孫蘭，宋春麗，楊勇，周立東

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室北京100193）

假膠素A在天然蜂膠中的不存在性研究

孫蘭，宋春麗，楊勇，周立東＊

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥用植物研究所中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用教育部重點實驗室北京100193）

本研究旨在驗證此前建立的蜂膠摻偽檢測專利技術(shù)的可靠性。方法：參照專利方法，采用Kromasil 100-5C18柱（250mm×4.6mm，5μm），以甲醇-0.5%磷酸水為流動相進行梯度洗脫，體積流量1mL·min-1，檢測波長296 nm，假膠素A為對照品，HPLC檢測已知來源的純天然蜂膠樣品[1]。結(jié)果：134種不同類型和不同產(chǎn)地的純天然蜂膠中，均未檢出假膠素A。結(jié)論：驗證了專利方法的可靠性，證明該方法可用于蜂膠摻偽檢測。

蜂膠假蜂膠楊樹膠假膠素A

蜂膠是西方蜜蜂從膠源植物的芽胞上采集樹膠，與其自身分泌物如蜂蠟等混合并轉(zhuǎn)化而成的一種膠狀固體。蜜蜂所含成分十分復(fù)雜，多達300余種[2-4]，含有高良姜素、喬松素和斛皮素等數(shù)10種黃酮類物質(zhì)[5-8]及各種萜烯類[9,10]、有機酸[11]和礦物元素等。蜂膠具有較好的抗菌[12]、抗病毒[13]、抗氧化[14]、增強免疫和輔助降血糖、降血脂[15]、抗腫瘤[16]等醫(yī)療保健功能。蜂膠對心腦血管病、癌癥、糖尿病具有較好輔助治療作用[15]。同時，蜂膠還具有消炎[17]、鎮(zhèn)痛以及促使細胞再生的能力[18]，對多種微生物感染引起的疾患，具有較好療效[19]。

由于蜂膠產(chǎn)品熱銷，市場上出現(xiàn)摻假的蜂膠，在天然蜂膠中摻雜楊樹膠，是一種常見的摻假手段。2009年媒體曾經(jīng)對假蜂膠做了系列報道，但至今尚未見到確有實效的鑒別假蜂膠的方法報道。而此前本課題組已經(jīng)利用楊樹膠中特有的標志物假膠素A建立了HPLC方法，鑒定蜂膠樣品的真?zhèn)危@得了國家發(fā)明專利[1]。

為了驗證該專利方法的可靠性，本文采用該方法對143種不同產(chǎn)地和不同類型的純天然蜂膠進行假膠素A含量測定，結(jié)果均未檢出假膠素A。驗證了專利方法的可靠性，證明該方法可用于蜂膠摻偽檢測。

1 蜂膠中假膠素A的測定

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀為Waters高效液相色譜系統(tǒng)，包括：600型泵、2996型紫外檢測器、2695型自動進樣器和Empower色譜工作站。精密天平（瑞士Mettler Toledo公司，型號：XS105）。假膠素A對照品，自制。甲醇為色譜純，其它試劑均為分析純，水為去離子重蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

譜柱為Kromasil 100-5C18柱（250mm×4.6mm，5μm），甲醇（A）-水（0.5%磷酸，B）為流動相，以體積流量1.0 mL·min-1進行梯度洗脫：0-20.0 min，50%A；20.0-24.0 min，50%-80%A；24.0-34.0 min，100%-100%A，檢測波長296 nm，柱溫25℃，進樣量5.0μL。

2.2 供試樣品溶液的制備

精密稱取蜂膠樣品約0.1 g，置于三角瓶內(nèi)，加10mL色譜甲醇，稱重。超聲提取15min/次，共3次。補重，搖勻后用0.45μm微孔濾膜過濾，得供試品溶液。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取假膠素A 1.37mg，用色譜甲醇制成質(zhì)量濃度為0.068 5mg·mL-1的對照品溶液。

2.4標準曲線的制備

從“2.3”項對照品溶液中精密吸取20、100、200、400、800μL分別置于5mL容量瓶內(nèi)，用色譜甲醇定容至刻度，按上述色譜條件進行分析，以峰面Y對進樣量X進行回歸計算，線性范圍：0.001 37-0.041 10μg，回歸方程：Y=4 029 400X-4 026.1，r=0.999 6。

2.5 精密度試驗

將“2.4”項下的含適宜濃度的對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進樣5次，測得假膠素A峰面積的RSD為2.2%。

2.6 重現(xiàn)性試驗

精密稱取蜂膠樣品約0.1 g，共5份。按“2.2”項下方法制備供試樣品，按上述色譜條件進行分析，測得假膠素A峰面積的RSD為1.2%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

將“2.4”項下的含適宜濃度的對照品溶液分別在0、2、4、8 h下按上述色譜條件下進行測定，測得假膠A峰面積的RSD為0.99%，表明假膠素A在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取蜂膠樣品約0.05 g，共5份，再取對照品溶液5份（0.065 8mg·mL-1）每份100μL分別加入置于5個10mL容量瓶內(nèi)，按“2.2”項下方法制備供試樣品，按按上述色譜條件進行分析，回收率0.99%，RSD為1.37%。

2.9 樣品的測定

精密稱取134種不同產(chǎn)地和不同類型的已知來源的純天然蜂膠樣品和已知摻假的11個蜂膠樣品各0.1 g，按“2.2”項下方法制備供試樣品溶液。按上述色譜條件進行測定，用當天的隨行對照品進行分析，對照品圖譜見圖1；純天然蜂膠樣品圖譜見圖2；摻假的蜂膠樣品圖譜見圖3，表1是純天然蜂膠樣品結(jié)果；表2是摻假的蜂膠樣品結(jié)果。

表1中134種不同產(chǎn)地不同種類天然蜂膠中假膠素A測得含量均＜0.05%。表2中11種摻假的蜂膠樣品中假膠素A測得含量≥0.05%。為了進一步驗證檢測結(jié)果的可靠性，用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法對上述步驟中初步認定的疑似摻假蜂膠中所含的疑似假膠素A的色譜峰進行了測定和復(fù)核。

圖1 假膠素A對照品色譜圖

圖2 天然蜂膠色譜圖

圖3 摻假蜂膠色譜圖

3 蜂膠中假膠素A疑似物的測試和復(fù)核

3.1 儀器與材料

儀器：Agilent Technolofies 1200 Series液相色譜儀（美國Agilent公司），配有四元泵（Agilent1200G1311A），自動進樣器（Agilent1200G1329A），柱溫箱。API3200串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀QTrap（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司AB sciex），配有Turbo Ionspray源，針泵以及Analyst1.5數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國Applied Biosystem公司），氣源為高純度氮氣。精密天平（瑞士Mettler Toledo公司，型號：XS105）。甲醇為色譜純，甲酸為分析純，水為去離子重蒸水。

表1 純天然蜂膠樣品結(jié)果

表2 摻假的蜂膠樣品結(jié)果

3.2 檢測和復(fù)核

3.2.1 色譜條件

色譜柱為Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm， 5μm），甲醇（A）-水（0.2%甲酸，B）為流動相，以體積流量0.8mL·min-1進行梯度洗脫：0-5.0min，70%A；5.0-6.0min，70%-100%A；6.0-14.0min，100%-100%A，檢測波長296 nm，柱溫25℃，進樣量5.0μL。

3.2.2質(zhì)譜條件

離子源為點噴霧電離源（ESI），噴霧電壓（IS）5 500 V，源內(nèi)氣（Gas1）30 Psi，輔助氣（Gas2）20 Psi，氣簾氣10 Psi，碰撞氣Low，去簇電壓（DP）為70 V，射入電壓（EP）為8 V，碰撞電壓（CE）為25 V，碰撞室射出電壓（CXP）為3 V，分流比1/3，檢測方式為正離子檢測，掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測（MRM）方式，用于定量分析的離子對（m/z）595.6/309.3，掃描范圍（m/z）為100-800。

3.2.3 對照品溶液的制備

精密稱取假膠素A 1.37mg，置于10mL容量瓶內(nèi)，用色譜甲醇定容至刻度。搖勻制成質(zhì)量濃度為0.137 mg·mL-1溶液，再稀釋一倍制成質(zhì)量濃度為0.034 25mg·mL-1的對照品溶液。

3.2.4 供試品溶液的制備

精密稱取摻假蜂膠樣品各約0.1 g，置于三角瓶內(nèi)，加10mL色譜甲醇，稱重。超聲提取15min/次，共3次。補重，搖勻后用0.45 nm微孔濾膜過濾后再稀釋一倍，得供試品溶液。

3.2.5 樣品的測定

摻假蜂膠樣品供試品溶液和對照品溶液各5μL（2/3溶液體積進行分流），按上述色譜和質(zhì)譜條件進行測定。色譜圖見圖4-圖6，質(zhì)譜圖見圖7-圖9。表3是摻假的蜂膠樣品結(jié)果。

圖4 假膠素A的MRM色譜圖

圖5 摻假的MRM色譜圖

圖6 天蜂膠的MRM色譜圖

圖7 假膠素A的總離子流質(zhì)譜圖（TIC）

3.2.6 蜂膠原料中假膠素A的復(fù)核討論和結(jié)果

從圖4-圖6可知假膠素A和天然蜂膠的出峰時間不同，摻假蜂膠包含有假膠素A和天然蜂膠的峰。對圖7（假膠素A）與圖8（摻假蜂膠）的總離子流質(zhì)譜圖（TIC）進行比較，結(jié)果顯示在保留時間tR=4.77min處具有相同的假膠素A結(jié)構(gòu)碎片信息；而對圖7（假膠素A）與圖9（天然蜂膠）的TIC進行比較，結(jié)果顯示在保留時間tR=4.77min處不存在相同的假膠素A結(jié)構(gòu)碎片信息，因此確定摻假蜂膠內(nèi)含假蜂膠素A，而天然蜂膠中并未檢測到假蜂膠素A。將表2和表3中SFP-1至SFP-4測定結(jié)果進行比較，可知兩種方法測定結(jié)果相同。

圖8 摻假蜂膠樣品的總離子流質(zhì)譜圖（TIC）

圖9 蜂膠樣品的總離子流質(zhì)譜圖（TIC）

表3 摻假的蜂膠樣品結(jié)果

4 小結(jié)

采用RP-HPLC法，以甲醇-0.2%磷酸水為流動相，外標法測定已知來源的純天然蜂膠中假膠素A的含量。本文研究結(jié)果表明，134種不同產(chǎn)地和不同種類的純天然蜂膠中，均未檢出假膠素A。摻假蜂膠中均檢出假膠素A。因此，驗證了上述專利方法用于蜂膠真?zhèn)舞b別的可靠性。天然蜂膠中不含假膠素A，可以利用這個化合物作為指標，判別蜂膠是否摻入楊樹膠。

1周立東,趙靜,李熠,等.一種化合物及其應(yīng)用.ZL2007101112150, 2008-01-23.

2南垚,郭伽,周立東,等.蜂膠的化學(xué)成分研究進展.世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化,2006,8(1)：61-71.

3郭伽,周立東.蜂膠的化學(xué)成分研究進展.中國養(yǎng)蜂,2000,51(2)：17-18.

4陳國有,齊鶴,徐東花.黃酮類化合物的生物活性研究進展.龍江醫(yī)藥,2008,21(3)：81-82.

5周立東,郭伽,余競光.北京蜂膠的黃酮類成分.中國中藥雜志, 1999,24(3)：162-163.

6 Markham K R.HPLC and GC-MS identification of themajor organic constituents in New Zealand propolis.Phytochemistry,1996,42(1)：205-211.

7 Usia T,Banskota A H,Tezuka Y,etal.Constituentsof Chinese propolis and theirantiproliferativeactivities.JNatProd,2002,65(5)：673-676.

8遲家平,薛秉文,陳海生.遼西蜂膠黃酮類化學(xué)成分的研究.中國藥學(xué)雜志,1996,31(5)：246-266.

9 Mastune T.Isolation and identification of cytotoxic deterpeniod isomers from propolis.ZNaturforsch,1997,52(9)：702-704.

10 Bankova V.Constituents from Brazilian geopropolis.Z Naturforsch, 1998,53(5)：402-406.

11尚天民,徐景耀.蜂膠化學(xué)成分的研究.中國養(yǎng)蜂,1984,11(4)：20-22.

12 MarcucciM C.Phen lic compounds from Brazilian p ropolis with pharmacologicalactivities.JEthnopharm,2001,74(2)：105-112.

13 Ito J,Chang FR,Wang H K,etal.Anti-AIDSagents.48.(1)anti-HIV activity of moronic acid derivatives and the new melliferone-related triterpenoid isolated from Brazilian propolis.JNat Prod,2001,64(10)：1278-1281.

14 Hayashi K.Isolation of antioxidative compounds from propolis：3,4-dihydroxy-5-prenylcinnamic anovel potent antioxidant.Chem.Pharm Bull,1999,11：1521-1524.

15陳國有,齊鶴,徐東花.黃酮類化合物的生物活性研究進展.龍江醫(yī)藥,2008,21(3)：81-82.

16 Chen C N,Wu C L,Shy H S,et al.Cytotoxic Prenyflavanones from Taiwanese propolis.JNatProd,2003,66(4)：503-506.

17 MunozO.Phenolic compoundsofpropolis from central chileanmatorral. ZNaturforsch,2001,56(7)：273-277.

18 Christov R.Antibacterial furofurans from canary islands propolis. Fitoterapia,1999,70(1)：89-92.

19 Popova M.New bioactive chalcones in propolis from El slvador.Z Naturforsch,2001,56(7)：593-596.

A Research on the Inexistence of Fraudpropolin A in Natural Propolis

Sun Lan,Song Chunli,Yang Yong,Zhou Lidong
(ChineseHerbalMedicineMaterialBaseand Resourceutilization ofkey laboratory oftheministry education, InstituteofMedicinalPlantDevelopment,Chinese Academy ofMedical Sciences& Peking Union MedicalCollege,Beijing 100193,China)

This study aimed at verifying a previous patented fraud detectionmethod of propolis.In accordancewith the patented process,the chromatographic separationwasachieved on a Kromasil 100-5C18 column(250mm×4.6mm,5μm)as mobile phrase A wasmethanol and mobile phrase B was water(0.5%phosphoric acid)at the flow rate of 1mL·min-1for gradient elution.The detection wave length was 296 nm.Fraudpropolin A was taken as the reference,while the known sources ofnatural propoliswere determined by HPLC.As a result,no fraudpropolin A was detected in the 134 sources of natural propolis at different types or from various origins.Itwas concluded that the patented process was sound in the fraud detectionmethod ofpropolis.

Propolis,fraud propolis,poplar tree gum,fraudpropolin A

10.11842/wst.2017.02.018

R28

A

（責任編輯：朱黎婷，責任譯審：朱黎婷）

2016-11-17

修回日期：2017-01-05

＊通訊作者：周立東，本刊編委，研究員，主要研究方向；天然藥物化學(xué)。