劉 里, 成飛翔

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 曲靖 655011)

光譜法研究泮托拉唑鈉與牛血清白蛋白的相互作用

劉 里*, 成飛翔

(曲靖師范學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院, 曲靖 655011)

在優(yōu)化的實驗條件下，運用熒光光譜法和紫外光譜法研究牛血清白蛋白(BSA)與泮托拉唑鈉(PS)的結(jié)合作用. 研究表明：PS對BSA的熒光有猝滅作用，屬于靜態(tài)猝滅. BSA能運載PS，是一個自發(fā)過程，其作用力類型主要為氫鍵和范德華力. BSA 的亞螺旋域ⅢA是主要結(jié)合位置，離酪氨酸殘基更近，有正協(xié)同作用. PS對BSA構(gòu)象產(chǎn)生影響，使BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性減弱. 該研究對揭示藥物動力學(xué)問題及后續(xù)抗菌類藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù).

泮托拉唑鈉； 熒光猝滅； 相互作用

泮托拉唑鈉(Pantoprazole Sodium，簡稱PS)是一種抗酸及抗?jié)儾〉母咝?、低毒的治療腸胃疾病的新藥[1]. 因結(jié)構(gòu)上和人血清白蛋白的相似性，牛血清白蛋白(簡稱BSA)被廣泛運用于與藥物結(jié)合作用的研究[2]. BSA是一種在血漿中具有豐富含量的蛋白質(zhì)，在人體中傳遞脂肪酸. 藥物及其他代謝產(chǎn)物方面起主要作用[3]. 因此，許多研究人員已經(jīng)對血清白蛋白的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)開展了研究.它與其它分子和配體的相互作用和結(jié)合性能已被深入探討[2-4]. BSA由582種氨基酸組成，具有與人血清白蛋白(HSA)76%的相似性.

小分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合在生物學(xué)和化學(xué)領(lǐng)域仍然是一個重要的研究課題. 用吸收光譜和熒光光譜法研究藥物與BSA的相互作用的研究已有報道[2-4]， 但還沒有BSA-PS體系的報道. 因此，研究泮托拉唑鈉與BSA的結(jié)合性質(zhì)，探討泮托拉唑鈉對蛋白質(zhì)生物特性的影響，為研究其藥物作用機(jī)制、藥物副作用及藥物分子設(shè)計提供了一些重要信息，對抗菌類藥物的臨床醫(yī)學(xué)研究也產(chǎn)生重要意義.

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

吸收和熒光光譜分別用F-4600型熒光光譜儀(日本日立公司)和Cary 50型紫外-可見光譜儀(美國瓦里安技術(shù)中國有限公司)測定.

牛血清白蛋白(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，泮托拉唑鈉(質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%，百靈威科技有限公司)，其余試劑均為分析純，實驗用水為超純水.

1.2 試驗方法

室溫條件下，掃描220～550 nm BSA-PS的吸收光譜. 對于熒光的測量，在不同溫度下(281.15、296.15、311.15K)BSA-PS體系在280 nm激發(fā)，從300～585 nm之間掃描熒光光譜.I0和I分別代表無熒光猝滅劑和有猝滅劑時的熒光強(qiáng)度，ΔI=I0-I. 對于同步熒光光譜，進(jìn)行了2種不同模式的測量，即Δ分別為15、60 nm，掃描BSA-PS體系在295～360 nm的光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光光譜

由于BSA中存在酪氨酸(Tyr)殘基、色氨酸(Trp)殘基等氨基酸殘基，因此具有熒光，最大吸收波長/最大發(fā)射波長(ex/em)在280 nm/340 nm處(圖1)，當(dāng)PS加入到BSA之后，雖然ex/em幾乎未發(fā)生變化，但是其熒光強(qiáng)度明顯隨著PS濃度的增加而逐漸減弱，表明PS能猝滅BSA的熒光，PS與BSA存在著相互作用.

(1～12: (0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 5.5, 6.0, 6.5)×10-6mol/L)

圖1 PS的熒光光譜

Figure 1 Fluorescence spectra of PS

2.2 實驗條件對光譜性質(zhì)的影響

2.2.1 pH對光譜性質(zhì)的影響 考查了不同緩沖溶液對BSA-PS光譜性質(zhì)的影響(圖2). 發(fā)現(xiàn)使用Tris-HCl緩沖溶液效果最佳. 在其緩沖范圍內(nèi)(圖3)，pH 7.4時，0.015 mol/L Tris-HCl熒光強(qiáng)度最大. 所以在后面的實驗中都使用0.015 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)作為研究PS與BSA相互作用的反應(yīng)介質(zhì).

圖2 不同緩沖溶液對熒光強(qiáng)度的影響

圖3 pH(A)及緩沖溶液濃度(B)對熒光強(qiáng)度的影響

Figure 3 Effect of pH value (A) and buffer concentration (B) on fluorescence intensity

2.2.2 BSA濃度對光譜性質(zhì)的影響 BSA的濃度從2.0×10-7mol/L增加到4.0×10-7mol/L，熒光強(qiáng)度也隨著增加(圖4). 當(dāng)BSA濃度高于4.0×10-7mol/L時，熒光強(qiáng)度不再增加，最終選擇4.0×10-7mol/L BSA作為反應(yīng)的最佳濃度.

圖4 BSA濃度對熒光強(qiáng)度的影響

Figure 4 Effect of concentrations of BSA on fluorescence intensity

2.2.3 試劑加入順序和孵育時間對熒光強(qiáng)度的影響 在281.15 K溫度下，考察了加入順序?qū)w系熒光強(qiáng)度的影響(圖5A)，結(jié)果表明最佳的加入順序為PS→BSA→NaCl→Tris-HCl. 考察孵育時間對體系熒光性能的影響(圖5B)，結(jié)果表明0～40 min熒光強(qiáng)度大幅度增加，40～210 min熒光強(qiáng)度基本不變，選擇40 min為最佳孵育時間.

圖5 試劑加入順序(A)和孵育時間(B)對熒光強(qiáng)度的影響

Figure 5 Effect of addition sequence of reagents (A) and incubation time (B)on fluorescence intensity

2.3 PS與BSA的作用機(jī)理探討

2.3.1 猝滅機(jī)理 熒光猝滅是指熒光強(qiáng)度的降低，可以用來衡量大分子和配體之間的親和力. 熒光猝滅是由各種猝滅分子與熒光團(tuán)發(fā)生分子相互作用，引起熒光團(tuán)的熒光量子產(chǎn)率的降低，如激發(fā)態(tài)反應(yīng)、分子重排、形成基態(tài)復(fù)合物、能量傳遞和碰撞猝滅. 熒光猝滅如果是動態(tài)的，發(fā)生熒光團(tuán)和猝滅劑之間的碰撞猝滅；如果是靜態(tài)的，熒光團(tuán)和猝滅劑形成基態(tài)復(fù)合物[5-7]. 溫度或粘度相關(guān)的實驗可以用來判斷猝滅機(jī)制. 熒光強(qiáng)度和猝滅劑的濃度之間的關(guān)系和猝滅機(jī)理常用Stern-Volmer方程來描述[5-7]. 公式表述為I0/I=1+Kqτ0[PS]=1+Ksv[PS]，式中[PS]為猝滅劑PS濃度，Ksv為Stern-Volmer常數(shù)，Kq為速率常數(shù)；τ0為熒光壽命，10-8s數(shù)量級左右[5-7]；在281.15、296.15、311.15 K條件下的Ksv列在表1中. 結(jié)果表明，3個溫度下的Kq值比最大動態(tài)猝滅速率常數(shù)2.0×1010L/(mol·s)大2個數(shù)量級[5-7]，與動態(tài)猝滅機(jī)理相違背. 由圖6可知，隨著溫度的升高，直線斜率即Ksv降低，與靜態(tài)猝滅機(jī)理吻合.

圖6 BSA與不同PS濃度的Stern-Volmer曲線

Figure 6 Stern-Volmer graph for BSA with varying concentration of PS at different temperatures

紫外吸收光譜也是區(qū)分猝滅機(jī)制的重要方法[7-9]. 由體系的紫外吸收光譜可知，PS-BSA體系的吸收峰從280 nm紅移到286 nm，吸收強(qiáng)度增加，表明推斷PS與BSA靜態(tài)猝滅機(jī)理是合理的.

表1 不同溫度下由Stern-Volmer 和Lineweaver-Burk方程得到的參數(shù)Table 1 The parameters obtained from Stern-Volmer and Lineweaver-Burk equations for BSA-PS system at different temperatures

圖7 Lineweaver-Burk曲線

2.3.2 熱力學(xué)常數(shù)和BSA與PS之間作用力類型的確定 小分子和大分子之間的相互作用力分為幾種類型，即疏水作用力、靜電相互作用、范德瓦爾斯相互作用和氫鍵等. 熱力學(xué)常數(shù)，如焓變(ΔH)、熵變(ΔS)和自由能變化(ΔG)可根據(jù)范特霍夫方程計算求得[10-12]. 不同溫度的BSA-PS的熱力學(xué)參數(shù)總結(jié)在表2中. ΔG<0，ΔH<0且ΔS<0，表明BSA與PS的結(jié)合是自發(fā)進(jìn)行的放熱反應(yīng)，作用力類型為氫鍵和范德華力.2.3.3 結(jié)合常數(shù)Kb以及結(jié)合位點數(shù)n到目前為止，許多研究報道了小分子結(jié)合在大分子如白蛋白的結(jié)合位點[3-5]. 本研究采用了雙對數(shù)lg[(I0-I)/I]=lgKb+nlg[PS][7-9]求得藥物小分子PS與BSA大分子的結(jié)合位點數(shù)n. 分別在281.15、296.15、311.15 K溫度下，以lg(I0-I)/I對lg[PS]作雙對數(shù)曲線，由直線的截距和斜率求出的n和Kb值列于表1中.n≈1，形成一個結(jié)合位點，隨著溫度增加，Kb和n值有略微減小，表明溫度的增加，對血清白蛋白攜帶著PS在體內(nèi)進(jìn)行運轉(zhuǎn)不利. 溫度每升高15 ℃，Kb值減少2個數(shù)量級，PS-BSA越不穩(wěn)定，表明通過溫度的改變可以調(diào)控載藥量.

表2 BSA-PS相互作用的熱力學(xué)常數(shù)和nH值Table 2 The thermodynamic parameters and the value of nH of BSA-PS interactions at different temperatures

2.3.4 PS對BSA構(gòu)象的影響 同步熒光光譜能提供發(fā)色團(tuán)周圍分子微環(huán)境變化的信息. 因此，同步熒光法被用來探究PS分子對BSA構(gòu)象的影響. 激發(fā)和發(fā)射波長之間的差值Δ是重要的參數(shù). 當(dāng)Δ為15 nm，光譜顯示酪氨酸(Tyr)殘基的特征[13-15]. 當(dāng)Δ為60 nm，光譜顯示色氨酸(Trp)殘基的特征. 由圖8可知，隨PS濃度的增大，Tyr和Trp的max均向長波移動，說明PS的加入改變了BSA的構(gòu)象，使其疏水結(jié)構(gòu)增大，引起肽鏈的伸展程度增大，導(dǎo)致BSA腔內(nèi)疏水環(huán)境的極性增強(qiáng)，疏水性減弱[13-15]. Tyr的猝滅程度大于Trp，表明PS與BSA相結(jié)合的位點偏向于Tyr.2.3.5 可能的結(jié)合位置和藥物協(xié)同作用 BSA 是由二硫鍵連接起來的3個螺旋狀區(qū)域(Ⅰ-Ⅲ)所組成的[13-15],每個螺旋域又包含2個亞螺旋域A 和 B[12-15]. 由圖9可知,ex=280 nm 和ex=295 nm 的PS-BSA光譜曲線沒有重疊,表明色氨酸和酪氨酸殘基都參與其中；ex=295 nm的熒光猝滅程度比ex=280 nm 的大,結(jié)合位置主要在亞螺旋域ⅢA中.

圖8 酪氨酸殘基(A)和色氨酸(B) 同步熒光光譜圖

圖9 ex為 280 nm 和 295 nm 時PS-BSA的熒光猝滅曲線

Figure 9 Fluorescence quenching curves of PS-BSA atex=280 and 295 nm

藥物的協(xié)同作用常用Hill方程進(jìn)行分析[13-15]：E=(I0-I)/I0，1/E對1/[PS]作圖，截距為1/Em，lgE(Em-E)=lgK+nHlg[PS]，式中，nH為Hill系數(shù)，K為結(jié)合常數(shù)，E為飽和分?jǐn)?shù). 由表2可知，各溫度下的nH值都大于1，并隨溫度的增加nH值增大，表明PS分子之間呈現(xiàn)出正協(xié)同作用，即一個PS結(jié)合到BSA結(jié)合位點上后，會有利于后繼藥物分子與蛋白質(zhì)的結(jié)合，溫度越高，藥物越容易結(jié)合到位點上. 當(dāng)PS濃度的增加時，會引起后續(xù)PS與 BSA結(jié)合的親和性增加.

3 結(jié)論

利用紫外-可見和熒光光譜法研究了BSA與PS的相互作用. 光譜數(shù)據(jù)表明PS的加入后BSA的熒光被猝滅，PS與BSA形成基態(tài)復(fù)合物，猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅在BSA與PS結(jié)合過程中，氫鍵和范德華力發(fā)揮主要作用. 有一個結(jié)合位點，結(jié)合位置在BSA的亞螺旋域ⅢA中，靠近酪氨酸殘基. 有藥物正協(xié)同作用，PS對BSA構(gòu)象產(chǎn)生影響. 這些重要信息為抗菌類胃腸藥物的臨床應(yīng)用與新藥的研發(fā)提供了重要依據(jù).

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【中文責(zé)編：成文 英文審校：李海航】

Study on the Interaction between Pantoprazole Sodium and Bovine Serum Albumin by Spectrometry

LIU Li*, CHENG Feixiang

(College of Chemistry and Environmental Science,Qujing Normal University, Qujing 655011, China)

Under the optimal conditions，the interaction of Pantoprazole Sodium(PS) with bovine serum albumin(BSA) was investigated by fluorescence spectrometry and ultraviolet-visible light absorption spectrometry. It showed that the fluorescence of BSA was quenched by PS, which was a static quenching process. BSA could transport PS. It was spontaneous and mainly driven by hydrogen bond and Vander Waals force. The primary binding site for PS was located at sub-domain ⅢA of BSA and near by tyrosine residue. There was some positive cooperative effect. The conjugation reaction would affect the conformation of BSA, leading to the polarity around BSA weakened. This test provided a theoretical basis for revealing the pharmacokinetics and further research on development of new antibacterial drugs．

Pantoprazole Sodium; fluorescence quenching; interaction

2015-09-28 《華南師范大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)》網(wǎng)址：http://journal.scnu.edu.cn/n

國家自然科學(xué)基金項目(21261019);云南省教育廳科學(xué)研究基金項目(2015C090Y)

O657.3

A

1000-5463(2017)01-0074-06

*通訊作者:劉里，講師， Email:m18908746298@163.com.