鲇線粒體各基因大小、位點及排列順序與大多數(shù)脊椎動物相一致, 除控制區(qū)序列長度呈現(xiàn)較大程度的差異、同源性相對較低外,蛋白質(zhì)編碼基因、rRNA基因、tRNA基因區(qū)段序列與本研究分析的鲇形目魚類線粒體基因組序列長度差異較小, 同源性較高, 具體位點信息見表 2。

圖 1 蘭州鲇線粒體基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 Schematic Map of the mitochondrial genome of Silurus lanzhouensis in this study

2.2 核苷酸組成

由表 3可以看出, 鲇形目魚類基因組A+T含量(55.02%—56.49%)均高于G+C含量(43.51%—46.98%),核苷酸組成具有明顯的AT偏向性, 其中本研究蘭州鲇的A+T含量最高, 全基因組為56.49%, 蛋白質(zhì)編碼基因為56.36%, 轉(zhuǎn)運tRNA基因為56.71%, 核糖rRNA基因為55.37%, 控制區(qū)更是高達61.08%。本研究中蘭州鲇線粒體全基因組堿基含量由高到低依次為: A (30.41%)＞C (27.75%)＞T (26.08%)＞G (15.76%), A+T skew堿基組成和G+C skew堿基組成分別為0.076和-0.276, 其他鲇形目魚類及王慶榮所報道的蘭州鲇線粒體基因組中腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)含量較本研究的更高(A+T skew: 0.089—0.096; G+C skew: -0.285— -0.280), 表明鲇形目魚類線粒體基因組中含有較多的腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)。通過以上研究發(fā)現(xiàn), 鲇形目魚類各基因堿基組成表現(xiàn)出控制區(qū)含有相對較高的胸腺嘧啶(T)和鳥嘌呤(G), 而tRNA和rRNA基因具有相對較高腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)含量, 且本研究中蘭州鲇除tRNA基因的腺嘌呤(A)和胞嘧啶(C)含量較其他種類高外,其余各基因及區(qū)段的均較低。

表 2 蘭州鲇線粒體基因組注釋結(jié)果Tab. 2 The results of the complete mitochondrial genome annotation for Silurus lanzhouensis

表 3 鲇屬魚類線粒體基因組堿基組成Tab. 3 Composition and skewness in the mitochondrial genomes of Silurus species

2.3 蛋白質(zhì)編碼基因(PCGs)

本研究中蘭州鲇13個蛋白編碼基因同大多數(shù)硬骨魚類一樣含有兩種起始密碼子(GTG、ATG),除COX1基因使用GTG作為起始密碼子外, 其余12個基因均使用ATG作為起始密碼子。相對于起始密碼子的穩(wěn)定性, 終止密碼子在物種內(nèi)和物種間變化較多。本研究中的蘭州鲇終止密碼子有3種(表 2), 其中TAA為ATP6、ND4L、COX1、ND1、ND5、ND6、和ATP8等7個基因的終止密碼子, TAG為ND2和ND3基因的終止密碼子, COX2、COX3、ND4和CYTB基因則使用不完全的T和TA作為終止密碼子。

13個PCG基因序列總長度11391 bp, 除終止密碼子外共有3768個密碼子。應(yīng)用MEGA6.0軟件分析堿基使用頻率, 密碼子第一位點偏倚度最小, 第二位點偏倚度最大, 存在明顯堿基偏向性, A、G含量分別為31.3%、9.4%, 以上堿基偏移現(xiàn)象也常見于其他脊椎動物。密碼子平均使用頻率和相對同義密碼子平均使用頻率分析結(jié)果表明, 蘭州鲇13個PCG基因中存在32個偏好密碼子(RSCU≥1), 其中以第三位點為A或C的密碼子在編碼同種氨基酸中具有較高的使用頻率, 除密碼子GAA (E)、CCA (P)、AGA (*)和CAC (H)、CUC (L)、AUC (I)、GUC (V)、CGC (R)、AGC (S)外, 密碼子第3位為C、A堿基的密碼子RSCU值均大于1, 密碼子第三位點對A、C偏好性與蛋白質(zhì)編碼基因密碼子的第三位點對A、C偏向性表現(xiàn)出正相關(guān)性(表 4)。

2.4 核糖RNA(rRNA)基因

本研究中蘭州鲇12S rRNA基因和16S rRNA的序列長度分別為952和1676 bp (表 1)。采用同源序列對比分析法, 分別構(gòu)建預(yù)測12S rRNA和16S rRNA基因二級結(jié)構(gòu)。由圖 2可見, 12S rRNA二級結(jié)構(gòu)中包含有由45個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成的第Ⅰ-第Ⅳ結(jié)構(gòu)域, 其中第Ⅰ、第Ⅱ結(jié)構(gòu)域為可變區(qū), 第Ⅲ和第Ⅳ結(jié)構(gòu)域為保守區(qū)。16S rRNA二級結(jié)構(gòu)由54個莖環(huán)結(jié)構(gòu)組成6個(Ⅲ-Ⅵ)結(jié)構(gòu)域(圖 3), 各個結(jié)構(gòu)域之間由一段單鏈區(qū)分。其中第Ⅰ-第Ⅲ及第Ⅵ結(jié)構(gòu)域為可變區(qū), 第Ⅳ與第Ⅴ結(jié)構(gòu)域為保守區(qū)。通過蘭州鲇與麥穗魚的堿基序列對比及二級結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),兩個物種間的堿基突變、插入和缺失較多。在以上rRNA二級結(jié)構(gòu)及基因序列對比分析中發(fā)現(xiàn), 12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守, 莖區(qū)堿基序列比環(huán)區(qū)更加高度保守。

2.5 轉(zhuǎn)運RNA(tRNA)基因

通過對蘭州鲇線粒體22個tRNA基因進行定位及二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析, 結(jié)果表明22個tRNA基因分布于13個蛋白編碼基因之間, 大小從66到75 bp不等, 總長度為1554 bp (圖 1)。通過對比分析發(fā)現(xiàn),蘭州鲇tRNA基因中三對相鄰的tRNA(如: tRNAIle與tRNA-Gln、tRNA-Gln與tRNA-Met、tRNAThr與tRNA-Pro)間存在1個或2個核苷酸相互折疊的現(xiàn)象, 這種現(xiàn)象也存在于其他鲇科魚類中[14], 不同之處僅是折疊堿基數(shù)存在差異。22個tRNA基因中的14個由H-鏈編碼, 另外8個由L-鏈編碼(表 2)。所有tRNA基因序列的A+T堿基含量較控制區(qū)的低,較PCGs和rRNA基因序列的高。除tRNA-Ser(AGN)外, 其余tRNA基因均形成典型三葉草結(jié)構(gòu)(圖 4)。

2.6 控制區(qū)(CR)

富含A+T的控制區(qū)雖不編碼蛋白質(zhì), 但在調(diào)控線粒體DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中具有重要作用。本研究在tRNA-Pro和tRNA-Phe基因之間識別出了由889 bp堿基序列組成的控制區(qū), 該區(qū)域含有啟動H-鏈復(fù)制的序列(圖 1)。同其他鲇形目魚類相比, 除了個別位點存在插入/缺失現(xiàn)象, 控制區(qū)相對保守, 序列長度和A+T含量在不同物種間無顯著差異(表 3)。

同許多脊椎動物一樣, 蘭州鲇的控制區(qū)可分為三個結(jié)構(gòu)域(圖 5): ①終止序列區(qū)又稱高變區(qū)(Hypervariable Domain), 在三個區(qū)域中變異最大, 長度為208 bp。蘭州鲇終止序列區(qū)含有兩個控制線粒體DNA復(fù)制終止功能的相關(guān)序列(TAS-1、TAS-2),該區(qū)段序列可由2對核心序列TACAT與其反向互補的ATGTA序列形成包含49個堿基的熱穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)。②中央保守區(qū), 位于209nt—630 nt處, 該區(qū)域包含有3個保守序列, 分別是CSB-D、CSB-E和CSB-F。其中CSB-F位于289nt—316 nt處, 其關(guān)鍵序列為AGAGACCATC, 該序列被認為是區(qū)分終止

區(qū)和中央保守區(qū)的標(biāo)志[15]。Lee等[16]所描述的CSBE中存在GTGGG-box已被研究者廣泛認可, 本研究中識別出蘭州鲇GTGGG-box位于352—377 nt, 識別關(guān)鍵序列為AGGGTCAGGGACAAACTTGTGG GGG。CSB-D位于控制區(qū)393—407 nt處, 在鲇形目魚類中變異較大, 且鲇形目魚類中識別的關(guān)鍵序列為TATTCTGGATCTG。③保守序列區(qū), 在蘭州鲇該區(qū)域識別出了3個保守序列(CSB1、CSB2和CSB3), 其中CSB1位于670—705 nt處, CSB2位于748—767 nt處, CSB3 位于793—810 nt處。據(jù)Broughton等[17]研究報道, 保守序列區(qū)中CSB-1保守性相對較低。通過與其他硬骨魚類對比, 發(fā)現(xiàn)蘭州鲇同大多數(shù)硬骨魚類一樣, 在該序列之后緊隨一段TGCCCCC保守序列, 本研究識別的蘭州鲇CSB-1的關(guān)鍵序列為ATTCCACGCGCATAAGGTTATTC TTTACTCCACATA。相比之下, CSB-2和CSB-3序列的保守性較CSB-1高, 二者在蘭州鲇線粒體中的保守序列分別為: AAACCCCCCCTACCCCC和CAAACCC---AAA---CA。

表 4 蘭州鲇13個蛋白質(zhì)編碼基因密碼子平均使用頻率Tab. 4 Total codon average usage in the thirteen protein-coding genes for S. lanzhouensis

圖 2 蘭州鲇12S rRNA基因二級結(jié)構(gòu)Fig. 2 The secondary structures of 12S rRNA genes in the S. lanzhouensis mitogenome

圖 3 蘭州鲇16S rRNA基因二級結(jié)構(gòu)Fig. 3 The secondary structures of 16S rRNA genes in the S. lanzhouensis mitogenome

2.7 非編碼區(qū)

圖 4 蘭州鲇tRNA-Ser(AGN)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測圖Fig. 4 The secondary structures of the tRNA-Ser(AGN)genes in S. lanzhouensis mitogenome

脊椎動物線粒體基因組中的非編碼區(qū)為調(diào)節(jié)線粒體DNA復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的小片段, 主要分布于L-鏈復(fù)制起始區(qū)和tRNA基因之間。根據(jù)非編碼區(qū)的結(jié)構(gòu)組成和分布位置, 該區(qū)域亦可分為基因間隔序列區(qū)和基因序列重疊區(qū)。在蘭州鲇線粒體該區(qū)域共識別出10處基因序列重疊區(qū), 序列總長為32 bp, 最大堿基重疊數(shù)為10 bp, 位于ATP6 和ATP8基因之間, 最小堿基重疊數(shù)為1 bp。非編碼區(qū)有11個間隔序列, 長度大小在1—34 bp。其中在tRNA-Asn和tRNA-Cys基因之間分布有最大的間隔序列(34 bp),并在該區(qū)域識別出了能夠啟動L-鏈復(fù)制的序列(OL),其在鲇形目魚類中的關(guān)鍵序列為5′-GCCTG-3′, 該序列由10個堿基形成一個保守的莖環(huán)結(jié)構(gòu)(圖 6)。Shadel和Clayton[18]研究認為, 在脊椎動物線粒體基因組中, 該莖環(huán)結(jié)構(gòu)主要調(diào)節(jié)L-鏈的復(fù)制。

圖 5 蘭州鲇線粒體控制區(qū)結(jié)構(gòu)特征示意圖Fig. 5 Schematic map characterizing of the control region of S. lanzhouensis

2.8 鲇科魚類系統(tǒng)進化分析

COX1基因可作為通用標(biāo)簽進行物種有效分類[19]。本研究采用COX1基因序列進行了幾種鲇形目魚類NJ系統(tǒng)進化關(guān)系分析, 結(jié)果顯示除部分節(jié)點擬合系數(shù)降低外, 基于幾種魚類COX1基因的系統(tǒng)進化關(guān)系具有與全基因組ML進化樹分析相同的結(jié)果, 其中本研究中來源于國家級蘭州鲇原種場的樣本(KP255959)同已報道的蘭州鲇(JF895472)仍分為兩個系群(圖 8)。此外, 通過本研究所得到的蘭州鯰線粒體基因組與前人已發(fā)表的蘭州鲇線粒體基因組(JF895472)序列比對分析, 兩者間全基因組序列一致性百分比(Pairwise % Identity)為92.4%。其中, 通用標(biāo)簽COX1基因序列的同源性比例只有90.8%, K2P遺傳距離為0.10。以上結(jié)果表明該核苷酸序列分化值明顯大于常用的分子種劃分閾值標(biāo)準(zhǔn)(0.03)[20]。綜合蘭州鲇傳統(tǒng)分類學(xué)研究結(jié)果, 以及近8年本實驗室對黃河蘭州鲇種群資源調(diào)查結(jié)果,研究者普遍認為蘭州鲇主要分布在黃河中上游水域, 而王慶容等報道的蘭州鲇樣本采自北京大學(xué)西門外農(nóng)貿(mào)市場來源于山東省某養(yǎng)殖場的蘭州鲇。在本研究的基礎(chǔ)上, 我們推測已報道蘭州鲇(JF895472)有可能是潛在的生物地理種群種或蘭州鲇近緣種。

3 討論

3.1 魚類線粒體基因組組成

本研究發(fā)現(xiàn)蘭州鲇線粒體基因組全序列具有與其他典型脊椎動物類似的基因組成和明顯的AT偏向性。較高A+T含量和較低G+C含量的線粒體DNA特征, 在已報道的其他鲇形目魚類中同樣存在[13,21,22], 只是A+T含量或G+C含量大小因物種不同而有差異。目前已測定的大多數(shù)淡水魚類的基因排列序列與其他脊椎動物相一致。大多數(shù)魚類的L-鏈編碼了8個tRNA (tRNA-Gln、tRNA-Ala、tRNA-Asn、tRNA-Cys、tRNA-Tyr、tRNA-Ser(UCN)、tRNA-Glu和tRNA-Pro)和ND6基因, 其余28個基因均由H-鏈編碼, 這與本研究中蘭州鲇的基因編碼位置一致。

圖 6 L-鏈復(fù)制起始區(qū)的莖環(huán)結(jié)構(gòu)Fig. 6 Stem-loop structure of L-strand replication initiation region

圖 7 鲇形目魚類全線粒體基因組ML進化樹Fig. 7 Phylogenetic tree based on the ML analysis of the siluriformes whole mitochondrial genome

圖 8 鲇形目魚類COX1基因NJ進化樹Fig. 8 Phylogenetic tree based on the Neighbor-joining (NJ) analysis of the COX1 genes

3.2 蛋白質(zhì)基因的起始和終止

蘭州鲇13個蛋白編碼基因中, 起始密碼子與多數(shù)硬骨魚類的結(jié)果相一致, 具有相對穩(wěn)定的兩種起始密碼子(GTG、ATG)。相對于起始密碼子的穩(wěn)定性, 終止密碼子在物種內(nèi)和物種間變化較多。例如棒花魚(Abbottina rivularis)[23]的COX1、ND4L、ND5、ATP6和ATP8基因以TAA作為終止密碼子, ND1、ND2、ND6以TAG作為終止密碼子, COX2、COX3、ND3、ND4和CYTB以不完全TA或T作為終止密碼子。麥穗魚(P. parva)[10]mtDNA的ATP6、COX1、ND2、ND4L、ND5、ND6基因終止密碼子為TAA; ATP8和ND1基因終止密碼子為TAG; CYTB、ND4、ND3、COX2、COX3基因以T作為不完全終止密碼子。南方鲇(S. meridionalis)[24]CYTB、COX2、ND4、COX3基因以T和TA作為不完全終止密碼子。本研究中蘭州鲇PCGs中的7個基因(ATP6、ATP8、COX1、ND1、ND4L、ND5和ND6)的終止密碼子是TAA, 2個基因(ND2和ND3)是TAG, 其余4個基因是T或TA。從以上研究結(jié)果可以看出, 不同魚類的編碼基因使用不同的終止密碼子, 但均以TAA或TAG作為完全終止密碼子, 以T和TA作為不完全終止密碼子, 未發(fā)現(xiàn)特殊的密碼子。脊椎動物線粒體PCGs中出現(xiàn)不完全終止密碼子的現(xiàn)象較為常見, Ojala等[25]推測不完全密碼子是由轉(zhuǎn)錄后mRNA3′端加入A殘基所致。

3.3 tRNA基因和rRNA基因

據(jù)Lee等[26]報道, 12S rRNA基因序列長度主要由3′端一段長的插入缺失序列決定, 而16S rRNA則主要由5′端一段長的插入缺失序列決定。Sharma等[27]研究發(fā)現(xiàn), rRNA基因的功能取決于其在蛋白質(zhì)合成中的二級結(jié)構(gòu)。在同麥穗魚、黑尾地鴉及其他脊椎動物rRNA二級結(jié)構(gòu)的對比分析中, 發(fā)現(xiàn)12S rRNA基因比16S rRNA基因更保守, 并且莖區(qū)堿基序列比環(huán)區(qū)更加高度保守, 同時我們推測蘭州鲇同其他脊椎動物一樣, 具有rRNA基因的二級結(jié)構(gòu)比序列本身更高度保守的特征[28]。Dixon等[29]指出, rRNA獨特的二級結(jié)構(gòu)是核糖體重要功能和組成的一部分, 這種組成和功能的特征主要來自莖區(qū)和環(huán)區(qū)包含重要的親緣信息。因此, rRNA基因已經(jīng)被廣泛地用于系統(tǒng)發(fā)生分析。本研究中蘭州鲇22個tRNA基因中除tRNA-Ser(AGN)外, 其余均形成典型三葉草結(jié)構(gòu)。硬骨魚類tRNA-Ser(AGN)缺少二氫尿嘧啶臂(DHU臂)的現(xiàn)象較為多見, DHU臂的位置上僅形成一個單環(huán)結(jié)構(gòu)。Cheng等[30]研究證明, 這種缺失DHU臂的tRNA可通過調(diào)整其結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能, 從而同典型三葉草結(jié)構(gòu)的tRNA一樣融入核糖體, 發(fā)揮其攜帶并轉(zhuǎn)運氨基酸的功能。

3.4 非編碼序列區(qū)(NR)

目前已報道的大多數(shù)淡水魚類只有一個包含有控制區(qū)和L-鏈復(fù)制起始區(qū)的非編碼區(qū)。魚類的控制區(qū)包括終止序列區(qū)(TAS)、中央保守區(qū)(CD)、保守序列區(qū)(CSB)、H-鏈復(fù)制起始區(qū)(OH)[31]。本研究中在蘭州鲇mtDNA的NR區(qū)僅發(fā)現(xiàn)TAS、CD和CSB區(qū)。在TAS區(qū)存在兩對核心序列TACAT與其反向互補的ATGTA序列形成包含49個堿基的熱穩(wěn)定發(fā)夾結(jié)構(gòu), 參與線粒體基因組復(fù)制終止調(diào)控; AGAGACCATC這段基因序列作為CSB-F的關(guān)鍵序列, 在鲇形目魚類間高度保守, 普遍認為是區(qū)分終止區(qū)和中央保守區(qū)的標(biāo)志[15]; 已有研究報道發(fā)現(xiàn)在人[32]、虹鱒[33]等脊柱動物的L-鏈復(fù)制起始區(qū)中存在5′-GCCGG-3′關(guān)鍵序列, 且該序列在RNA、DNA合成中具有重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)在鲇形目魚類線粒體L-鏈復(fù)制起始區(qū)的關(guān)鍵序列為5′-GCCTG-3′,其在鲇形目魚類中的堿基序列和在莖環(huán)中的位置均較保守, 推測蘭州鲇5′-GCCTG-3′關(guān)鍵序列同其他脊椎動物5′-GCCGG-3′關(guān)鍵序列具有相同的功能。

3.5 系統(tǒng)進化分析

目前在魚類線粒體的研究方面, 相關(guān)的基因或結(jié)構(gòu)區(qū)域作為分子遺傳標(biāo)記廣泛應(yīng)用于系統(tǒng)發(fā)育、物種分類、種群鑒定等領(lǐng)域的研究中。例如:張燕等[34]利用線粒體DNA控制區(qū)有效地將中國鲿科魚類進行了分類。周傳江等[24]利用線粒體蛋白編碼基因序列分析了南方鲇同其他35種魚類的系統(tǒng)發(fā)育和分化時間, 闡明了鲇形目、鯉形目、脂鯉目、電鰻目的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。綜合利用線粒體16S rRNA和ND2基因標(biāo)記, Near等[35]成功分析了南極鱈的演化發(fā)育關(guān)系。Phillip等[36]利用線粒體基因組全序列和控制區(qū)序列進行了虎鯨(Orcinus orca)地理種群和系統(tǒng)分類的研究, 發(fā)現(xiàn)基因組全序列較控制區(qū)更能準(zhǔn)確的區(qū)分物種, 同時應(yīng)用線粒體基因組全序列劃分出了新的地理種群。近年來, 線粒體DNA的COX1基因由于長度和進化速率適中, 以及富含系統(tǒng)發(fā)育信息等特點, 被作為DNA通用標(biāo)簽廣泛應(yīng)用于種質(zhì)鑒定、物種分類和系統(tǒng)進化領(lǐng)域研究。如: Hebert等[20]利用COX1基因作為DNA條形碼較好的對200種親緣關(guān)系較近的鱗翅目昆蟲進行了系統(tǒng)進化關(guān)系的研究。Zhang[37]利用COX1基因有效地區(qū)分和分析了329種海洋魚類的進化和分類關(guān)系。本研究分別應(yīng)用鲇形目魚類線粒體DNA全序列和COX1基因序列進行了蘭州鲇同其他鲇形目魚類的系統(tǒng)進化關(guān)系和物種鑒定分析, 結(jié)果表明以上兩種標(biāo)記均可有效分析鲇形目魚類的系統(tǒng)進化與分類關(guān)系, 但鑒于鲇形目魚類間的復(fù)雜性和較低的異質(zhì)性, 尚需借鑒以上其他魚類在線粒體系統(tǒng)進化分析的成功經(jīng)驗, 進一步深入開展鲇形目魚類,尤其是鲇科魚類的系統(tǒng)進化關(guān)系和物種分類鑒定的研究。

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SEQUENCING AND ANALYSIS OF THE COMPLETE MITOCHONDRIAL GENOME OF SILURUS LANZHOUENSIS BASED ON NEXT GENERATION SEQUENCING TECHNOLOGIES

LIAN Zong-Qiang1,2,3, GUN Shuang-Bao2, LI Li1,3, ZHANG Feng1,3, XIAO Wei1,2,3and WU Xu-Dong1,2,3
(1. Ningxia Fisheries Research Institute, Yinchuan 750001, China; 2. College of Animal Science and Technology, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070, China; 3. Ningxia Engineering Research Center for Fisheries, Yinchuan 750001, China)

In this study, the high-throughput next-generation sequencing technology was used to build Lanzhou catfish (Silurus lanzhouensis) mitochondrial genome sequence, and the complete sequence and characteristics for mitochondrial genome has been analyzed. The main results were demonstrated in detail. The circular genome was 16523 bp in length with the typical mtDNA components, and the base composition showed a tendency of high A+T and low G+C. Two promoters (ATG, GTG) and three terminators (TAG, TAA and T or TA) were found in all 13 PCGs. Except tRNASer(AGN)gene showed the shortage of DHU, the other 21 genes of tRNA could be folded in clover shape. The 45 stemloop structures and 4 structural domains were identified in secondary structure of 12S rRNA, and 54 stem-loop structures and 6 structural domains were identified in 16S rRNA. Three different structural domains of termination sequence region (TAS1, TAS2), central conservative region (CSB-F, CSB-E and CSB-D) and conservative region (CSB1, CSB2 and CSB3) were divided in the controlled region that remains key sequence label. The non-code region has a conservative sequence to control light chain starting copy. The complete sequence of mitochondrial genome and general COX1 label could be used for the study of evolutionary relationship between S. lanzhouensis and other Siluriformes species.

Silurus lanzhouensis; Mitochondrial genome; Structure and characteristics; Phylogeny

Q173

A

1000-3207(2017)02-0334-12

10.7541/2017.41

2016-03-08;

2016-06-14

國家自然科學(xué)基金項目(31360633); 國家大宗淡水魚產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目(CARS-46-54); 寧夏對外科技合作項目資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31360633); National Technology System for Conventional Freshwater Fish Industries (CAR-46-54); the External Cooperation Projects of Ningxia, China]

連總強(1980—), 男, 甘肅靖遠人; 博士, 高級工程師; 主要從事魚類遺傳育種與繁殖研究。E-mail: lianzq04@163.com

吳旭東(1967—), 男, 博士, 研究員; 主要從事魚類遺傳育種與繁殖研究。E-mail: amy95@126.com