劉　碩，蔡篤程，李春林，孟　光，龍　綺，謝偉偉

(?？谑腥嗣襻t(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科， 海口 570208)

蜉蝣為一種有翅昆蟲，常見的有蜉蝣科(Ephemeridae)和四節(jié)蜉蝣科(Baetidae)。蜉蝣稚蟲水生，成蟲不取食，壽命很短，其尸體風(fēng)干后碎屑隨風(fēng)漂浮，可引起呼吸道過敏[1]。海口市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科門診在之前的工作中發(fā)現(xiàn)，海南省對蜉蝣過敏的變應(yīng)性鼻炎患者人數(shù)眾多，而目前尚未見針對蜉蝣致敏蛋白質(zhì)的研究報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)對海南四節(jié)蜉蝣變應(yīng)原蛋白質(zhì)組分進(jìn)行了分析，獲得了完整的、高清晰度的蜉蝣蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜，結(jié)合免疫印跡技術(shù)，更加直接地反映了蜉蝣的主要致敏蛋白，為獲得單一的變應(yīng)原并為其以后的標(biāo)準(zhǔn)化工作打下基礎(chǔ)。

材料與方法

標(biāo)本來源

于海南大學(xué)校內(nèi)水流邊用黑光燈誘捕蜉蝣，經(jīng)海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院教授參照文獻(xiàn)[2]鑒定后，選擇最常見的海南四節(jié)蜉蝣，-80 ℃冰箱保存。

主要試劑及儀器

固相pH梯度(immobilized pH gradient，IPG)干膠條(24 cm，pH 4～10)、丙烯酰胺、十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfonate，SDS)及相應(yīng)平衡溶液購自GE公司；二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)購自Amresco公司；尿素、硫脲購自AmershamPharmcia Biotech公司；碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)、礦物油購自BIO-RAD公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、甲叉雙丙烯酰胺、甘氨酸等購自 Sigma公司；硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜購自美國Life Science公司；ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒購自北京康為世紀(jì)公司；鼠抗人IgE抗體購自Southern公司；蜉蝣變應(yīng)原點(diǎn)刺液購自北京新華聯(lián)協(xié)和藥業(yè)有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。主要的實(shí)驗(yàn)儀器及圖像分析軟件：等電聚焦系統(tǒng)(GE ETTAN IPGPHOR3)，垂直電泳系統(tǒng)(GE ETTAN DALTsix)，雙向電泳凝膠圖像分析系統(tǒng)ImageMaster2Dplatinum5.0(GE)。

蜉蝣過敏患者血清的選擇

選擇在海口市人民醫(yī)院耳鼻咽喉科門診就診的過敏性鼻炎患者，多表現(xiàn)為反復(fù)鼻癢、噴嚏、鼻塞、清水樣鼻涕，常有流淚，耳、眼、咽癢，前鼻鏡檢查見鼻黏膜蒼白水腫，過敏性鼻炎的診斷符合“變應(yīng)性鼻炎診療綱要2008”及我國過敏性鼻炎指南的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3- 4]。蜉蝣過敏原皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)陽性(++～++++)，從中隨機(jī)選擇20例，取血清存于-80 ℃冰箱待用。

蜉蝣變應(yīng)原蛋白質(zhì)的提取

取蜉蝣約0.1～0.5 g，液氮研磨后加入裂解液{2 mol/L硫脲，7 mol/L尿素，4% 3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽}置入1.5 ml離心管，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，離心半徑為6 cm，收集上清液。對離心后的上清液進(jìn)行超聲處理，以破碎核酸，然后離心，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，離心半徑為6 cm，取上清液。將上清液分裝成約為250 μl的3管，每管再加入1 ml預(yù)冷的丙酮，-20 ℃沉淀過夜。沉淀完成后，于4 ℃，12 000 r/min離心20 min，離心半徑為6 cm，棄上清液，將得到的固體自然干燥，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

雙向電泳

IPG 膠條的水化：取1 200 μg蜉蝣總蛋白與水化液{7 mol/L 尿素，2 mol/L硫尿，4% 3-[3-(膽酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸內(nèi)鹽，1% DTT，1% IPG緩沖液，0.001%溴酚藍(lán)}混勻，上樣總體積為460 μl。從冰箱取出IPG膠條在室溫下復(fù)溫10 min。將樣品溶液加到已經(jīng)調(diào)節(jié)好水平的水化盤的樣品槽中，輕輕撕下IPG膠條的覆蓋膜，膠面朝下，酸性端朝頂端將膠條放入樣品溶液中，操作過程要避免產(chǎn)生氣泡。放好膠條后再加入1.2 ml礦物油于支持膜上保濕，室溫20 ℃，膠條水化過夜(10～12 h)。

第一向等電聚焦：開機(jī)預(yù)冷，在等電聚焦盤中加入礦物油(每條泳道加入6 ml)。取出水化好的IPG膠條，吸干膠條上殘留的礦物油，膠面朝上將膠條放入等電聚焦盤中。準(zhǔn)備濾紙墊片，每個(gè)墊片加75 μl Milli Q水潤濕，將墊片放膠面的兩端，邊緣與膠面邊緣對齊，裝上電極板，選擇膠條數(shù)量后開始運(yùn)行程序。等電聚焦儀(GE ETTAN IPGPHOR3)聚焦的條件為 500 V 1.0 h；1 000 V，1.0 h；8 000 V，3.0 h；8 000 V，2.4 h。聚焦完畢后將膠條保存于-70 ℃待用。

IPG膠條平衡：將等電聚焦后的膠條置于平衡溶液Ⅰ(6 mol/L尿素，2% SDS，0.375 mol/L Tris-HCl，20%甘油，2% DTT)中平衡10 min后立即轉(zhuǎn)入平衡溶液Ⅱ(6 mol/L尿素，2% SDS，0.375 mol/L Tris-HCl，20%甘油，135 mmol/L碘乙酰胺)中平衡10 min。將平衡后的IPG膠條在10×SDS-PAGE電泳即用緩沖液(Tris-Glycine-SDS, pH 8.8)中漂洗30 s后用于第二向電泳。

第二向垂直SDS-PAGE電泳：平衡后的膠條轉(zhuǎn)移至垂直電泳板上方，用含痕量溴酚藍(lán)0.1%的瓊脂糖封閉。凝膠采用4%的濃縮膠和12%的分離膠。電泳緩沖液為10×SDS-PAGE電泳即用緩沖液，電泳條件為16 mA 30 min，24 mA 5～6 h。

凝膠染色

電泳完畢后，凝膠置于約300 ml染色液中(0.25%考馬斯亮藍(lán) R250，45.4%甲醇，9.2%冰醋酸)，室溫，在搖床上染色至少30 min。染色完成后轉(zhuǎn)入500 ml甲醇脫色液(5%甲醇，7.5%冰醋酸)脫色4～6 h或過夜。

免疫印跡分析

參照 Western blot標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，將蛋白質(zhì)點(diǎn)轉(zhuǎn)移至NC膜，轉(zhuǎn)移條件：每塊膠200 mA，2 h；轉(zhuǎn)移完成后將NC膜置于含5%脫脂奶粉的封閉液中，4 ℃封閉過夜。棄封閉液，PBST洗膜 3次，每次10 min。加入1∶10稀釋的一抗(實(shí)驗(yàn)組用封閉液稀釋蜉蝣過敏鼻炎患者混合血清，對照組用封閉液稀釋健康者血清)，孵育2 h。PBST洗膜3次，每次10 min。再加入辣根過氧化物酶(horseradish-peroxidase,HRP)標(biāo)記的1∶4 000稀釋的羊抗人IgE二抗(用封閉液稀釋)孵育1 h。PBST洗膜3次，每次10 min。加入配制好的增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光底物液，X光片曝光，暗室顯影，定影，洗片。

圖像掃描和分析

完成考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE凝膠用Imagescaner掃描，采用圖像分析軟件Imagemasters 6.0對掃描圖像進(jìn)行強(qiáng)度校正、點(diǎn)檢測、背景消減和點(diǎn)匹配等。

結(jié)　　果

雙向電泳凝膠蛋白圖譜分析

使用圖像分析軟件對蜉蝣總蛋白雙向電泳圖譜進(jìn)行分析，在相對分子質(zhì)量為10 000～170 000和等電點(diǎn)3.0～10.0的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)約805個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)(圖1)。

蜉蝣變應(yīng)原免疫印跡圖

免疫印跡檢測結(jié)果顯示，陽性組與對照組的比對圖如下(圖2)，陽性組一抗為對蜉蝣過敏的患者血清，對照組一抗為健康者血清；經(jīng)過對比發(fā)現(xiàn)，蜉蝣特異性致敏蛋白組分約有27個(gè)點(diǎn)(圖3，紅色圓圈標(biāo)注點(diǎn))，這些點(diǎn)主要集中在等電點(diǎn)約4.5～7.5，相對分子質(zhì)量約25 000～55 000。

圖1　蜉蝣蛋白的雙向電泳圖譜(考馬斯亮藍(lán)R250染色)Fig 1　Total proteins of ephemeropterain 2-DE(coomassie-stained gel)Mr:相對分子質(zhì)量

圖2　蜉蝣變應(yīng)原免疫印跡圖譜Fig 2　Allergens of ephemeroptera in immunoblottingA:蜉蝣過敏患者血清; B:健康者血清Mr:相對分子質(zhì)量

圖3　蜉蝣特異性致敏蛋白組分Fig 3　Specific allergens of ephemeroptera圖中紅色方框表示陰性和陽性血清結(jié)果共有的斑點(diǎn)，紅色圓圈表示陽性結(jié)果中獨(dú)有的斑點(diǎn)，為蜉蝣特異性致敏蛋白組分Mr:相對分子質(zhì)量

討　　論

變應(yīng)性鼻炎是鼻腔黏膜的變應(yīng)性疾病，并可引起多種并發(fā)癥，它主要由變應(yīng)原進(jìn)入鼻腔黏膜與相應(yīng)的IgE結(jié)合而引起的一種變態(tài)反應(yīng)性疾病。隨著現(xiàn)代工業(yè)化進(jìn)展、現(xiàn)代生活方式和人類生態(tài)環(huán)境的變化，變應(yīng)性鼻炎的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查，歐洲變應(yīng)性鼻炎平均患病率約為25%[5]，中國成人變應(yīng)性鼻炎自報(bào)平均患病率則為11.4%[6]。海南省處于亞熱帶，全年氣候炎熱濕潤，花木常開，變應(yīng)性鼻炎患病率也是居高不下。在前期工作中，本研究組對蜉蝣臨床致敏情況進(jìn)行了研究[7]，在?？谑腥嗣襻t(yī)院耳鼻喉就診的500例變應(yīng)性鼻炎患者中，蜉蝣變應(yīng)原點(diǎn)刺陽性所占比例達(dá)58.6%，可見蜉蝣為海南省重要變應(yīng)原[8]。

本研究用雙向電泳技術(shù)對蜉蝣變應(yīng)原進(jìn)行分析，以探明其致敏成分。雙向電泳技術(shù)通過蛋白質(zhì)本身等電點(diǎn)和分子量之間的差異可以達(dá)到對多種蛋白質(zhì)進(jìn)行高分辨、多信息分析[9]，是蛋白質(zhì)研究當(dāng)中分辨率最高的研究方法[10]。本課題組先后采用雙向電泳技術(shù)對幾種常見變應(yīng)原進(jìn)行了分析，均取得較好的效果[11]。本實(shí)驗(yàn)首先通過雙向電泳分離了蜉蝣的總蛋白，共分離得到了805個(gè)蛋白點(diǎn)，相對分子質(zhì)量約為20 000～130 000；等電點(diǎn)主要集中在4.0～9.5，通過雙向電泳圖譜可以對蜉蝣的蛋白質(zhì)總體分布有明確的認(rèn)識。本研究中的蜉蝣變應(yīng)原蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜為國內(nèi)外首次報(bào)道。隨后應(yīng)用免疫印跡技術(shù)，分別用蜉蝣過敏患者的血清和健康者血清進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過比對得到27個(gè)特異性蛋白點(diǎn)，在圖中可以看出這些蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)主要集中在 4.5～7.5，相對分子質(zhì)量在25 000～55 000之間，與雙向電泳圖譜中高豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)分布相一致，一定程度上說明蜉蝣致敏性與蛋白質(zhì)含量相關(guān)。在后續(xù)的研究中可以對這些蛋白質(zhì)進(jìn)行測序分析，直接獲得變應(yīng)原蛋白質(zhì)的氨基酸序列，然后進(jìn)行克隆表達(dá)和純化，從而為獲得單一的變應(yīng)原并為其以后的標(biāo)準(zhǔn)化工作打下基礎(chǔ)。本課題組已經(jīng)完成對27個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的質(zhì)譜測序分析，結(jié)果將另行撰文發(fā)表。

變應(yīng)性疾病的特異性診斷依賴于標(biāo)準(zhǔn)化的變應(yīng)原制劑，而變應(yīng)原蛋白質(zhì)組分的確定可以為進(jìn)一步獲得純化過敏原打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，基于雙向電泳的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)可以對變應(yīng)原蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，有助于對致敏蛋白質(zhì)進(jìn)行純化以及標(biāo)準(zhǔn)化，并最終獲得基因工程重組的變應(yīng)原應(yīng)用于臨床實(shí)踐中。

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