楊利云 楊雙龍 李軍營(yíng) 逄濤 何彬 龔明

（1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650500；2. 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明 650031；3. 云南省煙葉公司，昆明 650218）

煙草高級(jí)脂肪酸代謝及影響因素研究進(jìn)展

楊利云1楊雙龍1李軍營(yíng)2逄濤2何彬3龔明1

（1. 云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 生物能源持續(xù)開發(fā)利用教育部工程研究中心 云南省生物質(zhì)能與環(huán)境生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 昆明 650500；2. 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明 650031；3. 云南省煙葉公司，昆明 650218）

脂肪酸作為煙草中一類重要的化合物，對(duì)煙草的生長(zhǎng)發(fā)育及煙葉的品質(zhì)風(fēng)格有重要的影響。近年來，脂肪酸代謝也被證實(shí)參與了煙草抗逆性的形成。煙草種子富含油脂和各類脂肪酸，隨著煙草種子發(fā)育，亞油酸、油酸和棕櫚酸含量不斷增加，可作為一類潛在的生物質(zhì)能源加以開發(fā)利用。在煙草葉片的生長(zhǎng)發(fā)育過程中，脂肪酸含量逐漸升高，開花時(shí)達(dá)到最大，隨煙葉成熟衰老而逐漸降低，同時(shí)飽和脂肪酸逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)椴伙柡椭舅?。煙葉中、下部葉片脂肪酸含量高于上部煙葉，柵欄組織中高于海綿組織中。此外，基因型以及光照、溫度、地理因素、施肥、烘烤方法、機(jī)械傷害等環(huán)境因素均顯著影響煙葉內(nèi)脂肪酸的組成、含量及其脂肪酸生物合成和代謝關(guān)鍵酶活性和基因表達(dá)。低溫鍛煉可顯著提高煙葉內(nèi)多不飽和脂肪酸含量，降低飽和脂肪酸含量，提高煙葉的耐冷性。通過基因工程手段在煙草中過表達(dá)脂酰-ACP去飽和酶、?；d體蛋白、脂肪酸去飽和酶及脂肪酸脫氫酶等基因可有效提高煙草內(nèi)不飽和脂肪酸的含量，增強(qiáng)煙草在干旱、高溫、強(qiáng)光等非生物脅迫環(huán)境下的抗逆性。基于以上結(jié)果，提出未來的研究方向，旨在為該領(lǐng)域的研究提供理論和實(shí)踐指導(dǎo)。

煙草；高級(jí)脂肪酸；代謝；影響因素

1 煙草中脂肪酸的分布及其在煙草生長(zhǎng)發(fā)育過程中的變化

1.1 煙草種子中脂肪酸組成及其在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的變化

1.2 煙草葉片中脂肪酸組成、分布及其在生長(zhǎng)發(fā)育過程中的變化

2 煙草中脂肪酸合成代謝的影響因素

2.1 基因型對(duì)煙草中脂肪酸合成代謝的影響

有研究表明，煙葉中高級(jí)脂肪酸含量、種類及飽和度在不同基因型煙草中不同［19-20］。朱楠等［21］發(fā)現(xiàn)，4種煙草雌蕊中脂肪酸以油酸和亞油酸含量較高，其中栽培煙草K326和黃花煙草雌蕊中油酸含量高于亞油酸，而在花煙草和斯托克通氏煙草雌蕊中相反。彭艷等［22］對(duì)云南宣威煙區(qū)4個(gè)主栽品種的研究表明，紅大的高級(jí)脂肪酸含量及飽和度相對(duì)較低，K326的高級(jí)脂肪酸含量較低但飽和度較高；云煙85、87 兩個(gè)烤煙品種的高級(jí)脂肪酸含量較高。李鵬飛等［23］對(duì)13個(gè)烤煙品種研究發(fā)現(xiàn)，同一品種烤煙高級(jí)脂肪酸中亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸、肉豆蔻酸和月桂酸含量隨著飽和碳鏈的碳原子的減少含量遞減。

2.2 土壤環(huán)境對(duì)煙草中脂肪酸合成代謝的影響

葉協(xié)峰等［24］研究發(fā)現(xiàn)，煙草中不飽和脂肪酸含量較高，而飽和脂肪酸含量則較低，土壤全磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)、全氮、鎂、pH 和 Na 六個(gè)指標(biāo)和煙葉脂肪酸含量關(guān)系較密切。尹光庭等［25］對(duì)云南施甸縣煙區(qū)黃壤土、紅壤土、黃紅土3種植煙土壤上生長(zhǎng)的K326的CF3樣品分析發(fā)現(xiàn)，高級(jí)脂肪酸中的月桂酸和肉豆蔻酸在3種土壤類型煙葉中存在顯著差異，以紅壤土最高、其次為黃紅土和黃壤土，其他脂肪酸無顯著差異。對(duì)不同氣候和土壤環(huán)境下生長(zhǎng)的煙草分析發(fā)現(xiàn)，云南馬龍縣氣候條件下生長(zhǎng)的云煙87煙葉中高級(jí)脂肪酸含量顯著高于羅平縣氣候條件下的，而相同氣候不同土壤條件下則以羅平的顯著高于馬龍的，氣候、土壤及二者互作對(duì)煙葉總高級(jí)脂肪酸影響分別為高度、中度影響效應(yīng)［26］。沈晗等［27］研究發(fā)現(xiàn)，水稻土、火山灰土上生長(zhǎng)的煙葉中，月桂酸含量顯著高于黃壤和紅壤的，肉豆蔻酸和棕櫚酸含量則差異不顯著。

2.3 光環(huán)境對(duì)煙草中脂肪酸合成代謝的影響

陳頤等［28］研究發(fā)現(xiàn)，與常規(guī)大棚育苗相比，大棚內(nèi)增溫補(bǔ)光和烤房?jī)?nèi)正常光照不增溫處理育苗均顯著增加了煙葉內(nèi)棕櫚酸和硬脂酸的含量，而大棚內(nèi)增溫不補(bǔ)光處理則降低了二者的含量。研究發(fā)現(xiàn)，隨著光照強(qiáng)度的降低，煙葉內(nèi)不飽和脂肪酸含量降低［29-30］。孟霖等［31］用LED對(duì)生理成熟期的煙葉短暫補(bǔ)充不同光質(zhì)后對(duì)其代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，煙葉內(nèi)脂肪酸代謝受光質(zhì)影響較大，其含量在對(duì)照白光下最低，而藍(lán)光下雖有所升高但仍處于較低水平，而在UV-A、綠、黃、紅光下含量則較高。左敏等［32］研究也發(fā)現(xiàn)，增強(qiáng)UV-B輻射可顯著提高煙葉內(nèi)的高級(jí)脂肪酸含量。

2.4 溫度對(duì)煙草中脂肪酸合成代謝的影響

Gawer 等［33］對(duì)不同溫度下培養(yǎng)的煙草懸浮細(xì)胞研究表明，煙草懸浮細(xì)胞中多不飽和脂肪酸積累的最佳溫度在20-26℃。Popov 等［34］對(duì)煙草進(jìn)行低溫（8℃/ 6 d）鍛煉后發(fā)現(xiàn)，低溫鍛煉提高了煙葉的耐冷性，但沒有提高煙草根部的耐冷性，鍛煉后煙葉中多不飽和脂肪酸含量增加，而飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸含量降低；相反，經(jīng)低溫鍛煉后的煙草根中飽和脂肪酸含量略微增加而不飽和脂肪酸含量降低，且根部中脂質(zhì)含有較多的C20-24脂肪酸，同時(shí)它們的含量隨著低溫鍛煉而增加，從而降低了煙草根部細(xì)胞膜的流動(dòng)性，這可能是低溫鍛煉導(dǎo)致喜溫的煙草根部不耐冷和低溫下植株死亡的原因。對(duì)大田環(huán)境下生長(zhǎng)的云煙100進(jìn)行夜間加蓋大棚保溫研究發(fā)現(xiàn)，下部煙葉中棕櫚酸和油酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)極顯著提高［35］。

2.5 緯度和海拔對(duì)煙草中脂肪酸合成代謝的影響

楊虹琦等［36］對(duì)中國(guó)不同緯度煙區(qū)CF3煙葉調(diào)查發(fā)現(xiàn)，低緯度和高緯度產(chǎn)區(qū)煙葉中飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸均顯著高于中緯度產(chǎn)區(qū)的。簡(jiǎn)永興等［37］對(duì)湘西北海拔200-1 000 m 范圍內(nèi)不同海拔高度盆栽的云煙87研究表明，湘西北海拔高度與烤煙棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸+亞麻酸含量均呈正相關(guān)，其中與前兩者含量分別達(dá)到極顯著和顯著水平，1 000 m海拔處煙葉中的上述3類酸含量分別為200 m海拔處煙葉內(nèi)的1.26、2.21、1.60倍，而海拔對(duì)月桂酸、油酸影響不大。

2.6 施肥對(duì)煙草中脂肪酸合成代謝的影響

韓錦峰等［38］研究表明，氮素水平較低的條件有利于煙葉中脂肪酸向長(zhǎng)鏈不飽和方向轉(zhuǎn)化，但氮素過高也會(huì)促進(jìn)長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸的合成。李銀科等［39］研究發(fā)現(xiàn)，不同施氮水平下（0、45、90和135 kg/hm2）下，煙葉中高級(jí)脂肪酸含量以施氮90 kg/hm2處理下最高。隨著鉀肥施用量的增加，煙葉中亞油酸、亞麻酸的含量降低［40-41］。武雪萍等［42］研究表明，與單獨(dú)施用化肥相比，50%芝麻餅肥氮+50%化肥氮處理提高了云煙85上、中、下部煙葉中飽和脂肪酸豆蔻酸和月桂酸含量，不飽和脂肪酸亞油酸、亞麻酸含量則降低。顧明華等［43］研究也表明，配施有機(jī)肥提高了烤煙生長(zhǎng)后期煙葉的脂氧合酶活性，增強(qiáng)了煙葉生長(zhǎng)后期的脂類代謝，提高了煙葉生長(zhǎng)后期的飽和脂肪酸含量，并降低不飽和脂肪酸的含量，烘烤后以配施30%有機(jī)肥處理煙葉的總飽和脂肪酸含量最高，總不飽和脂肪酸含量最低，有利于煙葉品質(zhì)的提高。徐發(fā)華等［44］通過對(duì)不同生育期煙草外施蘋果酸發(fā)現(xiàn)，早施蘋果酸有利于顯著降低煙葉中高級(jí)脂肪酸含量和比例。

2.7 烘烤調(diào)制對(duì)煙草脂肪酸合成代謝的影響

在烘烤調(diào)制過程中，隨著烘烤時(shí)間的延長(zhǎng)，煙葉內(nèi)月桂酸、十三烷酸、油酸和亞油酸含量升高，豆蔻酸、棕櫚油酸、硬脂酸、亞麻酸和20碳烯酸含量減少［14］。同時(shí)，在烘烤的過程中煙葉內(nèi)LOX活性在0-48 h 期間逐漸上升，之后顯著下降直至完全消失，在此過程中，丙二醛（MDA）含量在0-48 h內(nèi)與LOX變化趨勢(shì)同步，48 h 后MDA對(duì)LOX反饋抑制作用增強(qiáng)，烘烤期間總不飽和脂肪酸含量降低，降低最多的是亞油酸和亞麻酸，而飽和脂肪酸含量上升［45］。晾曬的過程中，煙葉中的脂肪酸含量降低，特別是不飽和脂肪酸的含量［5］。管維等［46］研究表明，不同品種烤煙煙葉中棕櫚酸和硬脂酸兩種高級(jí)脂肪酸含量在烘烤前后無顯著差異，亞油酸、亞麻酸在烘烤后出現(xiàn)顯著性差異，云煙87和紅大的高級(jí)脂肪酸含量在烘烤后降低。

2.8 產(chǎn)區(qū)地理氣候綜合條件對(duì)煙草脂肪酸合成代謝的影響

云南產(chǎn)區(qū)煙葉烘烤前后高級(jí)脂肪酸含量略低于福建產(chǎn)區(qū)，表現(xiàn)出明顯的產(chǎn)區(qū)差異［46］。對(duì)全國(guó)5個(gè)煙區(qū)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙葉中高級(jí)脂肪酸含量由高到低依次為云南、湖南、貴州、湖北和廣西，并以中部煙葉的含量高于上部煙葉［47］。

2.9 其他因素對(duì)煙草脂肪酸合成代謝的影響

Weete［48］對(duì)正常的煙草細(xì)胞和發(fā)生異常增生的煙草細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，異常增生的煙草細(xì)胞內(nèi)總脂肪酸含量是正常生長(zhǎng)細(xì)胞內(nèi)的3.2倍，不飽和脂肪酸則以正常培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)較高，說明發(fā)生病變或異常增生的煙草細(xì)胞內(nèi)同時(shí)伴隨著脂肪酸組成及其含量的變化。Hamada 等［49］研究表明，機(jī)械傷害也會(huì)引起煙葉內(nèi)脂肪酸代謝的變化，與對(duì)照相比，經(jīng)機(jī)械傷害的煙草葉片中質(zhì)體ω-3脂肪酸去飽和酶基因mRNA水平增加了2倍，而線粒體ω-3脂肪酸去飽和酶基因mRNA水平則保持恒定，機(jī)械傷害后，煙葉內(nèi)的亞麻酸含量增加，說明機(jī)械傷害促進(jìn)了煙葉內(nèi)ω-3脂肪酸去飽和酶基因mRNA的積累，進(jìn)而促進(jìn)了亞油酸（18∶2）向亞麻酸（18∶3）的轉(zhuǎn)化，這可能是煙草植株應(yīng)對(duì)機(jī)械損傷的一種適應(yīng)機(jī)制。煙草中脂肪酸的合成可能存在反饋抑制的調(diào)節(jié)機(jī)制，在培養(yǎng)的煙草懸浮細(xì)胞中加入外源油酸后，通過反饋調(diào)節(jié)抑制了懸浮細(xì)胞脂肪酸的合成，且這樣的調(diào)節(jié)很可能是通過對(duì)乙酰輔酶羧化酶（ACCase）生化水平的調(diào)節(jié)或在轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)節(jié)及調(diào)控其他脂肪酸的合成來實(shí)現(xiàn)的［50］。Sumayo 等［51］研究發(fā)現(xiàn)，外源施用亞油酸能誘導(dǎo)煙草植株中由細(xì)菌性軟腐病引起綜合防御反應(yīng)，誘導(dǎo)該反應(yīng)中的防御基因及相關(guān)保護(hù)酶如POD、PPO和PAL等酶活性的增加及其基因表達(dá)，說明亞油酸在煙草對(duì)病害脅迫的過程中扮演著重要作用。Hamberg 等［52］研究表明，細(xì)菌感染可誘導(dǎo)煙草啟動(dòng)脂肪酸的α-氧化途徑產(chǎn)生2-羥基-亞麻酸，減少LOX途徑產(chǎn)生的十八碳三烯酸含量，在細(xì)菌感染部位發(fā)揮組織保護(hù)功能。

3 煙草中脂肪酸的合成及基因工程的應(yīng)用

同其他高等植物一樣，煙草中飽和脂肪酸的合成部位主要是細(xì)胞質(zhì)，線粒體和葉綠體中也有脂肪酸合成，合成的主要原料為乙酰-CoA，乙酰-CoA在乙酰-CoA羧化酶（ACCase）的催化下合成丙二酰-CoA，ACCase是植物中脂肪酸從頭合成過程中的關(guān)鍵限速酶之一，在自然界有兩種形式的ACCase，一種稱為真核形式的ACCase，由一條含有3個(gè)功能結(jié)構(gòu)域的肽鏈組成，單子葉植物中的禾本科植物如玉米、小麥和水稻葉綠體ACCase為真核形式；另一種稱為原核形式的ACCase，由生物素羧化酶（BC）、生物素羧基載體蛋白（BCCP）、羧基轉(zhuǎn)移酶（CT）及另一個(gè)功能未知的酶組成的多酶復(fù)合體，雙子葉植物如豌豆、煙草中的ACCase為原核形式［53］。在丙二酰-CoA形成后，脂肪酸合成酶（FAS）以丙二酰-CoA為底物每次循環(huán)加入2C進(jìn)行連續(xù)的聚合反應(yīng)合成?；兼湥M(jìn)一步合成C16-18的飽和脂肪酸，植物中的脂肪酸合成酶（FAS）也是由酰基載體蛋白、β-酮脂酰-ACP合酶，β-酮脂酰-ACP還原酶，β-羥脂酰-ACP脫水酶、烯脂酰-ACP還原酶，脂酰-ACP硫酯酶等部分組成的原核形式的多酶復(fù)合體［54］。植物中的各種不飽和脂肪酸，如棕櫚油酸、油酸、亞油酸和亞麻酸等則是飽和脂肪酸在脂肪酸去飽和酶的催化下合成，根據(jù)底物不同，脂肪酸去飽和酶可分為脂酰-ACP去飽和酶（Acyl-ACP desaturase）和脂酰-脂去飽和酶（Acyl-lipid desaturase）兩類，二者在飽和脂肪酸的去飽和作用生成不飽和脂肪酸的反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用［55-56］

煙草ACCase由3個(gè)核基因和一個(gè)細(xì)胞質(zhì)基因（accD）編碼，在煙草質(zhì)體中過表達(dá)accD基因提高了煙草光合組織和非光合組織中ACCase水平，增加了質(zhì)體中總ACCase水平，該過表達(dá)accD基因植株生長(zhǎng)正常，并顯著增加了煙葉中脂肪酸含量，同時(shí)延長(zhǎng)了煙葉的生長(zhǎng)時(shí)間，提高了煙草種子產(chǎn)量，間接提高了煙草種子中脂肪酸的含量［57］。Yang 等［58］從煙草中分離出兩個(gè)β-酮脂酰-ACP合酶 I（KAS I）基因，NtKASI-1和NtKASI-2，二者在所有檢測(cè)的煙草組織中均為組成型表達(dá)，過表達(dá)NtKASI-1或使NtKASI-1沉默表達(dá)均改變了煙葉中脂肪酸含量；NtKASI-2沉默沒有顯著改變煙草的表型，但將NtKASI-1和NtKASI-2都沉默表達(dá)后，與野生型煙草相比，煙草表型發(fā)生顯著改變，這表明NtKASI-1基因有部分功能冗余，NtKASI-1在煙草脂肪酸合成和生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。乙酰-CoA是合成脂肪酸的主要原料，將小鼠肝臟中催化乙酰-CoA合成的檸檬酸裂解酶（Citrate lyase，ACL）轉(zhuǎn)入煙草質(zhì)體中過表達(dá)后，煙葉內(nèi)ACL總活性提高了4倍，同時(shí)脂肪酸總量與對(duì)照比提高了16%，但脂肪酸組成沒有顯著變化［59］。將橄欖的酰基載體蛋白（ACP）cDNA分別導(dǎo)入煙草的葉綠素DNA 和核基因中過表達(dá)發(fā)現(xiàn)，橄欖ACP cDNA轉(zhuǎn)入煙草葉綠體的株系與轉(zhuǎn)入核基因的株系相比積累低水平的ACP，同時(shí)轉(zhuǎn)葉綠體基因的株系子葉顏色為淺綠色/白色，葉綠體發(fā)育不正常，延緩了萌發(fā)，減緩了煙株生長(zhǎng)，相反將目的基因轉(zhuǎn)入核基因的煙草株系表達(dá)高水平的ACP，并增加了油酸、亞麻酸含量，同時(shí)降低了16碳2烯酸和16碳3烯酸的含量，轉(zhuǎn)橄欖ACP煙草株系沒有對(duì)煙草中脂肪酸的合成產(chǎn)生較大的影響，但從一定程度上促進(jìn)了長(zhǎng)鏈脂肪酸（C18）的合成及其后亞麻酸（18∶3）和油酸（18∶1）的生成［60］。Tang等［61］將花生酰基載體蛋白（AhACP）在轉(zhuǎn)基因煙草中過表達(dá)和反義抑制發(fā)現(xiàn)，與野生型相比過表達(dá)AhACP使轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)多不飽和脂肪酸（C18∶2 和 C18∶3）含量顯著增加，提高了煙草抗冷性，而反義抑制AhACP的轉(zhuǎn)基因煙草植株內(nèi)多不飽和脂肪酸含量降低，對(duì)低溫脅迫更敏感。趙彥朋等［62］通過同步抑制Fad2與FatB（酰基轉(zhuǎn)移酶）基因表達(dá)，顯著提高了煙草種子中油酸組分的含量。

將煙草中的線粒體ω-6 脂肪酸去飽和酶基因（FAD2）表達(dá)沉默后發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD2表達(dá)沉默后在煙草不同組織中的引起的效應(yīng)有所不同，其顯著增加了葉片和種子中油酸的含量，同時(shí)一些極性脂類中棕櫚酸的含量顯著降低，說明由FAD2沉默所引起的煙草內(nèi)脂肪酸代謝變化的效應(yīng)是多重的［63］。Zhang等［64］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AD2 沉默表達(dá)后，在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的油酸含量顯著升高。將煙草ω-3脂肪酸去飽和酶（NtFAD3）的有義鏈和反義鏈基因分別轉(zhuǎn)入煙草表達(dá)后發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，在轉(zhuǎn)入NtFAD3反義鏈基因的株系NtFAD3 mRNA水平降低了30%，根中亞麻酸（18∶3）脂肪酸含量降低了80%，而葉中則降低了70%-80%，相反，過表達(dá)有義鏈的煙草中NtFAD3 mRNA水平增加了8倍，根及葉片中亞麻酸含量分別增加了1.5、1.1倍，說明通過基因工程對(duì)高等植物中線粒體ω-3脂肪酸去飽和酶基因表達(dá)水平調(diào)控可有效調(diào)節(jié)植物中18∶3脂肪酸的含量［65］。將油菜FAD3基因和擬南芥FAD8基因分別導(dǎo)入煙草懸浮細(xì)胞和植株中過表達(dá)，過表達(dá)FAD3基因植株亞麻酸/亞油酸的比例顯著增加，而過表達(dá)FAD8基因則引起質(zhì)體內(nèi)脂質(zhì)含量的增加，同時(shí)顯著增加了煙草懸浮細(xì)胞和植株的熱敏感性；過表達(dá)FAD3和FAD8基因增加了煙草植株對(duì)干旱和煙草懸浮細(xì)胞對(duì)滲透脅迫的耐受性，干旱脅迫引起亞麻酸水平的下降可能間接反映了干旱脅迫對(duì)煙草的傷害［66］。

質(zhì)體ω-3去飽和酶（NtFAD7）可催化甘油糖脂中含兩個(gè)雙鍵的脂肪酸（16∶2和18∶2）轉(zhuǎn)化為三烯脂肪酸（16∶3和α-18∶3），二者均是葉綠體膜的重要組分，Kodama 等［67-68］將擬南芥葉綠體ω-3脂肪酸去飽和酶基因（FAD7）轉(zhuǎn)入煙草后，提高了低溫下轉(zhuǎn)基因煙草葉片中的16∶3和18∶3脂肪酸含量，緩解了低溫脅迫對(duì)煙草生長(zhǎng)的抑制作用。而經(jīng)過低溫15℃鍛煉的普通煙草葉片內(nèi)三烯脂肪酸含量及主要的極性脂的不飽和度均顯著增加，低溫鍛煉時(shí)普通煙葉內(nèi)三烯脂肪酸含量的增加是提高煙草非冰凍低溫環(huán)境下抗冷性的先決條件。而通過引入NtFAD7雙鏈RNA結(jié)構(gòu)則可下調(diào)煙葉內(nèi)NtFAD7的轉(zhuǎn)錄水平，并可作為降低高等植物營(yíng)養(yǎng)組織中三烯脂肪酸的含量一個(gè)有效手段［69］。Khodakovskaya等［70］將擬南芥葉綠體FAD7基因?qū)霟煵萦酌鐑?nèi)，與野生型煙草幼苗低溫處理44 d后相比，轉(zhuǎn)基因煙草幼苗維持較高的存活率（40.2%-96%）、較高的三烯脂肪酸水平，同時(shí)葉綠體結(jié)構(gòu)在低溫脅迫下較穩(wěn)定，而野生型則存活率較低（6.7%-10.2%）且三烯脂肪酸含量急劇降低，葉綠體基粒堆垛減少，葉綠素含量降低，表明轉(zhuǎn)FAD7基因煙草在低溫脅迫下有較好的適應(yīng)性和耐冷性。

Cahoon等［71］將芫荽脂酰-ACP去飽和酶基因轉(zhuǎn)入煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草愈傷組織內(nèi)有歐芹酸（18:1Δ6cis）和16碳烯酸（Δ4）的積累，說明該酶參與了煙草中歐芹酸和其他不常見脂肪酸的合成。Sayanova等［72-73］將玻璃苣的Δ6去飽和酶基因轉(zhuǎn)入煙草后，煙草種子和其他組織中均有新的Δ6不飽和脂肪酸如18碳4烯酸（C18∶4）、γ 亞油酸的積累，二者主要分布質(zhì)體和線粒體中甘油酯骨架的sn-2位置，這可能暗示著這些新合成的脂類可融入細(xì)胞膜的脂類中參與細(xì)胞膜的構(gòu)建，由于玻璃苣的Δ6去飽和酶基因主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表達(dá)，因此轉(zhuǎn)基因煙草線粒體和質(zhì)體中的這兩種脂類可能是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上發(fā)生去飽和作用后轉(zhuǎn)移到質(zhì)體和線粒體中，進(jìn)而提高了煙草亞油酸和18碳4烯酸的含量。將外源Δ9去飽和酶轉(zhuǎn)入煙草后，轉(zhuǎn)基因煙草葉片、種子中脂肪酸含量及不飽和度顯著增加，電解質(zhì)滲透率降低，煙草植株及煙草種子的耐冷性均顯著增強(qiáng)［74-76］。

脂肪酸脫氫酶是植物多不飽和脂肪酸合成中的關(guān)鍵酶，將深黃被包霉Δ9-脂肪酸脫氫酶和高山被包霉Δ6-脂肪酸脫氫酶基因分別導(dǎo)入煙草中的表達(dá)后顯著提高了煙草中亞麻酸和18碳4烯酸的含量［77-78］。將貓爪藤ACP-Δ9脂肪酸脫氫酶（MucACPΔ9D）基因轉(zhuǎn)入煙草并過表達(dá)的研究表明，MucACPΔ9D能在煙草細(xì)胞質(zhì)體內(nèi)高效催化ACP-C16∶0生成 ACP-C16∶1Δ9，進(jìn)一步延伸產(chǎn)生 C18∶1Δ11，最終使煙草中ω-7脂肪酸從對(duì)照中極低水平提高到25.4%-29.4%［79］。將釀酒酵母脂酰 -CoAΔ9脫氫酶（ScΔ9D）分別轉(zhuǎn)入煙草質(zhì)體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)后顯著提高了轉(zhuǎn)基因煙草葉片中單不飽和棕櫚油酸及順式18碳烯酸含量，同時(shí)降低了飽和的棕櫚酸、亞油酸和亞麻酸含量，且以質(zhì)體定位的轉(zhuǎn)ScΔ9D處理高于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位的轉(zhuǎn) ScΔ9D 處理［80］。

二?；视王；D(zhuǎn)移酶（DGTA）是三酰甘油（TAG）合成的關(guān)鍵酶，將擬南芥 DGTA 和 LEC2 基因轉(zhuǎn)入煙草莖中過表達(dá)后，轉(zhuǎn)基因煙草成熟的莖中脂肪酸積累與對(duì)照比分別顯著增加63%和80%，同時(shí)質(zhì)體中有關(guān)脂肪酸合成的蛋白質(zhì)基因表達(dá)水平也顯著提高［81］。將油葵DGTA轉(zhuǎn)入煙草后提高了煙草葉片中油酸、軟脂酸和硬脂酸的含量［82］。而通過干擾技術(shù)將煙草中DGTA基因沉默后，DGTA轉(zhuǎn)錄水平降低，煙草中各組織中的油脂含量降低，說明DGTA在煙草脂肪酸的合成中發(fā)揮著重要的作用［83］。

4 結(jié)語

綜上所述，煙草植株（莖、葉、種子）中均含有豐富的油脂和各種脂肪酸，尤其以煙草種子中不飽和脂肪酸含量最高，通過各種基因工程，可顯著提高煙草植株中的油脂和脂肪酸積累，可作為潛在的生物能源加以開發(fā)利用，具有很高的應(yīng)用前景。

在煙草種子發(fā)育成熟過程中，不飽和脂肪酸大量積累，并以亞油酸為主。在煙草植株的生長(zhǎng)發(fā)育及葉片成熟衰老過程中，煙葉內(nèi)各類脂肪酸含量呈先增大后降低的趨勢(shì)，且總脂肪酸總量的變化趨勢(shì)與該過程中葉綠素含量先增高后降低的趨勢(shì)一致，同時(shí)隨著煙葉成熟衰老，煙葉內(nèi)飽和脂肪酸含量降低，而不飽和脂肪酸含量則逐漸增加；在空間分布上，以煙株的中、下部葉片的脂肪酸含量較高，上部葉較低；在煙葉組織中則以柵欄組織中高級(jí)脂肪酸的含量高于海綿組織中的，因此在煙葉烘烤調(diào)制時(shí)，可根據(jù)煙葉脂肪酸含量的高低，選擇適宜的烘烤條件及調(diào)制措施，以利于煙葉品質(zhì)和風(fēng)格形成。

不同基因型煙草中的脂肪酸含量組成存在差異，各種環(huán)境因素如土壤理化性質(zhì)，光照、溫度和地理因素（海拔、維度）施肥、烘烤和產(chǎn)區(qū)綜合生態(tài)環(huán)境因素均會(huì)對(duì)煙草中脂肪酸的積累、代謝及組成產(chǎn)生顯著的影響；同時(shí)機(jī)械損傷、病原菌感染、細(xì)胞分裂的病變也會(huì)引起煙草脂肪酸含量和組成的變化，這可能也是植物對(duì)各類環(huán)境的一種適應(yīng)機(jī)制。因此，可根據(jù)煙葉品質(zhì)需求，選擇適宜的氣候條件栽培煙草，以利于煙葉中脂肪酸的代謝進(jìn)而提高煙葉品質(zhì)。

通過基因工程過表達(dá)脂肪酸合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶，如檸檬酸裂解酶（ACL）、乙酰-CoA羧化酶（ACCase）、β-酮脂酰 -ACP 合酶 I（KAS I）、酰基載體蛋白（ACP）等均可顯著提高煙草內(nèi)脂肪酸的總量。而在煙草中高表達(dá)各種脂肪酸去飽和酶如FAD2、FAD、FAD7及各類脂肪酸脫氫酶均可顯著改變脂肪酸中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸的比例，使煙草內(nèi)不飽和脂肪酸含量顯著升高，以此提高煙草對(duì)各種逆境，如低溫、干旱、強(qiáng)光等脅迫環(huán)境下的適應(yīng)能力及抗逆性，這可能歸因于不飽和脂肪酸比例提高，進(jìn)而增加了逆境脅迫下植物細(xì)胞膜的流動(dòng)性，穩(wěn)定了細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)［7］，這也為通過基因工程提高其他作物抗逆性的研究，從脂肪酸代謝的角度提供了一個(gè)新的思路及方向。

最近，我們研究組的結(jié)果證實(shí)［84］，通過低溫鍛煉的方法可改變小桐子體內(nèi)脂肪酸組成、含量及分布，進(jìn)而提高小桐子幼苗的抗冷性，但針對(duì)高溫、干旱鍛煉途徑提高植物抗逆性的過程中，脂肪酸代謝在鍛煉前后如何變化及其作用機(jī)制則尚不清楚，在未來的研究中也值得系統(tǒng)深入的探索。此外，植物體內(nèi)脂肪酸代謝（組成、含量和分布）對(duì)干旱、高溫、低溫及鹽脅迫等環(huán)境的響應(yīng)是否有共性及特性，這還需進(jìn)一步系統(tǒng)的研究，以確定脂肪酸代謝在植物應(yīng)對(duì)逆境脅迫時(shí)的作用及機(jī)制。

目前，不同環(huán)境因素對(duì)不同植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中，不同時(shí)期、不同部位（果實(shí)、種子、莖和葉等）、脂肪酸組成、分布及含量的影響及調(diào)控機(jī)制還不清楚，特別是針對(duì)一些富含油脂的經(jīng)濟(jì)作物，如油菜、花生、大豆、玉米和向日葵等還未有系統(tǒng)的研究和報(bào)道，將來的研究中可選取這些重要的經(jīng)濟(jì)作物為研究對(duì)象，探究不同環(huán)境因素對(duì)脂肪酸代謝的影響，以便合理規(guī)劃種植；或通過人工方法，改善油料作物的生長(zhǎng)環(huán)境以利于脂肪酸合成代謝；另外還可以利用基因工程針對(duì)一些重要的油料作物中脂肪酸代謝途徑中關(guān)鍵酶的基因加以修飾改造，促進(jìn)脂肪酸的含量和不飽和脂肪酸的比例的增加，提高其經(jīng)濟(jì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。

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Research Advances on Metabolism of Higher Fatty Acids in Nicotiana tabacum and Its Affecting Factors

YANG Li-yun1YANG Shuang-long1LI Jun-ying2PANG Tao2HE Bin3GONG Ming1
（1. School of Life Sciences，Engineering Research Center of Sustainable Development and Utilization of Biomass Energy，Ministry of Education，Key Laboratory of Biomass Energy and Environmental Biotechnology of Yunnan Province，Yunnan Normal University，Kunming 650500 ；2. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences，Kunming 650031 ；3. Yunnan Tobacco Leaf Company，Kunming 650218）

As one kind of important compounds in tobacco plants，fatty acids play remarkable roles in their growth and development，as well as tobacco quality and flavor. Recently，it also has been verified that fatty acids are involved in the formation of stress tolerance in tobacco plants. Tobacco seeds are rich in lipids and various kinds of fatty acids，and the contents of linoleic acid，oleic acid and palmitic acid increase gradually with the developing of tobacco seeds；and they can be considered to be utilized as a potential biomass source. During the process of growth and development of tobacco leaves，fatty acid contents increase gradually，reach the maximum when tobacco plants are blooming，then decrease during maturing and senescing of tobacco leaves；at the same time，the saturated fatty acids are transformed into the unsaturated ones. Moreover，the contents of fatty acids are higher in lower and middle leaves than those in upper ones of tobacco plants，and also higher in palisade tissue than in spongy tissue in tobacco leaves. In addition，genotype and environmental factors such as light irradiation，temperature，geographical factors，fertilization，flue-curing methods，mechanical injury and so on apply significant effects on composition and content of fatty acids，as well as key enzyme activities and their gene expressions in the biosynthesis and metabolism of fatty acids in tobacco leaves.Chill-hardening may enhance chilling resistance of tobacco plants by increasing the contents of the polyunsaturated fatty acids and reducing

脂肪酸（Fatty acids，F(xiàn)A）是一類由碳、氫和氧3種元素組成的重要生物活性物質(zhì)，按碳鏈的長(zhǎng)短可分為長(zhǎng)鏈（＞20C）、中長(zhǎng)鏈（8-18C）、短鏈脂肪酸（4-7C）；按飽和程度可分為飽和脂肪酸（Saturated fatty acid，SFA）和不飽和脂肪酸［單不飽和脂肪酸，（Monounsaturated fatty acids，MUFA）及多不飽和脂肪酸，（Polyunsaturated fatty acids，PUFA）］。植物中的脂肪酸分布廣泛、種類繁多、含量豐富，具有重要的功能，如脂肪酸是細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜中膜脂主要成分；同時(shí)也是植物分泌的蠟質(zhì)和植物表皮角質(zhì)層的主要組分，可使植物有效防止外部機(jī)械損傷、熱量和水分散失及病原菌侵害；一些脂肪酸還作為重要的信號(hào)分子參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、參與對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控及對(duì)各種逆境脅迫的響應(yīng)和適應(yīng)；脂肪酸還是各種含油種子的子葉和胚乳中合成儲(chǔ)存脂質(zhì)，如三?；视停═riacylglycerols，TAG）的重要原料，可為種子萌發(fā)提供能量，同時(shí)作為人類食物中油脂的重要來源之一，為人類提供能量和營(yíng)養(yǎng)。另外，一些植物中豐富的脂肪酸還可作為重要的生物能源物質(zhì)加以利用，減緩各種因化石燃料使用造成的污染和由此產(chǎn)生的溫室效應(yīng)［1-4］。

煙草（Nicotiana tabacum L.）作為重要的經(jīng)濟(jì)作物之一被大量的種植，同時(shí)作為一種重要的科研模式植物被廣泛研究。煙草中的脂肪酸可分為揮發(fā)性低級(jí)脂肪酸和半揮發(fā)性高級(jí)脂肪酸兩大類，亞油酸和亞麻酸會(huì)增加煙葉的刺激性，而碳原子在12以上的各類高級(jí)脂肪酸則可賦予煙葉特殊的香氣，對(duì)煙葉的品質(zhì)和風(fēng)味有重要的影響［5-6］。同時(shí)，煙草植株中脂肪酸的組成、含量及分布在其對(duì)各類逆境脅迫的適應(yīng)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用［7-9］。此外，煙草種子和葉片中均富含各類脂肪酸，可作為重要的生物能源加以開發(fā)利用，具有可觀的應(yīng)用前景［10-11］。

已有學(xué)者對(duì)煙草中脂肪酸做了部分研究和報(bào)道，但對(duì)脂肪酸在煙草不同部位的分布、組成、含量及其在煙草植株生長(zhǎng)發(fā)育的過程中的變化及影響其代謝的因素尚未有詳盡的報(bào)道。因此，本文對(duì)近年來國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)煙草脂肪酸的研究工作進(jìn)行了綜述和分析，以期為煙草植株中脂肪酸的研究和優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)提供參考，同時(shí)為不同產(chǎn)區(qū)不同風(fēng)格的煙葉形成機(jī)制從脂肪酸代謝的角度作出相關(guān)的解釋。

Giannelos等研究顯示，煙草種子生物量的38%-40%均為油脂，主要組分為亞油酸、油酸和棕櫚酸［10］。Azam等研究也發(fā)現(xiàn)，煙草籽油中富含各種脂肪酸，并以不飽和脂肪酸為主，其中亞油酸、油酸和棕櫚酸分別占71.63%、13.46% 和 8.72%，因此，煙草種子中的油脂可作為重要的可再生生物能源加以開發(fā)利用，具有可觀的應(yīng)用前景［11］。在煙草植株的花發(fā)育形成種子的過程中，脂肪酸含量急劇增加，特別是亞油酸含量，其占煙草種子中油脂的75%左右［5］。柴家榮［12］對(duì)烤煙K326和白肋煙TN86種子萌發(fā)時(shí)脂肪酸含量及脂肪酶活性變化研究顯示，二者在種子萌發(fā)過程中均呈波動(dòng)上升的趨勢(shì)，脂肪酶活性高峰出現(xiàn)在96 h而脂肪酸含量高峰出現(xiàn)在168 h，滯后于脂肪酶活性的高值期，萌發(fā)期間粗脂肪含量以K362較高，而酶活性及脂肪酸含量則以TN86的較高，不同煙草類型間差異較顯著。

Chu和Tso［5］研究表明，上部煙葉中的脂肪酸含量在移栽75 d后早期開花時(shí)達(dá)到最高，而在衰老的葉片中脂肪酸含量則持續(xù)的降低；隨著葉片的生the contents of saturated fatty acids. It is also an effective method to increase the contents of unsaturated fatty acids in tobacco plants with overexpressing the genes of the acyl-ACP desaturase，ACP，fatty acids desaturase and fatty acids dehydrogenase by genetic engineering，which in turn improves the stress tolerance of tobacco plants to abiotic stresses，such as drought，high temperature and highlight stress and so on. Based on the above-mentioned works，the paper presents the future research direction，aiming at providing the theoretical and practical guidance for the study of this field.

Nicotiana tabacum；higher fatty acids；metabolism；affecting factors長(zhǎng)發(fā)育，煙葉內(nèi)的亞麻酸含量呈逐漸增加的趨勢(shì)，從早期的30%到成熟時(shí)的60%，而相同時(shí)期的其他脂肪酸（18∶2、18∶1、18∶0和16∶0）則逐漸降低，說明隨著上部煙葉的成熟，煙葉內(nèi)的脂肪酸在去飽和酶的作用下轉(zhuǎn)化為不飽和脂肪酸。Koiwai等［13］研究也發(fā)現(xiàn)，在煙葉生長(zhǎng)發(fā)育和成熟衰老過程中，煙葉中脂肪酸總量先增加后降低，該過程與煙葉中葉綠素含量先增加后降低的趨勢(shì)同步。宮長(zhǎng)榮等［14］研究發(fā)現(xiàn)，隨著煙葉成熟度的提高，煙葉內(nèi)棕櫚油酸、油酸和亞麻酸含量持續(xù)下降，而月桂酸含量顯著增加，其余幾種脂肪酸大多在煙葉適熟時(shí)含量最高，過熟時(shí)下降。對(duì)打頂后K326中部煙葉分析發(fā)現(xiàn)，隨著煙葉的成熟，煙葉中高級(jí)脂肪酸含量呈大幅度降低的趨勢(shì)［15］。對(duì)云南烤煙分析發(fā)現(xiàn)，高級(jí)脂肪酸在上部煙葉中含量較低，在中、下部煙葉含量較高［16］。對(duì)不同葉位煙葉研究發(fā)現(xiàn)，自下向上第8-12片煙葉中的飽和脂肪酸及不飽和脂肪酸含量呈先增大后降低，至第12片煙葉又達(dá)到最大值，其中以第9片煙葉的含量最高［17］。對(duì)K326和紅大下部適熟第4、10、16片煙葉海綿組織和柵欄組織分析發(fā)現(xiàn)，高級(jí)脂肪酸均以柵欄組織中的最高［18］。

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0391

2017-05-13

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31260064，31460059），國(guó)家煙草專賣局科技專項(xiàng)［110201101003（TS-03）］，2016年云南省博士學(xué)術(shù)新人獎(jiǎng)（01700205020516002）

楊利云，男，博士研究生，研究方向：農(nóng)業(yè)生物環(huán)境工程；E-mail：sunnyyangliyun@163.com

龔明，男，博士，教授，研究方向：農(nóng)業(yè)生物環(huán)境工程及逆境生物學(xué)；E-mail：gongming6307@163.com

（責(zé)任編輯 狄艷紅）