丁 靜, 葛海燕, 葛燕青, 王玉民, 李艷玲

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院 化工學(xué)院, 泰安 271016; 2. 泰山醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 泰安 271016)

一種高選擇性的硫化氫比率探針

丁 靜1, 葛海燕1, 葛燕青1, 王玉民1, 李艷玲2

(1. 泰山醫(yī)學(xué)院 化工學(xué)院, 泰安 271016; 2. 泰山醫(yī)學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 泰安 271016)

近些年來的研究表明,硫化氫(H2S)作為繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后的第三種氣體信使分子[1-2],在生物體的各種生理、病理過程中都起著重要的作用,比如調(diào)控炎癥、控制血壓、調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)等[3-4]。此外,細(xì)胞內(nèi)H2S含量的變化還會(huì)引起一些疾病,如阿爾茨海默癥、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化[5-7]。因此,發(fā)展具有高選擇性和高靈敏度檢測(cè)H2S的方法具有重要意義,并能為學(xué)術(shù)研究和臨床應(yīng)用提供有用的信息。

目前,主要的檢測(cè)H2S方法有電化學(xué)分析法、分光光度法、化學(xué)發(fā)光法和氣相色譜法[8-12]等。分子探針由于具有選擇性高、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便和能實(shí)時(shí)原位檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)[13-14],近年來受到人們的廣泛關(guān)注。而這些探針大多是以單波長(zhǎng)熒光強(qiáng)度變化進(jìn)行檢測(cè),這種方法有著自身不可克服的缺點(diǎn),即在定量分析時(shí)易受到多種因素的影響,如探針的穩(wěn)定性、濃度,待測(cè)試體系的酸度、溫度,檢測(cè)儀器的穩(wěn)定性等,致使分析結(jié)果的準(zhǔn)確度下降。而比率探針在與目標(biāo)分析物作用時(shí)自身能夠產(chǎn)生兩個(gè)不同波長(zhǎng)的熒光,基于兩波長(zhǎng)處熒光強(qiáng)度或吸收強(qiáng)度的比值隨目標(biāo)分析物的濃度改變而變化來定量檢測(cè)目標(biāo)分析物。由于兩波長(zhǎng)處強(qiáng)度相對(duì)變化的自參比作用能夠有效地消除其他因素的干擾,比率探針定量檢測(cè)的準(zhǔn)確度更高[15-16]。本工作基于H2S和C=C之間的親核加成反應(yīng)設(shè)計(jì)合成一種新的H2S比率探針,其合成及其與H2S作用機(jī)理見圖1。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

島津UV-2450型紫外-可見分光光度計(jì);Bruker 400 MHz型核磁共振儀;島津LC-MS 2010A型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀;pHS-25B型pH酸度計(jì)。

圖1 H2S探針的合成及作用機(jī)理Fig. 1 Synthesis and proposed mechanism of the probe for H2S

所用試劑均為分析純,試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 探針的合成

稱取碘化1,2-二甲基吡啶鹽0.235 g(1.0 mmol)和4-硝基苯甲醛0.31 g于50 mL圓底燒瓶中,加入正丁醇20 mL,加催化劑用量哌嗪,混合溶液加熱至回流,反應(yīng)40 min。將反應(yīng)溶液冷卻至室溫,待大量固體析出,減壓抽濾,用正丁醇重結(jié)晶,得0.230 g橘紅色固體,產(chǎn)率62.5%。核磁共振和質(zhì)譜表征表明產(chǎn)物為探針碘化1-甲基-2-(4-硝基)苯乙烯基吡啶鹽。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取探針0.003 7 g溶于二甲基甲酰胺中,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,用二甲基甲酰胺定容,配成1.0×10-4mol·L-1溶液。在若干10 mL比色管中加入探針溶液1.00 mL、pH 7.4的PBS緩沖溶液100 mL、不同體積(0～700 μL)的0.01 mol·L-1Na2S溶液,用水定容至10 mL。放置10 min,測(cè)定其紫外-可見吸收光譜。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外光譜特性

在pH 7.4的PBS緩沖溶液中,10 μmol·L-1的探針及其與不同量的Na2S作用后的紫外-可見吸收光譜見圖2。

曲線1～11所對(duì)應(yīng)的Na2S的濃度分別為0,50,100,200,300,400,450,500,550,600,700 μmol·L-1圖2 探針(10 μmol·L-1)與不同量的Na2S作用后的紫外-可見吸收光譜Fig. 2 UV-vis absorption spectra of probe (10 μmol·L-1) reacting with different amount of Na2S

由圖2可知:沒有加入Na2S時(shí)探針在339 nm處有較強(qiáng)吸收,當(dāng)加入不同量的Na2S時(shí),探針在339 nm處的吸收帶逐漸降低,而在244 nm處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收帶且逐漸增強(qiáng)。這一現(xiàn)象表明加入Na2S后,H2S與探針分子中的C=C發(fā)生了加成反應(yīng),導(dǎo)致整個(gè)探針分子的共軛程度降低使吸收峰發(fā)生藍(lán)移。

2.2 探針與硫化氫的反應(yīng)機(jī)制

為了理解探針和H2S的作用機(jī)理,在pH 7.4的PBS緩沖溶液中,將加入Na2S的探針溶液進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)化合物1的m/z=402。因此,最有可能的反應(yīng)機(jī)制見圖1中的加成反應(yīng)。

2.3 反應(yīng)時(shí)間的選擇

響應(yīng)時(shí)間是一個(gè)重要的因素,特別是在生物體系內(nèi)的快速代謝。探針在加入Na2S后吸收強(qiáng)度比(A244 nm/A339 nm)隨反應(yīng)時(shí)間的變化曲線見圖3。

圖3 探針(10 μmol·L-1)加入Na2S(400 μmol·L-1)后吸收強(qiáng)度比(A244 nm/A339 nm)隨時(shí)間的變化Fig. 3 Absorption intensity ratio (A244 nm/A339 nm) of probe (10 μmol·L-1) over time after the addition of Na2S (400 μmol·L-1)

由圖3可知:反應(yīng)剛開始時(shí)吸收強(qiáng)度比(A244 nm/A339 nm)迅速增加,在6 min之后吸收強(qiáng)度比變化很小,8 min后探針和Na2S的反應(yīng)已經(jīng)基本完成。試驗(yàn)選擇探針與Na2S反應(yīng)10 min之后進(jìn)行測(cè)定。

2.4 靈敏度測(cè)試

試驗(yàn)考察了探針對(duì)不同濃度Na2S溶液作用后的吸收強(qiáng)度比,結(jié)果見圖4。

圖4 探針的吸收強(qiáng)度比(A244 nm/A339 nm)與Na2S濃度的關(guān)系Fig. 4 Relationship between absorption intensity ratio(A244 nm/A339 nm) of probe and Na2S concentration

由圖4可知:隨著Na2S的濃度從0增加至700 μmol·L-1,探針的吸收強(qiáng)度比(A244 nm/A339 nm)與Na2S濃度呈線性關(guān)系,線性回歸方程為A244 nm/A339 nm=0.001 2c+0.178 4,相關(guān)系數(shù)為0.993 5,檢出限為13 μmol·L-1。因此,探針可定量測(cè)定H2S。

2.5 選擇性試驗(yàn)

選擇性是評(píng)價(jià)一個(gè)探針性能的重要參數(shù)。試驗(yàn)考察了K+、Cl-、Mg2+、SO42-、NO2-、谷胱甘肽(GSH)、半胱氨酸(Cys)、亮氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)和谷氨酸(Leu)對(duì)檢測(cè)的影響,結(jié)果見圖5。

曲線1～10所對(duì)應(yīng)的分析物分別為K+、Cl-、Mg2+、SO42-、NO2-(1 200 μmol·L-1);GSH、Cys、Glu、Pro、Leu(800 μmol·L-1)圖5 在pH 7.4的PBS緩沖溶液中探針對(duì)不同分析物的紫外-可見吸收光譜Fig. 5 UV-vis absorption spectra of probe toward various analytes in PBS with pH 7.4

由圖5可知,探針對(duì)H2S具有很好的選擇性。半胱氨酸和谷胱甘肽作為還原性硫醇分子,可能對(duì)探針檢測(cè)H2S的選擇性造成較大影響,但是,結(jié)果顯示半胱氨酸和谷胱甘肽對(duì)探針幾乎沒有影響,這可能是因?yàn)榘腚装彼岷凸入赘孰谋菻2S有更大的空間位阻效應(yīng)。因此,探針可用于生理?xiàng)l件下的H2S檢測(cè)。

2.6 合成樣品分析

在試驗(yàn)條件下對(duì)含干擾物質(zhì)的H2S合成樣品進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果見表1。結(jié)果表明,本方法適用于H2S的檢測(cè)。

本工作基于H2S和C=C之間的親核加成反應(yīng)設(shè)計(jì)并合成了一種H2S比率探針。探針與H2S的響應(yīng)速率較快(8 min內(nèi)完成)且對(duì)H2S具有很高的選擇性,不易受常見離子和還原性硫醇的影響,具有較高的靈敏度。

表1 H2S合成試樣測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab. 1 Determination results of synthetic H2S samples

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2016-03-27

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81403036,31370575- 1);山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(2013ws0318)

O657.3

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1001-4020(2017)03-0342-04