馮 如，李澤宏，袁紅慧，程水源

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

不同脅迫處理對銀杏葉片萜內(nèi)酯含量的影響

馮 如，李澤宏，袁紅慧，程水源

(武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023)

以2年生盆栽銀杏苗為研究材料，通過人工紫外、干旱及不同濃度的矮壯素、赤霉酸對銀杏葉片進行處理，探索外部脅迫對銀杏葉片中萜內(nèi)酯含量的影響。結(jié)果表明，經(jīng)紫外、干旱及不同濃度的矮壯素、赤霉酸處理，銀杏葉片中白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C和總萜內(nèi)酯含量顯著高于對照。隨著紫外處理時間的增加，萜內(nèi)酯含量先增加后減少并趨于平穩(wěn)；在干旱和赤霉酸處理條件下，萜內(nèi)酯含量呈“先增加后減少”趨勢；在矮壯素處理條件下，萜內(nèi)酯含量持續(xù)增加。多重脅迫共同對銀杏葉片萜內(nèi)酯含量的影響有待進一步研究。

銀杏；萜內(nèi)酯；脅迫

1 引言

銀杏(Ginkgo biloba)為銀杏科銀杏屬落葉喬木，是我國現(xiàn)存特有種子植物中最古老孑遺植物，具有很高藥用價值，其主要有效成分為黃酮苷和銀杏內(nèi)酯類化合物[1- 2]。銀杏萜內(nèi)酯主要包括銀杏內(nèi)酯A，B，C和白果內(nèi)酯(即GA，GB，GC，BB)，銀杏葉萜內(nèi)酯類成分是血小板活化因子(PAF)的特異性受體拮抗劑，預防血栓形成、支氣管縮小和抑制過敏反應，有對中樞神經(jīng)系統(tǒng)、缺血損傷的保護作用，被廣泛應用于臨床[3-4]。

藥用植物的藥效成分通常都是次生代謝產(chǎn)物，不少研究證實了逆境會促進這類次生代謝產(chǎn)物的增加。紫外輻射增強對植物黃酮、黃酮醇、花色苷，以及烯萜類化合物的增加有一定的影響[5]。干旱可以影響植物體次生代謝產(chǎn)物含量的變化，促進葉內(nèi)黃酮苷和萜類內(nèi)酯含量的增加[6-7]。矮壯素(chlorocholine chloride，CCC)是一種影響植物生長的調(diào)節(jié)劑，能夠有效地使植物矮化，莖稈粗壯，提高植物體次生代謝產(chǎn)物的積累。赤霉素(gibberellin)能夠促進植株生長、發(fā)芽、開花、結(jié)果，能刺激果實生長，提高結(jié)實率[8-9]。

由于銀杏中萜內(nèi)酯含量比較低，本實驗擬用紫外、干旱及不同濃度的矮壯素(CCC)、赤霉酸(GA3)對其葉片進行處理，經(jīng)過HPLC-ELSD進行萜內(nèi)酯含量分析[10-14]，探索外部環(huán)境對銀杏萜內(nèi)酯含量的影響，為在銀杏萜內(nèi)酯的生產(chǎn)應用方面提供理論依據(jù)。

2 材料

2.1 儀器

高效液相色譜儀(Agllent 1260Infinity)；蒸發(fā)光散射檢測器(Alltech)；恒溫加熱磁力攪拌器(鞏義市予華儀器有限責任公司)；電子分析天平(METTLER TOLEDO)；超純水(milli-Q)

2.2 材料與處理

2.2.1 材料

白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C標準品(均≥98%，上海源葉生物科技有限公司);銀杏葉片(武漢輕工大學種植園)，柱層析硅膠(西亞試劑)，乙醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)，甲醇(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)，四氫呋喃(色譜純，國藥集團化學試劑有限公司)，乙酸乙酯(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)，石油醚(分析純，天津市天力化學試劑有限公司)。

2.2.2 處理

(1)將3株長勢相同的銀杏苗放入掛有紫外燈密閉箱內(nèi)紫外處理，于12 h，24 h，36 h，48 h，72 h后進行采摘，每株采收5片生長良好的葉片，從葉柄基部剪去葉片立即以液氮速凍，并迅速帶回實驗室于-80 ℃冰箱中保存。

(2)將3株長勢相同的銀杏苗進行重度干旱脅迫處理(土壤相對含水量為50%左右)，于15 d，30 d，45 d后進行采摘，每株采收5片生長良好的葉片，從葉柄基部剪去葉片立即以液氮速凍，并迅速帶回實驗室于-80 ℃冰箱中保存。

(3)將CCC溶液處理設(shè)置為4個梯度濃度，即0(對照組)、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL(含有0.01%Tween20)，本實驗處理方式如下：對銀杏苗全株葉片噴施，包括葉片正反面，使全部葉片表面濕潤，每個處理組設(shè)3株重復。每個處理組于1 d，2 d，3 d，7 d后進行采摘，每株采收5片生長良好的葉片，從葉柄基部剪去葉片立即以液氮速凍，并迅速帶回實驗室于-80 ℃冰箱中保存。

(4)將GA3溶液處理設(shè)置為4個梯度濃度，即0(對照組)、0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL(含有0.01%Tween20)，本實驗處理方式如下：對銀杏苗全株葉片噴施，包括葉片正反面，使全部葉片表面濕潤，每個處理組設(shè)3株重復。每個處理組于1 d，2 d，3 d，7 d后進行采摘，每株采收5片生長良好的葉片，從葉柄基部剪去葉片立即以液氮速凍，并迅速

3 方法

3.1 色譜條件

色譜柱：Agllent C-18柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相：甲醇：四氫呋喃：水=20：8：72；流速：1 mL/min；柱溫：40 ℃；蒸發(fā)光散射檢測器檢測；漂移管溫度90 ℃；載氣為氮氣；氣體流速2.5 L/min；增閾值：4；進樣量：20μL。

3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A，銀杏內(nèi)酯B，銀杏內(nèi)酯C為1.9 mg，1.0 mg，1.0 mg，0.9 mg，加1 mL甲醇溶解，作為對照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備

稱取3份銀杏葉片(每份約3 g)，剪碎后放入圓底燒瓶內(nèi)，分別加入1/2的浸提溶液(60%乙醇水溶液，料液比為1∶150(g/mL))置于加熱磁力攪拌器中， 60 ℃加熱1 h后加入剩余部分浸提溶液并繼續(xù)加熱1 h，浸提完后趁熱過濾，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上蒸發(fā)濃縮后上硅膠柱，用洗脫劑石油醚：乙酸乙酯=1∶2(V/V)一次性洗脫，待燒瓶液體蒸干后加入2 mL甲醇充分溶解，經(jīng)HPLC-ELSD檢測內(nèi)酯含量取平均值。對照品和供試品高效液相色譜圖如圖1、圖2所示。

1-銀杏內(nèi)酯C; 2-白果內(nèi)酯;3-銀杏內(nèi)酯A ;4-銀杏內(nèi)酯B圖1 對照品高效液相色譜圖

1-銀杏內(nèi)酯C;2-白果內(nèi)酯;3-銀杏內(nèi)酯A ;4-銀杏內(nèi)酯B圖2 供試品高效液相色譜圖

3.4 線性關(guān)系考察

分別吸取對照品溶液并稀釋為0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.6 mg/mL，0.8 mg/mL，1 mg/mL，按照上述色譜條件測定，以對照品濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，做線性回歸方程，得銀杏內(nèi)酯C：y=11039x-915.77，R2=0.9991；白果內(nèi)酯BB：y=16457x-3533.3，R2=0.9990；銀杏內(nèi)酯A：y=14548x-1532.7，R2=0.9990；銀杏內(nèi)酯B：y=10657x-1063.8，R2=0.9996。結(jié)果表明：四種內(nèi)酯在0.18 mg/mL—1.9 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.5 精密度考察

精密吸取對照品溶液20μL，連續(xù)進樣5次，測定相應峰面積。結(jié)果銀杏內(nèi)酯C RSD為1.2%，白果內(nèi)酯BB RSD為1.8%，銀杏內(nèi)酯A RSD為1.4%，銀杏內(nèi)酯B RSD為1.7%，表明精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性實驗

取同一供試品溶液，分別于0，4 h，8 h，12 h，24 h，36 h，48 h注入高效液相檢測，每個供試品溶液檢測3次，取平均值并計算白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C的RSD值，分別為1.4%，0.91%，0.81%，0.87%，結(jié)果表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 重復性實驗

取同一批銀杏葉片樣品5份，按照供試品溶液制備方法制得供試品溶液，每個供試品溶液測定3次，取平均值并計算白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C的RSD值，分別為1.2%，0.44%，0.67%，0.53%，結(jié)果表明方法重復性良好。

3.8 回收率實驗

精密稱取5份已知含量的同一批銀杏葉片，按照供試品溶液制備方法制得供試品溶液，分別加稀釋成0.2 mg/mL的對照品溶液適量，每個供試品溶液測定3次，取平均值并計算對照品的平均加樣回收率，結(jié)果表明白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C加樣回收率為92.54%，98.62%，95.55%，97.31%。白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C的RSD值，分別為1.4%，0.81%，0.92%，0.87%。

4 結(jié)果與分析

4.1 紫外處理對銀杏葉片萜內(nèi)酯含量的影響

紫外對銀杏葉片GC、BB、GA、GB和總內(nèi)酯含量的影響如表1所示。從表1中可以看出白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C及總內(nèi)酯隨著紫外處理時間的增加，先增加后減少并趨于平穩(wěn)，萜內(nèi)酯在24 h和36 h之間積累量最大，總內(nèi)酯相對于對照組提高了18.92%。

表1 紫外對銀杏葉片GC、BB、GA、GB和總內(nèi)酯含量的影響

紫外/h銀杏內(nèi)酯C白果內(nèi)酯銀杏內(nèi)酯A銀杏內(nèi)酯B總內(nèi)酯0(對照)0．190．880．570．211．85120．211．010．510．282．01240．231．120．560．292．2360．221．090．520．272．1480．170．730．390．161．45720．170．720．380．181．45

4.2 干旱處理對銀杏葉片萜內(nèi)酯含量的影響

干旱對銀杏葉片GC、BB、GA、GB和總內(nèi)酯含量的影響表如表2所示。從表2中可以看出白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C及總內(nèi)酯隨著干旱處理時間的增加，先增加后減少，其變化幅度并不明顯，內(nèi)酯含量明顯高于對照組說明適當?shù)母珊的艽龠M銀杏葉萜內(nèi)酯的積累。

表2 干旱對銀杏葉片GC、BB、GA、GB和總內(nèi)酯含量的影響

干旱/d銀杏內(nèi)酯C白果內(nèi)酯銀杏內(nèi)酯A銀杏內(nèi)酯B總內(nèi)酯0(對照)0．190．880．570．211．85150．190．920．590．221．92300．221．020．630．272．14450．210．970．60．262．04

4.3 CCC處理對銀杏葉片萜內(nèi)酯含量的影響

CCC對銀杏葉片GC、BB、GA、GB和總內(nèi)酯含量的影響，如表3所示。從表3中可以看出白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C及總內(nèi)酯明顯高于對照組，且隨時間、濃度的增加呈上升趨勢。

表3 CCC對銀杏葉片GC、BB、GA、GB和總內(nèi)酯含量的影響

CCC/(mg/mL)Time/d銀杏內(nèi)酯C白果內(nèi)酯銀杏內(nèi)酯A銀杏內(nèi)酯B總內(nèi)酯0(對照)0．190．880．570．211．850．05，10．221．040．610．262．130．05，20．221．040．610．272．140．05，30．221．030．620．272．140．05，70．231．050．620．292．190．1，10．221．050．640．292．20．1，20．221．050．640．292．20．1，30．231．050．660．32．240．1，70．231．060．660．312．260．2，10．251．060．650．332．290．2，20．251．070．660．332．310．2，30．261．070．680．342．350．2，70．271．080．680．362．39

4.4 GA3處理對銀杏葉片萜內(nèi)酯含量的影響

GA3對銀杏葉片GC、BB、GA、GB和總內(nèi)酯含量的影響如表4所示。從表4中可以看出白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C及總內(nèi)酯隨GA3處理時間的增加，先增加后減少，萜內(nèi)酯在3d處積累量最大，0.04 mg/mL GA3處理后銀杏葉片中萜內(nèi)酯含量明顯高于其他兩組。

表4 GA3對銀杏葉片GC、BB、GA、GB和總內(nèi)酯含量的影響

CCC/(mg/mL)Time/d銀杏內(nèi)酯C白果內(nèi)酯銀杏內(nèi)酯A銀杏內(nèi)酯B總內(nèi)酯0(對照)0．190．880．570．211．850．02，10．190．930．610．211．940．02，20．190．930．660．232．010．02，30．190．950．680．232．050．02，70．210．960．620．242．030．04，10．230．980．630．192．030．04，20．230．990．740．172．130．04，30．250．980．710．202．140．04，70．261．010．670．222．160．06，10．190．900．570．221．880．06，20．210．920．730．192．050．06，30．221．070．580．262．130．06，70．270．880．590．302．04

5 討論

銀杏葉片中所含的萜內(nèi)酯主要是白果內(nèi)酯，銀杏內(nèi)酯A、B、C均為銀杏植物所特有的，但是由于葉中萜內(nèi)酯含量極低，提取損失較大，因此銀杏萜內(nèi)酯的藥用資源受到極大限制。本研究以紫外、干旱及不同濃度的矮壯素、赤霉酸對其葉片進行處理，探索外部環(huán)境對銀杏萜內(nèi)酯含量的影響。

本研究表明適當?shù)淖贤饷{迫能夠促進銀杏葉片萜內(nèi)酯含量的積累。而隨著紫外脅迫時間的延長，白果內(nèi)酯、銀杏內(nèi)酯A、B、C和總內(nèi)酯含量反而急劇下降并趨于平穩(wěn)，這與冷平生等的研究結(jié)果相似，光質(zhì)對銀杏萜內(nèi)酯含量有顯著影響，紫外處理下尤為突出[15]。長時間紫外處理導致萜內(nèi)酯含量減少，表明長時間紫外處理抑制了銀杏苗正常光合作用，使機體無法提供較多次生代謝產(chǎn)物前體，同時又增強了次生代謝產(chǎn)物的分解，使銀杏葉片中萜內(nèi)酯含量減少。

適度的干旱可以增加銀杏葉片中萜內(nèi)酯含量，但長時間干旱，萜內(nèi)酯含量反而有所減少。在適度的干旱脅迫下，將同一代謝途經(jīng)中相關(guān)基因結(jié)合在一起，有效隔絕了合成途徑中產(chǎn)物在細胞內(nèi)擴散，有利于酶促反應及底物與酶有效結(jié)合，減少細胞中毒傷害，從而刺激銀杏萜內(nèi)酯合成及保護銀杏苗生長發(fā)育。長時間干旱會使得銀杏光合作用受限，且植物首先盡可能進行初生代謝而不是此生代謝。本實驗組在干旱處理組中未設(shè)輕度干旱及重度干旱，對此還需進一步實驗完善。

CCC、GA3處理能顯著提高銀杏葉萜內(nèi)酯含量，有助于萜內(nèi)酯的積累。CCC、GA3處理能顯著提高銀杏光合作用，碳水化合物含量增加進而促進銀杏次生代謝產(chǎn)物的合成，使銀杏葉片中萜內(nèi)酯含量增加。許峰等實驗顯示CCC能顯著誘導銀杏內(nèi)酯合成途徑中4個關(guān)鍵酶基因的表達，暗示了除了在生理水平外，CCC在分子水平上也可以調(diào)控銀杏萜內(nèi)酯合成[16]。筆者認為經(jīng)外源GA3的噴施，抑制銀杏體內(nèi)GA3的合成，可能使合成萜內(nèi)酯的前體物質(zhì)朝銀杏萜內(nèi)酯的合成方向轉(zhuǎn)化，從而促進萜內(nèi)酯含量積累。

經(jīng)紫外、干旱及不同濃度的矮壯素、赤霉酸對銀杏葉片進行處理，銀杏葉片中萜內(nèi)酯均有不同程度積累。然而銀杏葉片中萜內(nèi)酯含量不是受單一因素的影響，經(jīng)紫外、干旱及不同濃度激素多重因素共同對銀杏葉片萜內(nèi)酯含量的影響有待進一步研究。

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The effect of different stresses on terpene lactones contents of Ginkgo biloba

FENG-Ru，LIZe-hong，YUANHong-hui，CHENGShui-yuan

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering,Wuhan Polytechnic University,Wuhan 430023 China)

The effect of external stresses on terpene lactones contents of Ginkgo biloba grown in different conditions of artificial ultraviolet,droughts,chlormequat,gillerellic acid were investigated.The results showed the contents of bilobalide BB,ginkgolide GC,GA,GB and total terpene lactones in different growing conditions of artificial ultraviolet,droughts,chlormequat,gillerellic acid were significantly increased compared with the control group.Theterpene lactones contents were increased first and then declined，at last changed to level off under artificial ultraviolet stress; the terpene lactones contents were increased first and then declined under droughts or gillerellic acid stress;the terpene lactones contents continued to increase under chlormequat stress.The effect of multiple stress on the terpene lactones contents of Ginkgo biloba is expected for further research.

Ginkgo biloba;terpene lactones;stresses

2017-01-09.

馮如(1992-)，男，碩士研究生，E-mail：799809864@qq.com.

程水源(1965-)，男，博士，E-mail：s_y_cheng@sina.com.

國家自然科學基金(31400556/C1610)；湖北省自然科學基金創(chuàng)新群體項目(2011CDA117).

2095-7386(2017)01-0034-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.01.007

Q 945.78

A