周 威,張奇峰,徐 凱,許紅梅,程清洲

(武漢輕工大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)與護(hù)理學(xué)院,湖北 武漢 420023)

蜂膠可吸收成分及其特征單體抑制心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究

周 威,張奇峰,徐 凱,許紅梅,程清洲

(武漢輕工大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)與護(hù)理學(xué)院,湖北 武漢 420023)

觀察蜂膠可吸收成分及其特征黃酮單體對(duì)阿霉素誘導(dǎo)大鼠心肌細(xì)胞凋亡模型的保護(hù)作用。從大鼠灌胃蜂膠提取物及其特征單體白楊素、高良姜素30 min后，腹主動(dòng)脈取血，離心制備含蜂膠及特征單體的血漿。提取SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞并培養(yǎng)，采用阿霉素制備心肌細(xì)胞凋亡模型；將制備的蜂膠及白楊素、高良姜素的血漿與心肌細(xì)胞混合，使用缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)進(jìn)行心肌細(xì)胞凋亡檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，蜂膠提取物、白楊素、高良姜素組可吸收成分心肌組織細(xì)胞凋亡率與模型組比較顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；蜂膠提取物組效果較好，蜂膠可吸收成分具有心肌細(xì)胞保護(hù)作用，減輕阿霉素誘導(dǎo)的心肌損傷。

蜂膠;可吸收成分;心肌細(xì)胞凋亡;白楊素;高良姜素

1 引言

蜂膠(propolis)是蜜蜂從植物幼芽與樹干上采集的樹膠與其上顎腺分泌物和蜂蠟等混合加工而成的一種具有芳香氣味的膠狀固體物。它主要由蜂膠香脂、蜂蠟、樹脂、花粉等組成[1-2]。近年來國內(nèi)外已有研究資料表明，蜂膠及其制劑具有良好的心肌保護(hù)作用[3-4]；但現(xiàn)有資料的研究主要集中在蜂膠(包括復(fù)方)原料及不同提取物、單體等對(duì)不同的體外細(xì)胞的作用，未顯示有蜂膠可吸收成分及其中的特征黃酮對(duì)心肌的保護(hù)作用及其細(xì)胞、分子機(jī)制的研究。本實(shí)驗(yàn)研究是在大鼠灌服蜂膠可吸收成分及其特征單體白楊素、高良姜素一段時(shí)間后，以灌服后的吸收成分為研究對(duì)象，以阿霉素造乳鼠心肌細(xì)胞損傷模型[5]，探討蜂膠對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用。

2 實(shí)驗(yàn)儀器及材料

KQ-500DE型超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器公司)；RE- 52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮公司)。凱達(dá)TGL-20LM臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南凱達(dá)科學(xué)儀器公司)；CO2培養(yǎng)箱(長沙華曦電子科技有限公司)；倒置相差顯微鏡CK-40(Olympus，Japan)；全自動(dòng)洗板機(jī)(北京普朗新技術(shù)有限公司)。注射用鹽酸阿霉素(浙江海正藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)140412))；白楊素(Lot：130402)和高良姜素(Lot：120815)均購自北京盛世康普化工技術(shù)研究院，純度以HPLC≥98%。健康SD雄性大鼠(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)為SCXK(鄂)2004-0007)。實(shí)驗(yàn)用蜂膠為本課題組前期批次所購，經(jīng)陳平(武漢輕工大學(xué)生物及制藥工程學(xué)院)教授鑒定，由武漢市小蜜蜂有限公司提供，采自湖北省神農(nóng)架林區(qū)[6]。

3 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 蜂膠中白楊素及高良姜素含量測定

蜂膠提取物按文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行制備，并根據(jù)2010版藥典一部蜂膠項(xiàng)下含量測定中高效液相測定方法[8]，對(duì)提取物中白楊素、高良姜素含量進(jìn)行測定。精密稱取提取物適量，加10倍量甲醇超聲提取2次，每次20分鐘，過濾并定容；精密稱取白楊素及高良姜素對(duì)照品，定容。選用色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Eclipse XDB-C18 保護(hù)柱。以甲醇-0.15%磷酸溶液(64:36)為流動(dòng)相，檢測波長為268 nm。連續(xù)測定5次。

3.2 含蜂膠血漿的制備

稱取蜂膠提取物、白楊素、高良姜素，加入食用酒精(95%)，潤濕浸泡，超聲提取2次，抽濾。根據(jù)2010版藥典[8]成人劑量0.2—0.6 g/ 60 kg，折算成大鼠給藥劑量，取SD 大鼠灌胃劑量為60 mg/kg，并通過蜂膠提取物中白楊素、高良姜素的含量計(jì)算灌胃劑量。大鼠隨機(jī)分生理鹽水、蜂膠提取物、白楊素、高良姜素給藥，每只大鼠每日2次，連續(xù)7 天，對(duì)照組給以同劑量的生理鹽水。末次灌胃前禁食12 h。末次灌胃45 min后，腹主動(dòng)脈采血，靜置，3000 r/min 離心分離血漿，置- 20 ℃保存?zhèn)溆肹9]。

3.3 心肌細(xì)胞的分離提取

參照文獻(xiàn)[10]方法，取出生 1—3 天的 SD 大鼠乳鼠，無菌條件下開胸，取出心臟，浸入預(yù)冷的盛有PBS 的培養(yǎng)皿中，轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)中操作，去除血管、心房、結(jié)締組織及殘留的血液，剪成碎塊，加入含胰酶和EDTA的消化液， 37 ℃水浴鍋中重復(fù)消化，制成細(xì)胞懸液，200 目尼龍網(wǎng)過濾，收集濾液，1000 r/min，離心5 min。棄上清，加入含13%FBS 的 DMEM 完全培養(yǎng)基10 ml，接種于培養(yǎng)瓶中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)后接種到細(xì)胞板中，細(xì)胞生長情況，每2天換液。

3.4 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法(TUNEL)檢測心肌細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)研究

根據(jù)文獻(xiàn)[11]方法，將3.3提取的心肌細(xì)胞純化后接種于六孔板中，用含15%小牛血清的DMEM的常規(guī)完全培養(yǎng)液培養(yǎng)，每24小時(shí)換液一次，72小時(shí)后加入藥，對(duì)照組只加入常規(guī)完全培養(yǎng)液，模型組加入含阿霉素的完全培養(yǎng)液，藥物組分別添加：蜂膠血漿、白楊姜素血漿、高良姜素血漿及含阿霉素的完全培養(yǎng)液。放置各組細(xì)胞于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在藥物作用48小時(shí)后取出各組細(xì)胞爬片，多聚甲醛固定，按照試劑盒說明書操作，進(jìn)行TUNEL細(xì)胞凋亡染色后置顯微鏡下觀察。每張切片在熒光顯微鏡(100倍鏡)下隨機(jī)選取10個(gè)視野，觀察凋亡細(xì)胞，計(jì)算凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)=心肌凋亡細(xì)胞數(shù)/總心肌細(xì)胞數(shù)×100%[12]。

4 結(jié)果

4.1 白楊素及高良姜素含量測定結(jié)果

高效液相圖譜如圖1所示。

1.高良姜素；2.白楊素；3.蜂膠提取物圖1 蜂膠提取物及白楊素、高良姜素對(duì)照品液相圖譜

通過圖1可知，在液相條件下白楊素、高良姜素能達(dá)到良好分離。建立對(duì)照品濃度-峰面積曲線，通過線性關(guān)系考察、精密度測試、穩(wěn)定性試驗(yàn)均達(dá)到要求。測試結(jié)果表明，白楊素濃度為(15.26±0.72)%；高良姜素濃度為(7.11±0.37)%。

4.2 心肌細(xì)胞凋亡試驗(yàn)(TUNEL法)

心肌凋亡主要圖譜如圖2所示。

圖2 心肌細(xì)胞凋亡試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)觀察及計(jì)算結(jié)果，各組間凋亡指數(shù)如表1所示。

組別凋亡值(%)正常組0%?◆模型組83．02±4．23◆蜂膠組46．07±2．47?白楊素組71．26±3．27?◆高良姜素組73．37±4．02?◆

注：標(biāo)“*”代表與模型組有顯著性差異(P<0.05)；標(biāo)“◆”代表與蜂膠組有顯著差異(P<0.05)。

從結(jié)果可知，阿霉素能明顯使心肌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡；蜂膠提取物及白楊素、高良姜素可吸收成分對(duì)阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡有緩解作用；但蜂膠組效果明顯優(yōu)于白楊素及高良姜素(P<0.05)。TUNEL標(biāo)記定位于心肌細(xì)胞核，凋亡陽性細(xì)胞呈棕褐色，細(xì)胞核固縮。觀察時(shí)正常心肌細(xì)胞有節(jié)律性搏動(dòng)，大部分細(xì)胞搏動(dòng)一致，細(xì)胞立體感明顯，多呈長梭形，且有分支或突起，細(xì)胞有互相聚集的趨勢；阿霉素處理模型組絕大部分細(xì)胞呈凋亡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)絲狀的肌原纖維明顯可見；蜂膠組、白楊素組、高良姜素等組有凋亡細(xì)胞，但相對(duì)模型組比數(shù)量上有差異，且有部分狀態(tài)良好的細(xì)胞，可見其明顯搏動(dòng)。

5 討論

根據(jù)已有文獻(xiàn)及本課題組前期的研究成果，蜂膠具有良好的心肌保護(hù)作用。本研究分析了大鼠灌胃蜂膠提取物、白楊素、高良姜素一段時(shí)間后取出的血漿對(duì)體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞凋亡影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，蜂膠提取物可吸收成分能明顯改善阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡；白楊素、高良姜素對(duì)阿霉素引起的心肌細(xì)胞凋亡有部分改善作用，但弱于蜂膠提取物可吸收成分，說明蜂膠提取物可吸收成分具有較好保護(hù)心臟作用；而藥典中作為液相檢測指標(biāo)性成分的白楊素與高良姜素的心臟保護(hù)作用弱。蜂膠對(duì)心臟的保護(hù)作用不能以白楊素、高良姜素來衡量，其保護(hù)心肌成分還來源于蜂膠其他成分。

蜂膠作為一種具有明顯保護(hù)心臟作用的天然藥物和保健食品，其有效核心成分及其保護(hù)心臟作用機(jī)制研究和功能產(chǎn)品開發(fā)具有深遠(yuǎn)意義。在整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，配合含藥血漿的體外實(shí)驗(yàn)，在探究營養(yǎng)物質(zhì)的作用機(jī)制、途徑及功效方面，是一種較好的研究方案，值得在今后的天然藥物和保健食品研究開發(fā)中推廣應(yīng)用。

[1] 瞿永華,周威,李偉,等.蜂膠提取物對(duì)小鼠肝腦組織SOD、GSH-Px、MDA影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)雜志,2013,40(5):1018-1019.

[2] Bankova V,Boudourovakrasteva G,Popov S,et al.Seasonal variations of the chemical composition of Brazilian propolis[J]．Apidologie,1998,29(4):361-367．

[3] 隋玲娟,劉義.遼西蜂膠醇提取物與槲皮素對(duì)培養(yǎng)心肌細(xì)胞過氧化損傷保護(hù)作用的比較研究[J].世界臨床藥物,2008,29(1):37-40．

[4] 馬士巧,馬海樂,潘忠禮,等.黑蜂蜂膠不同極性提取物的體外抗氧化活性[J].中國食品學(xué)報(bào),2016,16(8):53-58．

[5] 潘躍銀,徐淑萍,魏偉.尼美舒利與阿霉素聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌HepG2 細(xì)胞增殖及凋亡的影響[J].中國藥理學(xué)通報(bào),2006,22(7):884-887．

[6] 程清洲,瞿永華,周威,等.鄂西產(chǎn)蜂膠提取物的抗衰老作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33(8):662-663．

[7] 周威,程清洲,陳新,等.浙江桐廬產(chǎn)蜂膠中黃酮類化合物研究[J].中華中醫(yī)藥雜志,2013,28(2):394-397．

[8] 國家藥典委員會(huì)編.中華人民共和國藥典[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[9] 張奇峰,周威,尹美珍,等.蜂膠可吸收成分對(duì)胰島細(xì)胞的作用[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,2013,33(7):1390-1392．

[10] 賀抒,謝曉芳,張雪,等.附子水溶性生物堿對(duì)心衰細(xì)胞模型的治療作用[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2014,20(16):127-131．

[11] 張志升,楊東艷,張蕾,等.沉默CrkL對(duì)缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡和生存力的影響及其機(jī)制[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,35(11):1272-1276．

[12] 陳佳,曹智勇,何永輝,等.水飛薊素通過抑制心肌細(xì)胞凋亡減輕心肌梗死[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,36(12):1309-1313.

Research on inhibition on cardiomyocyte apoptosis by absorbable compounds of propolis and its characteristic compounds

ZHOUWei,ZHANGQi-feng,XUKai,XUHong-mei,CHENGQing-zhou

(School of Health Science and Nursing,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023,China)

To observe the effect on protection on cardiomyocyte apoptosis of mice induced by adriamycin cells by absorbable compounds of propolis and its characteristic flavonoid compounds. The rats were perfused with extract of propolis and its characteristic flavonoids: Chrysin and galangin. After 30 min, blood were collected from abdominal aorta and prepared different centrifuged plasma:extract of propolis, Chrysin and galangin. Extracted ventricular cells from suckling mice and cultivated, then prepared cell model of extract of propolis by adriamycin. Mixed different plasma: normal, extract of propolis, Chrysin and galangin with cells, then used Terminal dUTP Nick End Labeling (TUNEL) method to do detection of cardiomyocyte apoptosis. Result shows that group of extract of propolis, Chrysin and galangin can more obviously decrease the rate of cardiomyocyte apoptosis than that of model group, with statistical significance(P<0.05); the group of extract of propolis shows the best effect.Adsorbable element of propolis can significantly protect ventricular cells,and alleviate damage of ventricular cells caused by adriamycin.

Propolis; adsorbable elements; extract of propolis; Chrysin ; galangin

2017-01-10.

周威(1973-),男,副教授,博士,E-mail:491321959@qq.com.

程清洲(1966-),男,副教授,碩士,E-mail:chqz5758@sina.com.

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2015CFC844).

2095-7386(2017)01-0044-04

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.01.009

R 542.2

A