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        基于科教結(jié)合的儀器分析創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        2017-04-11 01:08:50宋紅杰鄧冬艷張立春
        關(guān)鍵詞:碳點(diǎn)超純水緩沖溶液

        宋紅杰,鄧冬艷,張立春,呂 弋

        (四川大學(xué) 化學(xué)學(xué)院,四川 成都 610065)

        ·創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)技術(shù)·

        基于科教結(jié)合的儀器分析創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        宋紅杰,鄧冬艷,張立春,呂 弋

        (四川大學(xué) 化學(xué)學(xué)院,四川 成都 610065)

        為了貫徹四川大學(xué)關(guān)于建設(shè)一批綜合性、設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)課程和創(chuàng)新探索(創(chuàng)業(yè))型實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)改革指導(dǎo)方針,該文將科研工作與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合,根據(jù)科研成果設(shè)計(jì)了儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中一個(gè)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目——基于碳納米點(diǎn)(簡(jiǎn)稱“碳點(diǎn)”)熒光光譜法測(cè)定谷胱甘肽。該實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象穩(wěn)定、重復(fù)性好、創(chuàng)新性強(qiáng),可作為儀器分析實(shí)驗(yàn)課程的教學(xué)實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)涵蓋了較多供學(xué)生自行探索的實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和研究課題,比如碳納米點(diǎn)不同制備方法、碳納米點(diǎn)尺寸與熒光特性關(guān)系、熒光探針設(shè)計(jì)和檢測(cè)對(duì)象等,因此也可用做開放式綜合化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目。

        創(chuàng)新實(shí)驗(yàn);儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué);熒光光譜法;碳納米點(diǎn);谷胱甘肽

        為了更好地貫徹落實(shí)《四川大學(xué)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)教育改革行動(dòng)計(jì)劃》(川大教[2016]1號(hào)),推動(dòng)國家雙創(chuàng)示范基地建設(shè),充分利用國家級(jí)、省級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心和校級(jí)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心的有利條件,建設(shè)一批綜合性、設(shè)計(jì)型實(shí)驗(yàn)課程和創(chuàng)新探索(創(chuàng)業(yè))型實(shí)驗(yàn)課程,提高學(xué)生實(shí)踐動(dòng)手能力和創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)能力,學(xué)校啟動(dòng)了四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)改革項(xiàng)目。本文作者積極參與了該教學(xué)改革項(xiàng)目,將科研工作與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合,在實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容與方式改革方面做了諸多嘗試;根據(jù)部分前沿性較強(qiáng)、具有可行性的科研成果設(shè)計(jì)了儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中一個(gè)創(chuàng)新性教學(xué)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,供儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中使用,也可供開放式實(shí)驗(yàn)教學(xué)選用,在相關(guān)開放性實(shí)驗(yàn)室獨(dú)立完成實(shí)驗(yàn)。該實(shí)驗(yàn)把科研工作和基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合,有利于培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新意識(shí)、探索精神和科學(xué)素養(yǎng),并提高了學(xué)生實(shí)踐動(dòng)手能力和獨(dú)立分析與解決問題的綜合能力。

        1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)背景與意義

        儀器分析實(shí)驗(yàn)是四川大學(xué)化學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)中心針對(duì)化學(xué)化工類、高分子材料類、環(huán)境類、醫(yī)藥類及生物類專業(yè)學(xué)生開設(shè)的一門重要的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)課程。目前該課程在實(shí)驗(yàn)內(nèi)容設(shè)置上尚有不足之處,主要是缺乏綜合性、設(shè)計(jì)性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目,實(shí)驗(yàn)內(nèi)容中學(xué)生能夠自主設(shè)計(jì)與探索的部分較少;從實(shí)驗(yàn)原理、實(shí)驗(yàn)方法、內(nèi)容、步驟到問題思考與討論,基本上是預(yù)先設(shè)定的,學(xué)生沒有太多選擇、發(fā)揮和自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的機(jī)會(huì),不利于激發(fā)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)興趣、主觀能動(dòng)性和實(shí)踐積極性,也不利于學(xué)生思維、實(shí)踐和解決問題能力的提高。本文嘗試將科研工作與實(shí)驗(yàn)教學(xué)相結(jié)合,旨在開發(fā)儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中綜合性、創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目[1],探索以學(xué)生為主體、以興趣為驅(qū)動(dòng)、以問題為導(dǎo)向[2]的實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容,將科研的思維方法和技能融入實(shí)驗(yàn)教學(xué)中,增加實(shí)驗(yàn)教學(xué)的探索性、研究性和設(shè)計(jì)性,激發(fā)學(xué)生探究實(shí)驗(yàn)的好奇心、學(xué)習(xí)興趣、主觀能動(dòng)性和實(shí)踐積極性,深化基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革,提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量,為培養(yǎng)高素質(zhì)專業(yè)創(chuàng)新人才打下堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

        熒光光譜分析方法是分析化學(xué)的一個(gè)重要組成部分,在臨床診斷[3-4]、食品檢驗(yàn)[5-6]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[7-8]等領(lǐng)域都有廣泛應(yīng)用,與此相關(guān)的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目在儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱中有明確要求。四川大學(xué)儀器分析實(shí)驗(yàn)課程中基于熒光光譜法的實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目“熒光法測(cè)定維生素B2片劑中核黃素含量”屬于驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)。核黃素是傳統(tǒng)的熒光物質(zhì),實(shí)驗(yàn)內(nèi)容簡(jiǎn)單,需要學(xué)生思考與探索的余地較少,因此,進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)內(nèi)容的改革與調(diào)整對(duì)該實(shí)驗(yàn)課程來說勢(shì)在必行。近年來,碳納米點(diǎn)(CDs)作為一種新穎的碳質(zhì)納米材料,由于其優(yōu)異的性質(zhì)引起了廣泛的關(guān)注和研究興趣[9-11]。然而,儀器分析實(shí)驗(yàn)教學(xué)中幾乎沒有涉及該部分研究?jī)?nèi)容的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目。該創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目將涉及較少的科學(xué)前沿融合到基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中,開拓學(xué)生視野,訓(xùn)練學(xué)生的科研思維,增加實(shí)驗(yàn)過程的探索性和挑戰(zhàn)性,使得整個(gè)教學(xué)過程充滿科學(xué)探究的樂趣。

        2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

        2.1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/p>

        1)了解碳納米點(diǎn)的制備方法及表征技術(shù);

        2)掌握熒光分析法及熒光探針設(shè)計(jì)的原理;

        3)了解熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)和工作原理。

        2.2 實(shí)驗(yàn)原理

        以富含蛋白質(zhì)的雞蛋膜為“綠色”碳源,通過水熱或者高溫?zé)峤獾耐緩絹砗铣商键c(diǎn)。碳納米點(diǎn)在緩沖溶液中有較好的分散性和熒光特性,大約在275 nm波長(zhǎng)的光激發(fā)下,在450 nm處呈現(xiàn)出較強(qiáng)的熒光發(fā)射峰,并且它的熒光強(qiáng)度可以被Cu2+所猝滅。根據(jù)文獻(xiàn)推測(cè)碳納米點(diǎn)的熒光發(fā)射源自激子的輻射再結(jié)合[12],而Cu2+可以通過有效的電子轉(zhuǎn)移過程來加速非輻射的電子/空穴再結(jié)合的消除,從而導(dǎo)致碳納米點(diǎn)的熒光猝滅[13]。上述體系中再加入谷胱甘肽后,Cu2+與谷胱甘肽分子中的巰基具有形成Cu S鍵的強(qiáng)烈結(jié)合傾向[14],使得Cu2+被“拉離”碳點(diǎn)的表面,因此,碳點(diǎn)的熒光就得到部分恢復(fù)。在一定條件下,碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)效率與谷胱甘肽濃度存在線性關(guān)系,基于此熒光“關(guān)-開”探針系統(tǒng),建立了基于碳點(diǎn)熒光光譜法測(cè)定谷胱甘肽的方法。

        2.3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

        2.3.1 實(shí)驗(yàn)試劑與原料

        氫氧化鈉(NaOH,優(yōu)級(jí)純)購于科密歐化學(xué)試劑有限公司;硫酸銅(CuSO4,分析純)購于金杯精細(xì)化工有限公司;胱光甘肽(GSH)、人血清蛋白、尿酸、葡萄糖購于北京萊寶生物科技有限公司;雞蛋膜是從新鮮的雞蛋殼上剝離下來,雞蛋殼取自四川大學(xué)學(xué)生食堂;磷酸二氫鈉(NaH2PO4·2H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·7H2O)、鹽酸購于成都科龍化學(xué)試劑有限公司;實(shí)驗(yàn)用水來自優(yōu)普超純水系統(tǒng)純化制得的超純水(電阻率為18.24 MΩ·cm)。

        磷酸鹽緩沖溶液(PBS,0.01 mol/L)的配置:1 000mL超純水中加入13.682 0 g的NaH2PO4·2H2O和3.298 2 g的Na2HPO4·7H2O進(jìn)行溶解,在該溶液中滴加氫氧化鈉或者鹽酸溶液(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)至所需的pH值。

        2.3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

        實(shí)驗(yàn)儀器包括箱式電阻爐(SX-12-10,中興偉業(yè))、微波爐(P70D20TP-C6,Galanz)、離心機(jī)(H1850,湘儀)、紫外分光光度計(jì)(U-2910,Hitachi)、透射電鏡(G2F20 S-TWIN,Tecnai)、熒光光譜儀(F-4600,Hitachi)。

        2.4 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容

        2.4.1 碳納米點(diǎn)的制備

        碳點(diǎn)是通過微波輔助加熱處理“綠色”碳源(雞蛋膜灰)制備得到的,在開放式實(shí)驗(yàn)教學(xué)中,學(xué)生可對(duì)不同的碳源進(jìn)行探索,嘗試高溫高壓處理其他富含蛋白質(zhì)、纖維素或者糖類的有機(jī)物來制備碳點(diǎn)。微波輔助加熱處理雞蛋膜灰制備碳點(diǎn)的過程如下:所有玻璃、陶瓷器皿均使用王水(硝酸∶鹽酸=1∶3)充分浸潤(rùn)后,用超純水沖洗干凈后在烘箱中烘干備用。從雞蛋殼上小心剝下新鮮的雞蛋膜,并用大量的超純水沖洗,除去表面附著的雞蛋清和雜質(zhì),用陶瓷坩堝盛放雞蛋膜,然后置于電阻爐中在400°C的條件下烘干并灼燒2 h即得到雞蛋膜灰。在100 mL燒杯中加入30 mg雞蛋膜灰和50 mL 1 mol/L的NaOH溶液,混勻,然后將燒杯置于微波爐中加熱處理10 min即得到碳點(diǎn)。用大量超純水對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行多次離心洗滌(離心機(jī)轉(zhuǎn)速12 000 rpm),除去較大的顆粒物以及未反應(yīng)完全的物質(zhì)。將得到的碳點(diǎn)用100 mL超純水重新分散,避光4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

        本實(shí)驗(yàn)中,學(xué)生可對(duì)溶液濃度、微波功率、微波處理時(shí)間進(jìn)行探索,從而獲得具有不同尺寸和熒光強(qiáng)度的碳點(diǎn),具體探索實(shí)驗(yàn)內(nèi)容有以下3個(gè)方面。

        1)在一系列100 mL燒杯中分別加入30 mg雞蛋膜灰和50 mL不同濃度的NaOH溶液(濃度分別為0、0.1 mol/L、0.5 mol/L、1 mol/L、2 mol/L、5 mol/L和10 mol/L),混勻,然后將燒杯置于微波爐中加熱處理10分鐘,用超純水對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行多次離心洗滌,然后用100 mL超純水重新分散,分類標(biāo)記,避光4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

        2)在100 mL燒杯中加入30 mg雞蛋膜灰和50 mL 1 mol/L的NaOH溶液,混勻,然后將燒杯置于微波爐中以不同的加熱功率(分別采用低火、中火、中高火和高火)處理10 min,用超純水對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行多次離心洗滌,然后用100 mL超純水重新分散,分類標(biāo)記,避光4°C保存?zhèn)溆谩?/p>

        3)在100 mL燒杯中加入30 mg雞蛋膜灰和50 mL 1 mol/L的NaOH溶液,混勻,然后將燒杯置于微波爐中以中高火的加熱功率處理不同時(shí)間(分別是3,5,8,10,12,15,20,30 min),用超純水對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行多次離心洗滌,然后用100 mL超純水重新分散,分類標(biāo)記,避光4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        2.4.2 碳納米點(diǎn)尺寸與光譜特性的研究

        碳點(diǎn)尺寸的表征:將不同實(shí)驗(yàn)條件下制備的碳點(diǎn)分散液稀釋后滴于銅網(wǎng)碳支持膜上,并置于紅外燈下烘干,然后在高分辨透射電子顯微鏡上進(jìn)行表征,得到碳點(diǎn)的形貌及尺寸分布信息,考察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)制備碳點(diǎn)形貌及尺寸的影響。

        碳點(diǎn)的紫外可見吸收光譜(UV-vis)特性:利用紫外可見分光光度計(jì)上對(duì)不同實(shí)驗(yàn)條件下制備的碳點(diǎn)分散液在200~600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,得到最大吸收波長(zhǎng),考察不同實(shí)驗(yàn)條件對(duì)碳點(diǎn)的紫外吸收特性的影響。

        碳點(diǎn)的熒光光譜(FL)特性:在熒光分光光度計(jì)上探索不同實(shí)驗(yàn)條件下制備的碳點(diǎn)尺寸與熒光光譜、熒光強(qiáng)度的關(guān)系,考察激發(fā)波長(zhǎng)變化對(duì)碳點(diǎn)發(fā)射光譜的影響,考察不同的制備實(shí)驗(yàn)條件對(duì)碳點(diǎn)熒光特性的影響。初步研究表明:以雞蛋膜灰為原料直接微波加熱處理制備的碳點(diǎn)大約分別在275 nm和450 nm顯示出較強(qiáng)熒光激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)。

        2.4.3 熒光光譜法測(cè)定GSH

        1)基于碳點(diǎn)的熒光“關(guān)-開”探針的設(shè)計(jì)

        在5 mL比色管中加入10μL碳點(diǎn)的分散液,用0.01 mol/L PBS緩沖溶液定容,在室溫條件下立即在熒光分光光度計(jì)上進(jìn)行熒光發(fā)射光譜掃描(激發(fā)、發(fā)射狹縫寬度設(shè)為5 nm;激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為275 nm;發(fā)射光譜掃描范圍350~530 nm),記錄體系熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度(F0)。在5 mL比色管中依次加入10μL碳點(diǎn)的分散液、10μL硫酸銅溶液(Cu2+溶液)和不同濃度的谷胱甘肽溶液,用0.01 mol/L PBS緩沖溶液定容。然后在上述儀器條件下進(jìn)行熒光測(cè)定,記錄混合體系熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度,即為碳點(diǎn)恢復(fù)的熒光強(qiáng)度(ΔF),計(jì)算碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)效率(ΔF/F0)。緩沖溶液pH值、Cu2+濃度、儀器測(cè)試條件恒定的情況下,ΔF/F0取決于谷胱甘肽的濃度,據(jù)此可實(shí)現(xiàn)谷胱甘肽的測(cè)定。

        2)谷胱甘肽測(cè)試條件的優(yōu)化

        改變實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1)中緩沖溶液的pH值,測(cè)定同一體系在不同pH值條件下碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)效率(ΔF/F0),考察pH值對(duì)ΔF/F0的影響,確定合適的緩沖溶液pH值以用于后續(xù)熒光定量檢測(cè)GSH實(shí)驗(yàn)。

        改變實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1)中所加Cu2+溶液的濃度,測(cè)定同一體系在不同猝滅劑(Cu2+)濃度條件下碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)效率(ΔF/F0),選擇合適的猝滅劑濃度以用于后續(xù)熒光定量GSH檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。

        3)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

        按照實(shí)驗(yàn)內(nèi)容1)的方法配置碳點(diǎn)空白溶液和一系列待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液:其中緩沖溶液pH值和猝滅劑濃度按照2)中選定的結(jié)果執(zhí)行,待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)溶液中谷胱甘肽溶液的濃度從0.01μmol/L增加到200μmol/L。在相同的儀器條件下測(cè)定碳點(diǎn)空白溶液的熒光強(qiáng)度F0和加入不同濃度GSH時(shí)碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)強(qiáng)度ΔF,計(jì)算其熒光恢復(fù)效率(ΔF/F0)。分別以ΔF/F0和GSH濃度為縱、橫坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性方程和相關(guān)系數(shù),并計(jì)算該方法的檢出限。

        4)熒光探針的選擇性

        谷胱甘肽通過與自由基、酶的相互作用來參與生命體系的新陳代謝生理過程。生物樣品中谷胱甘肽的準(zhǔn)確測(cè)定關(guān)乎健康和疾病。因此,探針的選擇性也需要進(jìn)行考察。在CDs-Cu2+-GSH體系中加入其他在生物樣品中通常共存的生物小分子(例如人血清蛋白、尿酸、葡萄糖等),考察共存物對(duì)碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)效率ΔF/F0的影響。

        5)樣品測(cè)定

        按標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)步驟,在5 mL比色管中依次加入10μL碳點(diǎn)的分散液、10μL硫酸銅溶液(Cu2+溶液)和10μL經(jīng)過濾、離心和稀釋處理的生物樣品溶液(血清或尿液),用0.01 mol/L PBS緩沖溶液定容,在相同實(shí)驗(yàn)條件和儀器參數(shù)下測(cè)定碳點(diǎn)的熒光恢復(fù)強(qiáng)度ΔF,計(jì)算其熒光恢復(fù)效率(ΔF/F0)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出和計(jì)算試樣中GSH的含量(μmol/L)。

        3 結(jié)束語

        本實(shí)驗(yàn)教學(xué)項(xiàng)目首先通過“綠色”方法制備碳點(diǎn)對(duì)學(xué)生進(jìn)行有關(guān)新型碳質(zhì)材料制備與表征方面的知識(shí)與技能教學(xué);其次根據(jù)這種新型碳納米材料的熒光特性,又設(shè)計(jì)了熒光“關(guān)-開”探針用于檢測(cè)GSH,有利于學(xué)生探索新型分析方法。該實(shí)驗(yàn)已在本科化學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)教學(xué)中順利實(shí)施并獲得好評(píng)。在教學(xué)實(shí)踐中,學(xué)生參與其中進(jìn)行自主設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容,在探索制備方法、熒光特性與碳點(diǎn)尺寸的相關(guān)性和檢測(cè)對(duì)象方面做了諸多嘗試,激發(fā)了學(xué)生對(duì)科學(xué)研究的興趣,增強(qiáng)了教學(xué)實(shí)驗(yàn)的趣味性,大大提高了基礎(chǔ)化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的質(zhì)量。

        [1]宋紅杰,張立春,呂弋.大學(xué)化學(xué)綜合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)的教學(xué)探索[J].實(shí)驗(yàn)技術(shù)與管理,2015,32(7):197-201.

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        Design of Innovative Instrumental Analysis Experiment Based on the Combination Scientific Research and Teaching

        SONG Hongjie,DENG Dongyan,ZHANG Lichun,LV Yi
        (College of Chemistry,Sichuan University,Chengdu 610065,China)

        In order to carry out the teaching reform guidelines of Sichuan University on the construction of a number of compre hensive,design-typed experimental courses and innovative exploration(entrepreneurial)experimental courses,scientific research were combined with experimental teaching in this paper.According to some research achievements,an innovative instrumental analysis teaching experiment——Carbon Nanodots(CDs)-based fluorescent spectrometry for detection of glutathione(GSH),was explored and designed.This experiment is stable,reproducible and innovative.It can be used as a teaching experiment of instrumental analysis experiment.Meanwhile,there aremany opening experiment contents and research topics including different preparationmethods of car bon nanodots,the correlativity between the size and fluorescence characteristic of carbon nanodots,the design of fluorescent probe,and other target analysis,therefore,the experiment can be used in opening comprehensive chemical experiment teaching project.

        innovative experiment;instrumental analysis experiment teaching;fluorescent spectrometry;Carbon nanodot;Gluta thione

        G642.0;O6-32

        A

        10.3969/j.issn.1672-4550.2017.03.004

        2017-02-09;修改日期:2017-02-23

        國家自然科學(xué)基金(21405107&21505095);四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)改革項(xiàng)目(2016-41)。

        宋紅杰(1981-),女,博士,實(shí)驗(yàn)師,主要從事分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)工作和基于納米材料的發(fā)光分析方面的研究。

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